pET-28a(+)质粒说明书

pET28a-ECFPpET28a-ECFP pET 系列表达载体基本信息： 启动子:T7/lac 复制子:ColE1 ori ，F1 ori 终止子:T7 terminator 质粒分类:大肠杆菌载体；PET 系列表达质粒 原核抗性:卡那霉素Kan 克隆菌株:DH5α 培养条件:37℃，有氧，LB 表达宿主:BL21(DE3) 诱导方式:IPTG 或乳糖及其类似物 5'测序引物:T7:TAATACGACTCACTATAGGG 3'测序引物: T7-ter:TGCTAGTTATTGCTCAGCGGpET28a-ECFP 载体质粒图谱和多克隆位点信息 pET28a-ECFP 载体简介pET28a-ECFP 载体序列pET28a-ECFP 其他相关pET 系列表达载体： pProEX HTCpET-24 pProEX HTApET-23d pMBP-PpET-23c pMBP-CpET-23b pLLP-STII/Plpp-STIIpET-23 pETM-30pET22b-EBFP pET303/CT-HispET22b-EGFP pET302/NT-HispET-22b pET-52bpET-21d pET-51bpET-21b pET-50bpET-21a pET-48bpET-21 pET-47bpET-20b pET-44c pET-19bpET-44b pET-17bpET-44a 非空（BamHI-XhoI）pET-14bpET-43.1c pET-12cpET-43.1b pET-12bpET-43.1a pET-12apET-42c pET-11dpET-42b pET-11cpET-42a pET-11bpET-41c pET-5apET-41b pET-5bpET-41a pET-3dpET-39b pET-3cpET-37b pET-3bpET-35b pET-3apET-33b pTrc-CKSpET-32c pLpp-OmpApET-32b pET28a-OFP pET-32a pET28a-ECFP pET30a-EcoRV pET28a-EBFP pET-30c pProEX HTB pET-30b pET-TrxpET28a-SUMO pETM-11pET28a-EYFP pET-HispET28a-DsRed2 pET-GSTpET28a-EGFP pET-DsbApET-29c pETBlue-2pET-29b pET-40bpET-29a pET-31bpET-28c pET-30apET-28b pET28a-mCherry pET-28a pET-25bpET-27b pET-24apET-26b pET-23apET-24d pET-15bpET-24c pET-21cpET-24b pET-16bpET-11a。

pET-28b（+）载体（基本信息、图谱和多克隆位点信息、简介、序列）1.pET28a载体基本信息：质粒类型：大肠杆菌表达载体表达水平：高克隆方法：多克隆位点，限制性内切酶载体大小：5368bp5' 测序引物及序列: T7: 5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3'3' 测序引物序列: T7t: 5'-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3'载体标签: N-His, N-Thrombin, N-T7, C-His载体抗性：Kanamycin (卡那霉素)N端含有凝血酶（Thrombin）蛋白酶位切点；pET28a,b,c的差异主要存在于多克隆位点处病毒类型：非病毒2.pET28a载体质粒图谱和多克隆位点信息：3.pET28a载体简介pET-28a-c(+)载体带有一个N端的His/Thrombin/T7蛋白标签，同时含有一个可以选择的C端His标签。

pET28a载体的单一的多克隆位点见上面的环状质粒图谱。

注意：载体序列是以pBR322质粒的编码规矩进行编码的，所以T7蛋白表达区在质粒图谱上面是反向的。

T7 RNA聚合酶启动的克隆和表达区域在质粒图谱中也被标注了出来。

质粒的F1复制子是被定向的，所以在T7噬菌体聚合酶的作用下，包含有蛋白编码序列的病毒粒子能够产生，并启动蛋白表达，同时蛋白表达将被T7终止子序列(Cat. No. 69337-3)的作用下终止蛋白翻译。

3.pET28a载体简介pET-28a-c(+)载体带有一个N端的His/Thrombin/T7蛋白标签，同时N端含有凝血酶（Thrombin）蛋白酶位切点；pET28a,b,c的差异主要存在于多克隆位点处载体描述：The pET-28a-c(+) vectors carry an N-terminal His•Tag®/ thrombin/ T7•Tag® configuration plus an optional C-terminal His•Tag sequence. Unique sites are shown on the circle map. Note that the sequence is numbered by the pBR322 convention, so the T7 expression region is reversed on the circular map. The cloning/expression region of the coding strand transcribed by T7 RNA polymeraseis shown below. The f1 origin is oriented so that infection with helper phage will produce virions containingsingle-stranded DNA that corresponds to the coding strand. Therefore, single stranded sequencing should be performed using the T7 terminator primer (Cat. No. 69337-3).PET-28a-c(+) 向量进行 N-末端His•Tag® / 凝血酶/ T7•Tag® 配置再加上可选的 C-末端His•Tag 序列。

碱裂解法提取表达质粒载体pET-28a及电泳鉴定1. 实验原理可以插入核酸片段、能携带外源核酸进入宿主细胞，并在其中进行独立和稳定的自我复制的核酸分子叫载体（vector）。

细菌质粒是重组DNA技术中常用的载体。

质粒载体是在天然质粒的基础上为适应实验室操作而进行人工构建的。

与天然质粒相比，质粒载体通常带有一个或一个以上的选择性标记基因（如抗生素抗性基因）和一个人工合成的含有多个限制性内切酶识别位点的多克隆位点序列，并去掉了大部分非必需序列，使分子量尽可能减少，以便于基因工程操作。

大多质粒载体带有一些多用途的辅助序列，这些用途包括通过组织化学方法肉眼鉴定重组克隆、产生用于序列测定的单链DNA、体外转录外源DNA序列、鉴定片段的插入方向、外源基因的大量表达等。

一个理想的克隆载体大致应有下列一些特性：（1）分子量小、多拷贝、松驰控制型；（2）具有多种常用的限制性内切酶的单一位点；（3）能插入较大的外源DNA片段；（4）具有容易操作的检测表型。

常用的质粒载体大小一般在1kb至10kb之间，如PBR322、PUC系列、PGEM系列和pBluescript（简称pBS）等。

为表达蛋白质设计的载体称为表达载体(expression vector)。

pET系统是有史以来在大肠杆菌中克隆表达重组蛋白功能最强大的系统之一，有一系列类似的表达载体。

如表达载体pET28a(见图3)，含有：T7噬菌体启动子、核糖体结合位点、乳糖操纵子、乳糖阻遏子序列（lacI）、 His6标签序列、凝血酶切割位点、多克隆位点、T7噬菌体终止子及pBR322复制子、f1噬菌体复制子、卡那霉素筛选标记序列等。

pET表达系统中的受体菌为能够产生T7RNA聚合酶的大肠杆菌菌株，如BL21(DE3)。

碱变性法抽提质粒DNA主要包括收集并悬浮细菌菌体、裂解细胞、将质粒DNA与染色体DNA分开及除去蛋白质和RNA以纯化质粒DNA。

我们购买的质粒提取试剂盒的原理也是碱解法裂解细菌，再通过离心吸附柱在高盐状态下特异性地结合溶液中的DNA。

pET28a-EBFPpET28a-EBFP pET 系列表达载体基本信息： 启动子:T7/lac 复制子:ColE1 ori ，F1 ori 终止子:T7 terminator 质粒分类:大肠杆菌载体；PET 系列表达质粒 原核抗性:卡那霉素Kan 克隆菌株:DH5α 培养条件:37℃，有氧，LB 表达宿主:BL21(DE3) 诱导方式:IPTG 或乳糖及其类似物 5'测序引物:T7:TAATACGACTCACTATAGGG 3'测序引物: T7-ter:TGCTAGTTATTGCTCAGCGGpET28a-EBFP 载体质粒图谱和多克隆位点信息 pET28a-EBFP 载体简介pET28a-EBFP 载体序列pET28a-EBFP 其他相关pET 系列表达载体： pProEX HTCpET-24 pProEX HTApET-23d pMBP-PpET-23c pMBP-CpET-23b pLLP-STII/Plpp-STIIpET-23 pETM-30pET22b-EBFP pET303/CT-HispET22b-EGFP pET302/NT-HispET-22b pET-52bpET-21d pET-51bpET-21b pET-50bpET-21a pET-48bpET-21 pET-47bpET-20b pET-44c pET-19bpET-44b pET-17bpET-44a 非空（BamHI-XhoI）pET-14bpET-43.1c pET-12cpET-43.1b pET-12bpET-43.1a pET-12apET-42c pET-11dpET-42b pET-11cpET-42a pET-11bpET-41c pET-5apET-41b pET-5bpET-41a pET-3dpET-39b pET-3cpET-37b pET-3bpET-35b pET-3apET-33b pTrc-CKSpET-32c pLpp-OmpApET-32b pET28a-OFP pET-32a pET28a-ECFP pET30a-EcoRV pET28a-EBFP pET-30c pProEX HTB pET-30b pET-TrxpET28a-SUMO pETM-11pET28a-EYFP pET-HispET28a-DsRed2 pET-GSTpET28a-EGFP pET-DsbApET-29c pETBlue-2pET-29b pET-40bpET-29a pET-31bpET-28c pET-30apET-28b pET28a-mCherry pET-28a pET-25bpET-27b pET-24apET-26b pET-23apET-24d pET-15bpET-24c pET-21cpET-24b pET-16bpET-11a。

pET28a-OFPpET28a-OFP pET 系列表达载体基本信息： 启动子:T7/lac 复制子:ColE1 ori ，F1 ori 终止子:T7 terminator 质粒分类:大肠杆菌载体；PET 系列表达质粒 原核抗性:卡那霉素Kan 克隆菌株:DH5α 培养条件:37℃，有氧，LB 表达宿主:大肠杆菌 诱导方式:IPTG 或乳糖及其类似物 5'测序引物:T7:TAATACGACTCACTATAGGG 3'测序引物:T7-ter:TGCTAGTTATTGCTCAGCGG 备注: 可用GST 亲和柱纯化重组蛋白pET28a-OFP 载体质粒图谱和多克隆位点信息 pET28a-OFP 载体简介pET28a-OFP 载体序列pET28a-OFP 其他相关pET 系列表达载体： pProEX HTCpET-24 pProEX HTApET-23d pMBP-PpET-23c pMBP-CpET-23b pLLP-STII/Plpp-STIIpET-23 pETM-30pET22b-EBFP pET303/CT-HispET22b-EGFP pET302/NT-HispET-22b pET-52bpET-21d pET-51bpET-21b pET-50bpET-21a pET-48bpET-21 pET-47b pET-20bpET-44c pET-19bpET-44b pET-17bpET-44a 非空（BamHI-XhoI）pET-14bpET-43.1c pET-12cpET-43.1b pET-12bpET-43.1a pET-12apET-42c pET-11dpET-42b pET-11cpET-42a pET-11bpET-41c pET-5apET-41b pET-5bpET-41a pET-3dpET-39b pET-3cpET-37b pET-3bpET-35b pET-3apET-33b pTrc-CKSpET-32c pLpp-OmpApET-32b pET28a-OFP pET-32a pET28a-ECFP pET30a-EcoRV pET28a-EBFP pET-30c pProEX HTB pET-30b pET-TrxpET28a-SUMO pETM-11pET28a-EYFP pET-HispET28a-DsRed2 pET-GSTpET28a-EGFP pET-DsbApET-29c pETBlue-2pET-29b pET-40bpET-29a pET-31bpET-28c pET-30apET-28b pET28a-mCherry pET-28a pET-25bpET-27b pET-24apET-26b pET-23apET-24d pET-15bpET-24c pET-21cpET-24b pET-16bpET-11a。

重组pET28α-X基因构建与表达一、 DNA的连接1、原理本实验将表达载体和PCR产物X进行双酶切，经琼脂糖凝胶后，割胶分离纯化的目的基因和线性化质粒，用T4DNA连接酶连接成表达融合蛋白的重组质粒。

（1）灭菌双蒸水（2）DNA：双酶切后的基因片段及线性质粒（3）T4DNA连接酶：350U/μL（4）10×连接酶缓冲液：660mmol/L Tris-HCl(pH7.6)66 mmol/L MgCl2100 mmol/L DTT1mmol/L ATP2、方法（1）5mL离心管中加入以下成分：ddH2O 12μLX-DNA 3μLpET28a-DNA 2μL10×Buffer 2μLT4 ligase 1μL（2）14-16℃水浴中过夜。

（3）65℃水浴10min，灭活连接酶。

二、大肠杆菌感受态细胞的制备及转化1、原理经氯化钙处理的大肠杆菌，受短暂的热激后，可形成易于接受环状质粒DNA的感受态细胞。

由于不同的质粒可带有不同的抗生素抗性基因，应根据转化菌的耐药特性进行筛选。

2、材料（1） LB培养基：10g胰蛋白胨，5g酵母粉，5gNaCl加水至950mL，用1mol/L NaOH调节pH至7.0，定容至1000mL，高压灭菌。

（2）LK培养基：在LB培养基中加入终浓度50μg/mL的卡那霉素。

（3）LK平皿：1.5g琼脂，100mL LB培养基，高压灭菌，待其降温至55℃时，加卡那霉素至50μg/mL，倾倒平皿，置室温一天，使水分吸收，4℃保存。

（4）100mmol/L CaCl2,用双蒸水配制，高压灭菌，4℃保存。

3、小量制备大肠杆菌感受态细胞（1）接种大肠杆菌DH5α和BL21单菌落于2mL LB培养基，37℃振荡培养过夜。

（2）转种1 mL过夜培养菌液于20mL LB培养基中。

（3）37℃培养至细菌密度OD600为0.4（约2.5h）。

（4）取1 mL菌液至1.5 mL离心管，4000rpm，2min,弃上清液。

重组pET28α-X基因构建与表达一、 DNA的连接1、原理本实验将表达载体和PCR产物X进行双酶切，经琼脂糖凝胶后，割胶分离纯化的目的基因和线性化质粒，用T4DNA连接酶连接成表达融合蛋白的重组质粒。

（1）灭菌双蒸水（2）DNA：双酶切后的基因片段及线性质粒（3）T4DNA连接酶：350U/μL（4）10×连接酶缓冲液：660mmol/L Tris-HCl(pH7.6)66 mmol/L MgCl2100 mmol/L DTT1mmol/L ATP2、方法（1）5mL离心管中加入以下成分：ddH2O 12μLX-DNA 3μLpET28a-DNA 2μL10×Buffer 2μLT4 ligase 1μL（2）14-16℃水浴中过夜。

（3）65℃水浴10min，灭活连接酶。

二、大肠杆菌感受态细胞的制备及转化1、原理经氯化钙处理的大肠杆菌，受短暂的热激后，可形成易于接受环状质粒DNA的感受态细胞。

由于不同的质粒可带有不同的抗生素抗性基因，应根据转化菌的耐药特性进行筛选。

2、材料（1） LB培养基：10g胰蛋白胨，5g酵母粉，5gNaCl加水至950mL，用1mol/L NaOH调节pH至7.0，定容至1000mL，高压灭菌。

（2）LK培养基：在LB培养基中加入终浓度50μg/mL的卡那霉素。

（3）LK平皿：1.5g琼脂，100mL LB培养基，高压灭菌，待其降温至55℃时，加卡那霉素至50μg/mL，倾倒平皿，置室温一天，使水分吸收，4℃保存。

（4）100mmol/L CaCl2,用双蒸水配制，高压灭菌，4℃保存。

3、小量制备大肠杆菌感受态细胞（1）接种大肠杆菌DH5α和BL21单菌落于2mL LB培养基，37℃振荡培养过夜。

（2）转种1 mL过夜培养菌液于20mL LB培养基中。

（3）37℃培养至细菌密度OD600为0.4（约2.5h）。

（4）取1 mL菌液至1.5 mL离心管，4000rpm，2min,弃上清液。

pET-28a(+)质粒载体说明书-pet-28a.
1、增加收菌次数,相对提高了质粒的量5261,这样的话裂解液的量可以适当增加。

2、裂解要充分,变性和复性按说明应该是不超过5分钟,合理控制时间,一般在3分到4分半的时4102间都是可以的。

3、过柱子时,吸附的时间尽量长一些,可以在这期间做做其他实验或者吃个饭什么的。

4、如果没有必要,不使用去蛋白液,因为每过一遍柱子,其损耗越大1653,不过这得根据说明的菌种而定；
4、最后洗脱回收的时候,要单方面提高浓度,就要适当减少洗脱液的量,我一般都是回收到40~50μL的,同时要增加洗专脱次数,一般两三次足矣。

陕西农业科学2020,66(05)：62-65Shaanxi Journai of Agriculturai Sciences蜂毒前溶血肽原重组质粒pET-28a(+) -PPMet的构建及分析郭新军(西安文理学院生物与环境工程学院，陕西西安710065)摘要：为了探讨利用基因工程技术生产蜂毒肽的方法，对重组质粒pGEXBTB/PPMet中的蜂毒前溶血肽原基因进行了更换载体处理，并重新构建了蜂毒前溶血肽原重组质粒pET-28a(+)-PPMet,为进一步转化大肠杆菌感受态细胞并进行蜂毒前溶血肽原基因的表达提供了材料。

相关序列的生物信息学分析表明，新的重组质粒可表达含有106个氨基酸残基的融合蛋白，其中包括His标签。

该融合蛋白没有信号肽序列，但存在跨膜区域，其在大肠杆菌中的表达需进一步探讨。

关键词：蜂毒前溶血肽原；蜂毒肽;pET-28a(+);重组质粒作为蜂毒的主要活性成分之一&1'，蜂毒肽(MelitUn)在蜜蜂体内是由其前体——蜂毒溶血肽原(Promelittin)水解而成的[2],而蜂毒溶血肽原是蜂毒前溶血肽原(Prepromelittin)加工后的产物。

蜂毒前溶血肽原包括70个氨基酸残基,由信号肽(第1至第21氨基酸残基)、低复杂性区域(第22至第43氨基酸残基)和蜂毒肽结构域(第44至第69氨基酸残基)等构成⑶%利用基因工程技术生产蜂毒肽被看作一条有效获得蜂毒肽的途径，具有一定应用前景％前期我们构建了蜂毒前溶血肽原与GST融合表达重组质粒pGEX-4TB/PPMe-,并在大肠杆菌BL21感受态细胞中诱导表达，成功获得了目的融合蛋白％但由于GST标签自身相对分子质量较大，而目的蛋白又非常小，对目的片段的纯化等可能会有较大影响。

笔者研究考虑到蜂毒前溶血肽原自身具有较大的溶解度,对细胞膜的破坏能力较低，尝试使用分子量较小的Hm标签，将改造后的蜂毒前溶血肽原基因由重组质粒pGEX-4TB/PPMe-重构到pET-28a(+)载体上，构建了pET-28a(+)-PPMS重组质粒,并对其进行生物信息学方面分析,为探讨其在原核细胞中的表达提供基础％1材料和方法1.1实验材料与主要试剂实验室前期对蜂毒前溶血肽原基因进行了改并合成后的,原与GST融合表达重组质粒pGEX-4T-1/PPMey 相关材料保存于本实验室％实验所用pET-28a(+)表达载体、大肠杆菌(E.coli)TOP10感受态细胞及T4DNA连接酶、限制性内切酶EccRI和Sall等分子生物学试剂均由生工生物工程(上海)股份有限公司提供％1.2实验方法1.2.1蜂毒前溶血肽原基因载体更换利用限制性内切酶EccRI和Sall对原构建的重组质粒pGEX-4T-1/PPMe-进行双酶切，同时利用限制性内切酶EccRI和Sall对载体pET-28a(+)进行双酶切％各酶切体系(50!L)中均包含反应模板4 !g,10xFD Buffer5!L,SalI1!(10U-咽“), EccRI1!(10U-咽"),ddH2O39咽。

pET-28a(+) 质粒说明书
产品信息：
货号名称产品形式规格储存VT0331-01 pET-28a(+) Plasmid 液体质粒20μl-20℃
使用说明：
淼灵质粒平台的各批次质粒菌株发货前均经过严格的多重验证，如存在质量问题，请在收到产品三个月内通知我司，收到质粒后请短暂离心，取1μl转化至对应感受态中，挑取单克隆重新提取质粒后使用。

基本信息：
启动子：T7/lac
复制子：pBR322 ori，F1 ori
终止子：T7 terminator
质粒分类：大肠杆菌载体；蛋白表达质粒
质粒大小：5369bp
质粒大小：N-6*His, N-Thrombin, N-T7, C-6×His
原核抗性：卡那霉素Kanamycin
克隆菌株：DH5α等大肠杆菌
培养条件：37℃，有氧，LB
表达宿主：BL21 (DE3) 等含DE3的大肠杆菌
培养条件：37℃，有氧，LB
诱导方式：IPTG或乳糖及其类似物
5' 测序引物：T7：TAA TACGACTCACTA TAGGG
3' 测序引物：T7-Ter：GCTAGTTA TTGCTCAGCGG
备注：可用镍柱来纯化带组氨酸的融合蛋白。

质粒简介：
质粒图谱：。