===LentiCRISPRv2构建说明书

LentiCRISPRV2载体使用说明
一载体简要说明
1 克隆gDNA使用BsmBI酶切位点，载体可以切出1.9kb的filter，便于确定载体酶切成功，并且利于胶回收。

2 BsmBI酶切位点如图酶切后不需要用CIP脱磷，也不会自连。

3在cas9的C端有FLAG，可以WB或Immunostaining来检测。

4 EFS被优化的小而强，方便慢病毒的包装，极大的提高了慢病毒包装的效率。

5 优化的内部核糖体插入位点P2A，可以在只有EFS启动的情况下独立表达puromycin来筛选转染或感染成功的细胞。

二 gDNA设计说明
对于lentiCRISPR V2克隆，其合成的oligo末端与px330不同如下图所示：
具体举例如下：一定注意oligo的方向，载体的hU6的下游正义链一定是基因组序列的有义链，否则编辑无效,且5’端必须第一个碱基必须是G如果不是G也要认为加一个G满足U6启动子的需求。

将引物稀释 100uM 后，再 10 倍稀释
退火
50ul 体系
引物 20ul（上下游各 10ul）、
水 25ul、
NEB buffer 2（10*）5ul 95℃，5min。

然后关闭 PCR 仪，自然降温 40min。

LentiCRISPR V2 载体酶切
200ul体系：
BsmBI 2ul；
10*buffer 20ul；
质粒 10ul（2ug）
水 16ul 55℃，酶切 2 小时胶回收
连接
2*solutionI 5ul
退火引物 4.5ul
线性化载体 0.5ul 16℃连接过夜，转化挑菌送测序。

1.IDENTIFICATION OF THE SUBSTRANCE/PREPARATION AND THECOMPANY/UNDERTAKINGPOSITION/INFORMATION ON INGREDIENTS3.HAZARDS IDENTIFICATIONMaterial Safety Data SheetRevision Date:February 23,2018Product code LT005,LT006Product name Lenti-Pac™HIV qRT-PCR Titration KitsContact manufacturer GeneCopoeia,Inc.9620Medical Center Drive,Suite 101Rockville,MD 20850USAPhone:301-762-0888Toll free:1-866-360-9531Fax:301-762-3888Chemical Name CAS-No Weight %Phenol108-95-230-60Guanidine isothiocyanate 593-84-015-40Ammonium thiocyanate 1762-95-47-13Glycerol56-81-540-70Contact with acids or bleach liberates toxic gases.DO NOT ADD acids or bleach to any liquid wastes containing this product.We recommend handling all chemicals with caution.GHS –Classification Signal Word DANGERHealth HazardsAcute oral toxicity Category 4Acute dermal toxicityCategory 4Acute Inhalation Toxicity -Vapors Category 4Skin corrosion/irritationCategory 1B Serious eye damage/eye irritationCategory 1Specific target organ systemic toxicity (single exposure)Category 3Specific target organ systemic toxicity(repeated exposure)Category3Mutagenicity Mutagenic category2Physical hazardsNot hazardousHazard StatementsH314-Causes severe skin burns and eye damageH341-Suspected of causing genetic defectsH373-May cause damage to organs through prolonged or repeated exposureH412-Harmful to aquatic life with long lasting effectsH302-Harmful if swallowedH312-Harmful in contact with skinH332-Harmful if inhaledH335-May cause respiratory irritationPrecautionary StatementsP301+P312-IF SWALLOWED:Call a POISON CENTER or doctor/physician if you feel unwellP304+P340-IF INHALED:Remove victim to fresh air and keep at rest in a position comfortable for breathingP301+P330+P331-IF SWALLOWED:rinse mouth.Do NOT induce vomitingP303+P361+P353-IF ON SKIN(or hair):Remove/Take off immediately all contaminated clothing.Rinse skin withwater/showerP305+P351+P338-IF IN EYES:Rinse cautiously with water for several minutes.Remove contact lenses,if present and easy to do.Continue rinsingP310-Immediately call a POISON CENTER or doctor/physicianP308+P313-IF exposed or concerned:Get medical advice/attentionP273-Avoid release to the environmentP280-Wear protective gloves/protective clothing/eye protection/face protectionPrinciple Routes of ExposurePotential Health EffectsEyes Causes burns.Risk of serious damage to eyes.Corrosive to the eyesand may cause severe damage including blindness.Skin Causes burns.Possible risk of irreversible effects.Harmful in contactwith skin.Irritating to skin and mucous membranes.Inhalation Harmful by inhalation.Ingestion Harmful if swallowed.Ingestion causes burns of the upper digestive andrespiratory tracts.Ingestion may cause gastrointestinal irritation,nausea,vomiting and diarrhea.Specific effectsCarcinogenic effects Phenol has been classified by the International Agency for Research onCancer(IARC)as not classifiable as to carcinogenicity to humans(Group3).Mutagenic effects Not ApplicableReproductive toxicity Not ApplicableSensitization Not ApplicableTarget Organ Effects SkinLungsLiverSpleenKidney4.FIRST AID MEASURES5.FIRE-FIGHTING MEASURES6.ACCIDENTAL RELEASE MEASURES7.HANDLING AND STORAGEHMISHealth 3*Chronic HazardFlammability 1ReactivitySkin contact Wash off immediately with soap and plenty of water while removing all contaminated clothes and shoes.Call a physician immediately.Eye contactIF IN EYES:Rinse cautiously with water for several minutes.Remove contact lenses,if present and easy to do.Continue rinsing.Rinseimmediately with plenty of water,also under the eyelids,for at least 15minutes.Call a physician immediately.Ingestion Call a physician or poison control center immediately.Rinse mouth.Do not induce vomiting without medical advice.Never give anything by mouth to an unconscious person.InhalationRemove to fresh air.Call a physician or poison control center immediately.Notes to physicianTreat symptomatically.Suitable extinguishing media Dry chemical.Carbon dioxide (CO2).Water spray.Foam.Special protective equipment for firefightersWear self-contained breathing apparatus and protective suit.Australia HazChem Code2XPersonal precautionsELIMINATE all ignition sources (no smoking,flares,sparks or flames in immediate area).Use personal protection equipment.Avoid contact with skin,eyes or clothing.Ensure adequate ventilation.Keep people away from and upwind of spill/leak.Evacuate personnel to safe areas.Methods for cleaning upPrevent product from entering drains.Soak up with inert absorbentmaterial.Neutralize spill with slaked lime,sodium bicarbonate or crushed limestone.Collect powdered material and deposit in sealed containers and dispose of phenol as hazardous waste.Isolate area and deny entry.Environmental precautionsPrevent further leakage or spillage if safe to do so.Prevent product from entering drains.Do not allow material to contaminate ground water system.See Section 12for more information8.EXPOSURE CONTROLS /PERSONAL PROTECTIONHandling Always wear recommended Personal Protective Equipment.Avoid contact with skin,eyes or clothing.Remove all sources of ignition.StorageKeep containers tightly closed in a cool,well-ventilated place.Keep away from heat,sparks,flame and other sources of ignition (i.e.,pilot lights,electric motors and static electricity).Protect from sunlight.Exposure limitsChemical name OSHA PELOSHA PEL (Ceiling)ACGIH OEL (TWA)ACGIH OEL (STEL)Phenol5ppm 19mg/m 3None 5ppm None Guanidine isothiocyanate None None None None Ammonium thiocyanate 5mg/m 3None None None Glycerol15mg/m 3None10mg/m 3NoneEngineering measures Use in a chemical fume hoodPersonal protective equipmentPersonal Protective Equipment requirements are dependent on the user institution's risk assessment and are specific to the risk assessment for each laboratory where this material may be used.Respiratory protection In case of insufficient ventilation wear suitable respiratory equipment RespiratorUp to 50ppmRecommendations,National Institute of Occupational Safety and Health,U.S.(APF =10)Any air-purifying half-mask respirator with organic vaporcartridge(s)in combination with an N95,R95,or P95filter.The following filters may also be used:N99,R99,P99,N100,R100,P100.(APF =10)Any supplied-air respirator Up to 125ppm:(APF =25)Any supplied-air respirator operated in a continuous-flow mode.(APF =25)Any powered air-purifying respirator with an organic vapor cartridge in combination with a high-efficiency particulate filter.Up to 250ppm:(APF =50)Any air-purifying full-facepiece respirator equipped with organic vapor cartridge(s)in combination with an N100,R100,or P100filter.(APF =50)Any air-purifying,full-facepiece respirator (gas mask)with a chin-style,front-or back-mounted organic vapor canister having an N100,R100,or P100filter.(APF =50)Any powered,air-purifying respirator with a tight-fitting facepiece and organic vapor cartridge(s)in combination with a high-efficiency particulate filter.(APF =50)Any self-contained breathing apparatus with a full facepiece.(APF =50)Any supplied-air respirator with a full facepiece.Emergency or planned entry into unknown concentrations or IDLH conditions:(APF =10,000)Any self-contained breathing apparatus that has a full facepiece and is operated in a pressure-demand or other positive-pressure mode.9.PHYSICAL AND CHEMICAL PROPERTIES10.STABILITY AND REACTIVITY11.TOXICOLOGICAL INFORMATION(APF =10,000)Any supplied-air respirator that has a full facepiece and is operated in a pressure-demand or other positive-pressure mode in combination with an auxiliary self-contained positive-pressure breathing apparatus.Escape:(APF =50)Any air-purifying,full-facepiece respirator (gas mask)with a chin-style,front-or back-mounted organic vapor canister having an N100,R100,or P100filter./Any appropriate escape-type,self-contained breathing apparatus.Hand protectionImpervious gloves.S24-Avoid contact with skin.S36-Wear suitable protective clothing.Eye protectionTight sealing safety goggles.Skin and body protection Impervious clothing.Hygiene measuresContaminated work clothing should not be allowed out of the workplace.Avoid contact with skin,eyes or clothing.Handle in accordance with good industrial hygiene and safety practice.Environmental exposure ControlsPrevent product from entering drains.General information FormLiquid.Appearance Red,maroon.OdorMedicinal,sweet,tar-like.Boiling point/range °C No data available °F No data available Melting point/range °C No data available °F No data available Flash point°C No data available °F No data available Autoignition temperature °C No data available °F No data availableOxidizing properties No information available Water solubilitySolubleStabilityStable under normal conditions.Materials to avoidStrong oxidizing agents.Strong acids.Isocyanates.Heat.Nitriles,Nitrides.Alkaline earth metals.Strong oxidizers,alkali metals and alkaline earth metals may cause fires or explosions.Hazardous decomposition Toxic gas.Sulphur oxides.Hydrogen cyanide (hydrocyanic acid).Carbon oxides,ProductsNitrogen Oxides.PolymerizationHazardous polymerization does not occur.Acute toxicityChemical name LD50(oral,rat/mouse)LD50(dermal,rat/rabbit)LC50(inhalation,rat/mouse)Phenol=317mg/kg (Rat)No data available =316mg/m3(Rat)Guanidine isothiocyanate571mg/kg2000mg/kg5.319mg/L (4H)12.ECOLOGICAL INFORMATIONAmmonium thiocyanate =500mg/kg (Rat)No data available No data available Glycerol =12600mg/kg (Rat)No data available No data availablePrinciple Routes of Exposure Potential Health Effects Eyes Causes burns.Risk of serious damage to eyes Corrosive to the eyes and may cause severe damage including blindness.Skin Causes burns.Possible risk of irreversible effects Harmful in contact with skin.Irritating to skin and mucous membranes.Inhalation Harmful by inhalationIngestionHarmful if swallowed Ingestion causes burns of the upper digestive and respiratory tracts Ingestion may cause gastrointestinal irritation,nausea,vomiting and diarrheaCarcinogenic effects Phenol has been classified by the International Agency for Research on Cancer (IARC)as not classifiable as to carcinogenicity to humans (Group 3).Mutagenic effects No information available.Reproductive toxicity No information available.SensitizationNo information available.Target organ effectsSkin.Lungs.Liver.Spleen.Kidney.EcotoxicityHarmful to aquatic organisms,may cause long-term adverse effects in the aquatic environment.Chronic aquatic toxicity Category 3MobilitySee log PowBiodegradation Inherently biodegradable Bioaccumulation No information availableChemical name Freshwater algae data Water flea data Freshwater fish species dataMicrotox dataLog Pow PhenolDesmodesmusDaphnia magna =316mg/m3(Rat)logPow1.subspicatus EC50187EC5047-279mg/L (72h) 4.24-10.7mg/L Pseudokirchneriella (48subcapitata EC50h)Daphnia 46.42mg/L (96h)magnaEC5010.2-15.5mg/L (48h)13.DISPOSAL CONSIDERATIONS14.TRANSPORT INFORMATION15.REGULATARY INFORMATIONGlycerolDaphnia magna EC50>500mg/L (24h)logPow1.76Dispose of contents/containers in accordance with local regulations.IATAProper shipping name Corrosive liquid,n.o.s.(guanidine thiocyanate-phenol solution).Hazard Class 8Subsidiary class None Packing group II UN-No 1760ERG Code153ComponentTSCA Phenol,108-95-2(30-60)Listed Guanidine isothiocyanate,593-84-0(15-40)Listed Ammonium thiocyanate 1762-95-4(7-13)Listed Glycerol,56-81-5(40-70)ListedUS Federal Regulations SARA 313This product contains the following toxic chemical(s)subject to the notification requirements of section 313of Title III of the Superfund Amendments and Reauthorization Act of 1986.This law requires certain manufacturers to report on annual emissions of specified chemicals and chemical categories.Please note that if you repackage,or otherwise redistribute,this product to industrial customers,a notice similar to this one should be sent to those customers:Chemical name CAS-No.Weight %SARA 313-Threshold values Phenol108-95-230-60 1.0Ammonium thiocyanate1762-95-47-131.0Clean Air Act,Section 112Hazardous Air Pollutants (HAPs)(see 40CFR 61)This product contains the following HAPs:Component CAS-No.Weight %HAPS data Phenol108-95-230-60PresentAmmonium thiocyanate1762-95-47-13Present (XCN where X=H or any16.OTHER INFORMATIONother group where a formal dissociation may occur.For example KCN or Ca[CN]2)US state regulations Chemical name Massachusetts -RTK New Jersey-RTK Pennsylvania-RTK Illinois-RTK Rhode Island-RTK PhenolListed Listed Listed Listed Listed Guanidine isothiocyanate -----Ammonium thiocyanate Listed -Listed Listed Listed GlycerolListed-Listed-ListedCalifornia Proposition 65This product does not contain any Proposition 65chemicals.WHMIS Hazard Class D1A -Very toxic materials E -Corrosive materialThis product has been classified in accordance with the hazard criteria of the Controlled Products Regulations (CPR)and the MSDS contains all the information required by the CPR.Reason for revision Not Applicable.SDS sections updated.For research use only."The above information was acquired by diligent search and/or investigation and the recommendations are based on prudent application of professional judgment.The information shall not be taken as being all inclusive and is to be used only as a guide.All materials and mixtures may present unknown hazards and should be used withcaution.Since the Company cannot control the actual methods,volumes,or conditions of use,the Company shall not be held liable for any damages or losses resulting from the handling or from contact with the product as described herein.THE INFORMATION IN THIS SDS DOES NOT CONSTITUTE A WARRENTY,EXPRESSED OR IMPLIED,INCLUDING ANY IMPLIED WARRANTY OF MERCHANTABILITY OR FITNESS FOR ANY PARTICULAR PUPOSE"End of Safety Data Sheet。

CRISPR/Cas9系统操作说明-2 ---基于lentiCRISPR v2应用指南-载体构建和建系汉恒生物提供CRISPR/Cas9载体的快速构建试剂盒，同时也提供各种载体构建和病毒包装（慢病毒、腺病毒和AAV）、建系服务lentiCRISPR v2载体是张锋实验室发布一个慢病毒载体，cas9和sgRNA 表达框在同一各载体上。

而且Cas9的C 端带有FLAG 融合标签，载体包含Puromycin 抗性基因，适合建系。

验证sgRNA 活性的时候也适合顺转；包装成慢病毒适合常规细胞系的建系。

构建非常方便。

说明lentiCRISPR v2https:///52961/☐克隆gDNA 使用BsmBI 位点，载体可以切出一个~1.9 kb 的filler 片段，便于confirm 酶切成功并利于载体回收；☐BsmBI 的位点是，酶切之后不需要CIP 脱磷也不会自连！☐Cas9的COOH 端带有FLAG tag,可以WB 或者Immunostaining；☐EFS promoter 被优化的小而强，极大提高了慢病毒包装的效率；☐载体带有Puromycin 抗性，可以富集转染/感染成功的细胞。

☐gDNA 设计方法和原则请参考上第一篇“CRISPR/Cas9系统操作说明”，链接如下：☐对于lentiCRISPR v2克隆，其合成的oligo 末端和pX330不同，请注意设计；☐怕大家看不懂，举个例子说明（克隆小白千万注意oligo 的方向）：gDNA 设计说明载体克隆说明☐Backbone的酶切体系同上一篇文章（说明：不脱磷处理参考黑框，脱磷参考红框内操作）；☐Oligo的退火条件也参考上一篇文章（说明：如果载体不脱磷，oligo不需要磷酸化；载体脱磷参考红框内操作，oligo就需要加磷处理！！！（红色框内是FengZhang提供的protocol，设计脱磷，可以参考））仅作参考病毒包装体系☐包装病毒使用的包装体系如下（for 100 mm dish ，6x106293T ）☐转染条件：用细胞转染试剂lipofiter （超便宜且好用）（汉恒生物，/cn/products/item/36，（或者lipo2000）DNA/lipofiter=1 μg ：2.5 μl☐收集48hr 和72hr 病毒上清，待用。

一、简介慢病毒（Lentivirus）载体是以HIV-1（人类免疫缺陷I型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体。

区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。

慢病毒载体的研究发展得很快,研究的也非常深入。

该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上,从而达到持久性表达.二、实验流程（大致的简单过程）慢病毒表达载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。

慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装RNA 到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。

为产生高滴度的病毒颗粒，需要利用表达载体（自己构建）和包装质粒（购入）同时共转染细胞，在293T 细胞(购入)中进行病毒的包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，离心取得上清液后，可以直接用于宿主细胞的感染，目的基因进入到宿主细胞之后，经过反转录，整合到基因组,从而高水平的表达效应分子.大致的实验流程：1. 根据目的基因相关信息（序列,序列号等），构建含有外源基因或siRNA的重组载体；（即质粒构建，已构建好，质粒可以永久保存）2. 对于测序正确的重组质粒，提取和纯化高质量的不含内毒素的重组质粒；3. 使用高效重组载体和病毒包装质粒（购入）共转染293T 细胞[1]，进行病毒包装和生产，收集病毒液；4. 浓缩、纯化病毒液；5. 用高质量的病毒液感染细胞(293T细胞)；6。

通过定量PCR精确测定病毒滴度（高精确滴定方法）和Western 分析实验结果；7。

用高质量的病毒液感染宿主细胞；检测基因功能或者siRNA的沉默效率以及使用药物进行稳定转染细胞株的筛选，通常状况下，筛选的细胞克隆株具有长期的表达稳定性.病毒液足够用于一般的动物活体实验。

三、重组质粒构建流程1.基因的获得：shRNA寡核苷酸序列的设计和合成（将正确序列克隆入载体中,退火形成双链，PCR扩增）2。

回收A．酶切产物的胶回收：一般做50-100ul 体系,然后跑电泳回收，回收量一般为30ul. B．PCR扩增产物的胶回收原理：首先利用低熔点琼脂糖凝胶电泳DNA片段，分离目的条带DNA，然后紫外光下切割含目的DNA条带的胶块，利用胶回收试剂盒回收纯化DNA片段。

二代测序DNA文库构建概述杂交捕获流程➢探针根据感兴趣的目标序列设计➢探针与目标序列互补，因而可进行特异性杂交➢实验的关键是探针和基因组DNA或cDNA的杂交，其特异性决定了靶向富集的效率检测变异类型：•Single nucleotide polymorphism (SNP) •Insertion/deletion (indel)•Copy number variation (CNV)•Gene Fusion二代测序文库构建流程DNA 样品*片段化核心步骤：➢末端修复➢加A尾➢接头连接*文库扩增文库产出测序文库构建概述（Illumina平台）Y 形测序接头原始DNA片段化DNA接头连接PCR 扩增DNA 插入片段文库构建步骤概述DNA 样本投入DNA片段化片段末端补平&加“A”尾测序接头连接片段大小筛选（可选）PCR文库富集DNA 文库产出建库时需要加入多少的DNA量呢？需要根据实际的应用及样本情况进行选择优化如何对DNA进行片段化？1、物理打断：通常使用超声来打断，如Covaris2、酶切打断：如KapaHyperplus文库构建试剂盒DNA片段末端补平、5`端磷酸化、3`端加“A”尾补平及磷酸化末端加“A”尾测序接头与DNA片段的连接通过磁珠纯化、文库片段大小选择（可选步骤）通过调节结合buffer的浓度，实现磁珠选择吸附不同大小的片段对两端都加上接头的文库通过PCR扩增？Primer 1Primer 2AA最终得到的文库起始DNA片段最终文库。

基因编辑技术CRISPR的使用方法与使用技巧在分子生物学领域中，基因编辑技术CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）是一种引发革命性变革的先进技术。

CRISPR技术使用Cas9酶（CRISPR associated protein 9）来定位和剪切基因组中的特定DNA序列，从而实现对基因的精准编辑。

本文将介绍CRISPR技术的使用方法以及使用时需注意的技巧。

首先，使用CRISPR技术的第一步是设计合适的RNA引导序列（gRNA）。

gRNA是由CRISPR-Cas9复合物识别DNA靶标序列的载体，具有20个核苷酸的单链RNA序列，其中包含与目标DNA序列互补的20个碱基。

gRNA序列应当选择目标基因的外显子区域，以确保识别和剪切靶向位点。

此外，还应注意避免选择与其他基因序列重复的区域，以避免非特异性的编辑作用。

接下来，通过合成目标gRNA序列并将其结合Cas9蛋白质，形成CRISPR-Cas9复合物。

这可以通过化学合成法合成gRNA并表达Cas9蛋白质来实现。

CRISPR-Cas9复合物中的Cas9蛋白质将与目标gRNA序列形成稳定的复合物，以指导Cas9蛋白质的定位和剪切。

在实际操作中，可以通过转染或转化等方法将CRISPR-Cas9复合物引入目标细胞中。

转染使用化学物质或物理手段，如电穿孔或基因枪，将CRISPR-Cas9复合物导入细胞。

而转化则是将复合物与植物细胞壁进行接触，利用其自身的转染机制将复合物转入细胞内。

需要注意的是，在选择合适的转染或转化方法时，应考虑细胞类型、实验条件和CRISPR-Cas9复合物的纯度。

一旦CRISPR-Cas9复合物成功引入细胞内，Cas9蛋白质将根据gRNA的导引找到目标基因的靶向位点，并在位点上产生DNA双链断裂。

随后，细胞的自身修复机制（主要是非同源末端连接和同源重组）将被激活，以修复断裂的DNA。

Lenti-Pac TM HIV表达包装试剂盒——优化重组慢病毒·使用手册目录1 产品概述2 试剂盒组成3 其它所需细胞及试剂4 实验前准备5 制备慢病毒颗粒6 病毒颗粒滴度检验7 以制得慢病毒颗粒感染目的细胞8 使用许可与质量保证GeneCopoeia, Inc. 广州复能基因有限公司广州高新技术产业开发区广州科学城掬泉路3号广州国际企业孵化器D区8楼邮编：510663电话：4006-020-200邮箱：sales@网址：© 2013 GeneCopoeia, Inc.1.产品概述复能基因现提供40000多套人源及小鼠源ORF表达克隆，同时提供针对人源、小鼠源、大鼠源及其他哺乳类动物染色体组靶标基因的小发夹结构RNAi（shRNA）克隆。

HIV（人类免疫缺陷病毒）载体是近来使用最普遍的慢病毒表达载体，它能有效从体外或体内介导外源基因转导进入多种分化或非分化哺乳动物细胞。

慢病毒表达载体可整合到靶细胞基因组，产生稳定的转基因表达。

根据疾病控制中心作出的标准，复能基因第三代HIV慢病毒载体需要生物安全第二级的实验室操作。

复能基因提供的Lenti-Pac TM HIV表达包装系统包括：优化的慢病毒包装质粒混合物、eGFP阳性对照质粒、可优化病毒产物的复能基因EndoFectin TM转染试剂、可5-10倍提高病毒滴度的复能基因TiterBoost TM滴度增强剂。

结合复能基因HIV载体的慢病毒克隆，制得慢病毒颗粒具有高滴度及高表达水平的特质。

Lenti-Pac TM HIV骨架的表达包装系统可保证重组转录本在哺乳动物细胞的表达。

OmicsLink TM慢病毒ORF表达克隆和shRNA克隆的优点·从体外或体内高效转导基因至所有类型的哺乳动物细胞·ORF表达克隆转导后获得高表达水平·高效敲除靶标mRNA转录本·病毒载体自身失活，不产生其它病毒复制2．试剂盒组成试剂盒组成及推荐储存环境(表格内容参照货号Cat. No. HPK-LvTR-20/HPK-LvTR-40)3. 其它所需细胞及试剂1. GeneCopoeia GCI-L3化学感受态细胞(GeneCopoeia Cat No. STK300-10)，亦可选择Stbl3™化学感受态细胞(Invitrogen Cat No. C7373-03)2. GeneCopoeia 293Ta 慢病毒包装细胞系(GeneCopoeia Cat No. Clv-PK-01)，亦可选择HEK293T/17细胞系(ATCC Cat No. CRL-11268)3. H1299细胞系(ATCC Cat No. CRL-5803)或HT-1080细胞系(ATCC Cat No. CCL-121)，该细胞系用于测定慢病毒滴度。

基因编辑技术CRISPR的操作流程及注意事项基因编辑技术CRISPR已经成为生命科学领域一项重要的工具，它可以精确地编辑生物体的基因序列，为研究和治疗提供了无限的可能性。

然而，如此复杂而先进的技术在操作过程中需要谨慎，遵循一系列的步骤和注意事项，以确保高效、精确地进行基因编辑。

一、CRISPR的操作流程1. 设计和合成gRNACRISPR通过引导RNA(gRNA)的指导作用，将Cas9核酸酶精确地定位到目标基因的特定序列上。

首先，确定目标基因的特定序列，然后设计gRNA，该序列将与目标序列完全互补。

gRNA合成时，可以通过合成方法或体内表达的方式获得。

2. CRISPR-Cas9复合物的形成将Cas9蛋白和gRNA共转染至目标细胞中，通过相互作用，形成CRISPR-Cas9复合物。

Cas9蛋白是一种内切酶，而gRNA则起到定位作用。

3. 复合物定位和靶向切割CRISPR-Cas9复合物会将Cas9蛋白引导至目标基因的特定序列上，并在该位置发生双链断裂。

这一步骤会引发细胞的DNA修复机制，从而实现基因编辑的目的。

4. DNA修复细胞的DNA修复机制主要有两种：非同源末端连接(NHEJ)和同源重组(HDR)。

NHEJ机制通常会产生插入或缺失突变，而HDR机制则可以实现精确的插入、删除或替换。

5. 筛选和分离编辑细胞完成基因编辑后，需要通过特定技术筛选出进行了编辑的细胞，并将其分离培养，以便进行进一步的研究或应用。

二、CRISPR操作的注意事项1. 合理选择目标序列在设计gRNA时，应确保选择具有高度特异性的目标序列。

避免目标序列与非目标序列有任何匹配，以减少非特异性修饰的风险。

2. 控制CRISPR-Cas9复合物的浓度复合物浓度的过高或过低都会影响CRISPR-Cas9的效率和特异性。

应根据具体实验条件和细胞类型，进行合理的浓度优化。

3. 研究细胞类型的特点不同细胞类型对CRISPR的敏感性和效率有所不同。

lenticrisprv2测序引物CMV
CMV测序引物是LentiCRISPRv2引入剪接矢量测序技术的重要一环，用于生物过程分析和构建基因组以实现基因编辑。

简而言之，CMV测序引物是一种用于提取和测序从病毒囊液中分离出来的基因组片段的工具，它们是一种特殊的引物，由人类单纯疱疹病毒(CMV)片段组成，由核酸同源性成对（PAM）的碱基序列组成。

使用CMV测序引物，研究人员可以高通量测序提取基因组物质，这可以用于细胞分析，核酸和表观遗传学的研究，还可以用于查找基因组突变位点，快速扩增 DNA 以及快速构建新的基因组表达调控体系。

此外，CMV测序引物还有助于航太研究 - 例如DNA修复和环境变化。

由于该无菌环境中的DNA破坏易受高能粒子照射，因此，CMV测序引物可以帮助识别高能照射敏感的DNA 序列，重新修复和重新构建基因组。

另外，CMV测序引物可以与其他生物技术相结合，例如质粒技术——它可以更有效地识别质粒内的DNA序列，有助于向细胞内尽快引入慢病毒。

总之,CMV测序引物是一种重要的技术，可以帮助我们快速精确地对基因组进行分析，可以帮助研究人员快速扩增 DNA，帮助 DNA 的修复和细胞外引入慢病毒，以及实现其他多种科学研究。

我们可以利用它来创造更多技术，以提高我们的科学研究能力，并为我们的医疗和食品安全做贡献。

(完整word 版)CRISPR 建库流程
两步骤DNA 建库测序方法
第一轮PCR 反应,计算每个样品的基因组DNA 的量,从而达到整个文库300倍的覆盖率，这样，一个样品需要用到200ug 的的DNA （106
个细胞产生6。

6ug 的DNA)。

对于每一个样品，用6—8ug 的基因组DNA 进行25-30个独立的100ul 体系的PCR 反应，之后，把PCR 产胡合并在一个15ml 的离心管里面(～2.5-3ml ）。

第一轮PCR 反应的引物名称为：
lentiCRIPR_F1
lentiCRISPR_RV2
反应体系如下：
第二轮PCR 反应中需要
将Illumina 的接头连接到样品上面，并且加上标签.第二轮PCR 从第一轮PCR 反应中取出2 ul 作为模板，在100ul 的体系中进行反应。

a 。

第二轮PCR 反应的引物包括了用于增加文库复杂性的可变序列和一个6个碱基的DNA 序列。

b 。

PCR 反应条件和第一轮PCR 反应相同，但需要把循环数减少到8-12个。

用2%的琼脂糖凝胶电泳和凝胶纯化试剂盒纯化PCR 产物.为了达到测序需要的DNA 的量，需要用到第二轮PCR 反应中的50ul 的PCR 产物.。

基因过表达细胞株构建技术原理过表达载体构建利用同源重组的方法构建LentiCRISPRv2-GOI过表达载体，采用双酶切的方式获得线性化载体，根据同源重组设计目的片段的引物。

目的片段的获得分为两步PCR方法，第一步从模板中扩增出目的片段的ORF，第二步扩增加入Gsg-3×FLAG序列。

采用one step cloning 试剂盒连接目的片段与线性化载体，利用Amp进行抗性筛选。

1、基因序列扩增（图1）图1 基因序列第一轮扩增2、基因序列扩增，添加标签及同源序列3、双酶切pLentiCRISPRv2载体图2 目的基因第二轮PCR及线性化载体纯化结果4、目的基因与线性化载体连接利用ClonExpress II one step coloning Kit连接目的片段和线性化载体。

每个实验组各挑取单克隆菌落，于LB/ Amp培养基中扩增，并送样测序。

5、LentiCRISPRv2-GOI无内毒素质粒提取病毒包装1、培养细胞，配制PEI-Opti-MEM和质粒混合液，将PEI-Opti-MEM加入各质粒混合液中，轻弹管壁混匀，室温静置孵育15～20 min。

2、将上混合液小心滴加到培养基中，轻轻晃动摇匀，在培养箱中继续培养18 h。

3、18 h后小心吸去培养基，加入5 mL新配制的完全培养基。

4、42 h后收集培养上清，离心，0.45µm滤膜过滤，液氮速冻，-80℃保存。

细胞转染1、配制梯度病毒稀释液2、在六孔板中加入病毒稀释液，随后立即加入细胞，摇匀，以下每孔依次按此操作进行。

细胞于培养箱中静置培养48 h。

阳性多克隆细胞株筛选阳性单克隆细胞株筛选1、细胞转染48 h后，更换完全培养基，随后1～2 d更换一次。

2、筛选7天后，对照组细胞全部死亡，实验组细胞扩大培养，同时进行单克隆细胞筛选。

3、96孔板每孔加100 μL细胞悬液，用封口胶将孔板封好，放于培养箱中培养静置培养48 h后，更换完全培养基，随后1～2 d更换一次，每日观察并记录单克隆形成情况。

CRISPR核酸酶载体试剂盒说明书目录内容和保存介绍产品信息方法实验轮廓设计单链DNA寡核苷酸产生双链寡核苷酸连接反应转化感受态E.coli细胞分析转化子转染哺乳细胞系附录ACRISPR核酸酶载体试剂盒的图谱和特点附属产品技术支持参考附录BCRISPR核酸酶表达细胞的富集内容和含量1.1 双链（ds）对照寡核苷酸序列ds 克隆对照的寡核苷酸的序列如下所列。

ds 克隆对照的寡核苷酸来自退火的，并在试剂盒中提供的50μM的双链寡核苷酸。

ds 克隆对照的寡核苷酸在应用于连接反应之前需要进行再退火和稀释。

5’ CATTTCTCAGTGCTATAGAGTTTT 3’3’GTGGCGTAAAGAGTCACGATATCT 5’1.2感受态细胞转化效率≥1×109 cfu/微克质粒DNA1.3 TOP10细胞的基因型F-MCRAΔ（MRR-hsdRMS-mcrBC）φ80lacZΔM15ΔlacX74recA1 araD139Δ（ARA-LEU）7697Galu galKpsL（STRR）endA1 nupG2 介绍2.1 产品信息2.1.1 介绍GENEART®CRISPR核酸载体试剂盒便于产生表达CRISPR RNA和tracrRNA的非编码RNA以及在哺乳动物细胞中Cas9核酸酶介导的靶基因的裂解或基因编辑的结构体。

该Cas9核酸酶是基于从细菌化脓性链球菌II型CRISPR/ Cas系统，并经过精心设计的基因组编辑在哺乳动物系统（Jinek等人，2012;。

Mali1等人，2013;。

cong等人，2013）。

带有OFP的GENEART®CRISPR核酸载体允许Cas9和CRISPR RNA的基于流式细胞仪表达的细胞群的分选，而带有CD4的GENEART®CRISPR核酸载体使Cas9与CRISPR RNA为基础的表达细胞的富集。

线性GENEART®CRISPR核酸载体提供快速和有效的方式来克隆编码所需CRISPR RNA靶到表达盒，允许Cas9核酸序列中的特定的方式靶向的双链寡核苷酸。

以下所有实验，进行前请认真阅读试剂使用说明书。

一．RNA反转录cDNA试剂盒：Takara PrimeScript® RT reagent Ki t操作步骤：提前调水浴锅至42℃；按下列组份配制 RT 反应液(反应液配制请在冰上进行) 。

5×PrimeScript® Buffer(for Real Time) 2 μlPrimeScript® RT Enzyme Mix I 0.5 μlOligo dT Primer(50 μM) 0.5 μlRandom 6 mers(100 μM) 0.5 μlTotal RNA 360ngO up to 10 μl RNase Free dH2total 10μl轻柔吹打均匀；室温放置10min；42℃水浴锅中放置1h；冰中冷却2min；上述反应可根据条件在PCR仪中进行。

当需要使用的基因编码的RNA二级结构较为复杂时,反转录前,将 RNA 溶液于65°C加热 5 分钟后迅速置于冰中,利用这种办法可以减弱二级结构的影响,提高逆转录反应效率。

二．目的基因扩增引物设计原则：a)特异性：在cDNA中能且只能扩增出目的序列，不会扩增出其他序列；（通过blast检验）b)在引物5’端添加酶切位点及3个保护碱基；c)酶切位点使用所选载体中有的位点，尽量避免使用载体中相邻的位点，尽量避免使用平末端位点；所选位点在扩增目的片段中不能出现，可以使用primer premier对序列中的酶切位点进行分析。

三．PCR反应：拿到新合成的引物后，一般会设置退火温度梯度，摸索最适退火温度。

（Tm-5）℃不是一个普适的规律，最好不要太依赖。

4k以下的片段使用KOD Plus DNA 聚合酶，4k以上选择KOD FX DNA聚合酶，按说明书操作即可；四．PCR产物回收：配制1%琼脂糖凝胶：称取一克琼脂糖，加入100ml TAE溶液中，煮沸至凝胶完全溶解。

干货满满——CRISPR文库，从入门到进阶利用其多方面的潜能，各种工具被开发出来，给科研工作者在生物体各个层面涂涂改改做研究提供了极大便利。

简单列举如下表：● DNA水平，可以实现精确基因编辑，大片段、单碱基都能hold 住！● RNA水平，转录调控RNA上下调，RNA干扰全都搞的定！● 表观遗传水平，调控DNA碱基甲基化不是梦！● 还有分子定位，基因检测(SHERLOCK) 等等等等更关键的是，这些工具不仅可以对单分子进行操作，更强大到可以在组学水平进行全面筛选——那就是CRISPR相关文库。

今天小编尝试由浅入深，跟大家聊聊CRISPR文库。

一首先，CRISPR/CAS9系统如何发挥作用？第一步：引发双链DNA断裂（DSB）简单来说，CRISPR/CAS9系统是蛋白-RNA复合体(RNP)，两者结合，一起发挥功能：● sgRNA，通过与DNA碱基互补配对将RNP定位于基因组● Cas9，核酸内切酶，切割DNA双链诱发DSB（红色箭头）至此，CRISPR/CAS9系统的使命——瞄准了，切两刀，结束。

第二步：利用细胞DSB修复机制——编辑基因组CRISPR/CAS9造成一个DSB，而真正帮助我们实现目的的，其实是细胞本身的DNA修复机制：● 无模板，非同源介导的基因编辑（NHEJ)，不精确，引发移码突变，实现基因敲除（KO，Loss of Function)● 有模板，同源介导的基因修复（HDR），精确编辑一点点补充：● 有很多CRISPR系统只需要瞄准了，即精确结合到DNA（或RNA）上；● 不需要切两刀，即通过点突变将CAS9的2个核酸内切酶相关功能域失活；● 通过与CAS9融合表达另外一个功能蛋白（心有多大，舞台就有多大），实现其他功能，简单列举如下：附：SAM/Sun-tag/CRISPRa下面我们以CRISPR/CAS9本体用于基因功能研究为例接着聊。

二 CRISPR/CAS9介导的基因敲除——强大的Loss of Function 功能研究工具说起Loss of function，必提RNA干扰。

用于CRISPR基因组编辑的一体式载体系统使用GeneArt® CRISPR核酸载体试剂盒进行转染、富集、筛选并发表研究成果。

GeneArt®规律成簇的间隔短回文重复(CRISPR)核酸系统是简单、即用的多功能表达载体系统，同时包含用于快速、高效克隆靶向特异性crRNA的Cas9核酸表达框架和gRNA框架。

此系统允许您以序列特异性方式，从单个质粒编辑和设计您所选的遗传位点。

通过GeneArt® CRISPR鉴定相关靶标后，可采用GeneArt® Precision TAL验证生物相关突变，以降低潜在的脱靶几率。

现以两种形式供应：1.内置即用型试剂盒2.定制三组分的CRISPR编辑基因组编辑采用人工核酸结合源性修复机制来改变细胞内的DNA。

CRISPR/Cas系统充分利用了短gRNA的优势来靶向细菌Cas9核酸内切酶、定位遗传位点。

由于gRNA能够提供特异性，更改靶标时，仅需要更改gRNA序列编码的设计。

基因编辑中所用的CRISPR/Cas系统包含三种组分：Cas核酸Cas9（双链DNA核酸内切酶）、一种靶向补充物crRNA以及一种辅助反式激活因子crRNA（图1）。

GeneArt® CRISPR核酸载体的crRNA和tracrRNA都以gRNA的方式一同表达，其中gRNA则在细菌系统中模仿天然的crRNA-tracrRNA嵌合体。

所有需要做的工作就是引入一个编辑所需的序列的双链寡核苷酸，以表达契合体的crRNA部分。

图 1. CRISPR/Cas9 靶向的双链断裂。

双链上均出现断裂，发生在靶向序列3端NGG前间区序列邻近基序(PAM)序列的3碱基对上游。

GeneArt® CRISPR核酸载体试剂盒GeneArt® CRISPR核酸载体试剂盒是用于表达哺乳动物细胞内CRISPR/Cas基因组编辑所需功能组分的报告基因载体系统。

这一系列试剂盒现提供有不同的报告基因：带有OFP（橙色荧光蛋白）的GeneArt® CRISPR核酸载体，支持Cas9和CRISPR RNA表达细胞群的流式细胞术分选(FACS) （图2A）；带有CD4的GeneArt® CRISPR核酸载体，支持微珠法Cas9和CRISPR RNA表达细胞群富集（图2B）。

CRISPR基因编辑步骤详解基因编辑是一种通过修改DNA序列来改变有机体基因组的技术，CRISPR （Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）基因编辑技术则是近年来最受关注的一种基因编辑方法。

CRISPR技术不仅简单高效，还可以应用于多种生物体，包括人类，其广泛的应用前景使其成为生命科学领域的重要工具。

本文将详细介绍CRISPR基因编辑的步骤。

CRISPR基因编辑主要由以下几个步骤组成：选择目标基因，设计寡核苷酸，构建脱靶检测系统，编辑基因组，确认编辑效果。

首先，选择目标基因是进行基因编辑的关键步骤之一。

根据研究的需求和目标，科学家们需要仔细选择他们希望编辑的特定基因。

选择目标基因时，需要考虑基因功能和可能的突变对生物体的影响，以及基因的可编辑性等因素。

接下来，设计寡核苷酸是CRISPR基因编辑的重要步骤。

寡核苷酸通常有两种类型：RNA寡核苷酸（sgRNA）和单链DNA寡核苷酸（ssODN）。

sgRNA的作用是指导Cas9蛋白定位到目标基因上，而ssODN则是用于修复基因序列的片段。

因此，设计合适的寡核苷酸是确保编辑效果的关键。

构建脱靶检测系统是CRISPR基因编辑过程中一个重要的质控步骤。

由于CRISPR技术存在一定程度的脱靶效应，可能会对非目标基因进行修改，因此需要设计合适的方法来检测和排除这些脱靶效应。

常用的脱靶检测方法包括PCR扩增和DNA测序等。

编辑基因组是CRISPR技术的核心步骤。

一旦确定了目标基因和寡核苷酸的设计，科学家们就可以使用Cas9蛋白与sgRNA形成复合物，这个复合物会与目标基因的DNA序列配对，并引导Cas9蛋白在目标位点上产生双链切割。

这种双链切割会触发细胞内自然修复机制，从而导致基因组的编辑。

最后，确认编辑效果是CRISPR基因编辑中不可或缺的一步。

为了确定编辑效果，科学家们通常会使用一系列技术和方法来检测是否成功编辑了目标基因。