第三节水溶性维生素的测定
水溶性维生素B1、B2和C，广泛存在于动植物组织中，饮食来源充足，但由于它们本身的水溶性质，除满足人体生理、生化需求外，任何多余量都会从机体中排出。为避免缺乏，需要经常由饮食来提供。
水溶性维生素都易溶于水，而不溶于苯、乙醚、氯仿等大多数有机溶剂。在酸性介质中很稳定，既使加热也不破坏；但在碱性介质中不稳定，易于分解，特别在碱性条件下加热，可大部分或全部被破坏。它们易受空气、光、热、酶、金属离子等的影响；维生素B2对光，特别是紫外线敏感，易被光线破坏；维生素C对氧、铜离子敏感，易被氧化。
由于水溶性维生素具有上述特性，测定水溶性维生素时，一般都在酸性溶液中进行前处理。维生素B1、B2通常采用盐酸水解，或再经淀粉酶、木瓜蛋白酶等酶解作用，使结合态维生素游离出来，还可用活性人造浮石、硅镁吸附剂等进行纯化处理。
测定水溶性维生素常用高效液相色谱法、荧光法、比色法和微生物法等。
一、维生素B1的测定(荧光法，GB/T5009.84—2003)
维生素B1又名硫胺素、抗神经炎素，通常以游离态，或以焦磷酸酯形式存在于自然界。在酵母、米糠、麦胚、花生、黄豆以及绿色蔬菜和牛乳、蛋黄中含量较为丰富。动物组织不如植物含量丰富。
维生素B1在水中溶解度较大，在酸性溶液中较稳定，在碱性溶液中加热极易分解。
近年来对利用带荧光检测器的高效液相色谱测定法进行了许多研究，并应用于实际试样测定。这里我们主要介绍荧光法（参考GB/T 5009.84-2003食品中硫胺素(维生素B1)的测定）
（一）荧光法
1．原理
试样在酸性溶液中加热，提取维生素B1，经蛋白分解酶处理，使维生素B1成为游离型。再经层析柱纯化，去除荧光淬灭物质，同时浓缩，用碱性铁氰化钾溶液将其氧化成硫色素，在紫外线下，硫色素发出荧光，再给定的条件下以及没有其他物质干扰时，此荧光之强度与硫色素量成正比即与溶液中维生素B1量成正比。如试样中含杂质过多，应经过离子交换剂处理，使硫胺素与杂志分离，然后以所得溶液做测定。
2．试剂
⑴盐酸（0.1mol/L）：8.5mL浓盐酸（相对密度1.19或1.20）用水稀释至1000mL；
⑵盐酸（0.3mol/L）：25.5mL浓盐酸用水稀释至1000mL；
⑶乙酸溶液：30mL冰乙酸用水稀释至1000mL；
⑷氢氧化钠溶液（150g/L）：15g氢氧化钠溶于水中稀释至100mL；
⑸无水硫酸钠；
⑹乙酸钠溶液（2mol/L）：164g无水乙酸钠溶于水中稀释至1000mL；
⑺氯化钾溶液（250g/L）：250g氯化钾溶于水中稀释至1000mL；
⑻酸性氯化钾溶液（250g/L）：8.5mL浓盐酸用25%氯化钾溶液稀释至1000mL；
⑼1%铁氰化钾溶液（10g/L）：1g铁氰化钾溶于水中稀释至100mL。放于棕色瓶内保存；
⑽碱性铁氰化钾溶液：取4mL 10g/L铁氰化钾溶液，用150g/L氢氧化钠溶液稀释至60mL。用时现配，避光使用；
⑾正丁醇：需经重蒸馏后使用；
⑿淀粉酶和蛋白酶；
⒀活性人造浮石：称取200g 40目～60目的人造浮石，以10倍于其容积的热乙酸溶液搅洗2次，每次10min；再用5倍于其容积的250g/L热氯化钾溶液搅洗15min；然后再用稀乙酸溶液搅洗10min；最后用热蒸馏水洗至没有氯离子。于蒸馏水中保存；
⒁硫胺素标准贮备液（0.1mg/mL）：准确称取100mg经氯化钙干燥24h的硫胺素，溶于0.01mol/L盐酸中，并稀释至1000mL。于冰箱中避光保存；
⒂硫胺素标准中间液（10μg/mL）：将硫胺素标准贮备液用0.01mol/L盐酸稀释10倍。此溶液每毫升相当10μg硫胺素。于冰箱中避光可保存数月；
⒃硫胺素标准使用液（0.1mg/mL）：将硫胺素标准中间液用水稀释100倍，用时现配；
⒄溴甲酚绿溶液（0.4g/L）：称取0.1g溴甲酚绿，置于小研钵中，加入1.4mL0.1mol/L 氢氧化钠研磨片刻，再加入少许水继续研磨至完全溶解，用水稀释至250mL。
3．仪器
⑴电热恒温培养箱；
⑵荧光分光光度计；
⑶Maizel-Gerson反应瓶；
⑷盐基交换管。
4．操作步骤
⑴试样制备
试样准备
样品采集后用匀浆机打成匀浆保存于低温冰箱中冷冻，用时将其解冻后使用。干燥试样要将其尽量粉碎后备用。
提取
准确称取适量试样（估计其硫胺素含量约为10μg～30μg,，一般称取2g～10g试样）置于100mL三角瓶中，加入50mL0.1mol/L或0.3mol/L盐酸使其溶解，放入高压锅中加热水解，121℃30min，凉后取出。
用2mol/L乙酸钠调pH值为4.5（以0.4g/L溴甲酚绿为外指示剂）。
按每克试样加入20mg淀粉酶和40mg蛋白酶的比例加入淀粉酶和蛋白酶。于45℃～50℃温箱过夜保温（约16h）。
凉至室温，定容至100mL，然后混匀过滤，即为提取液。
净化
用少许脱脂棉铺于盐基交换管的交换柱底部，加水将棉纤维中气泡排出，再加约1g活性人造浮石使之达到交换柱的1/3高度。保持盐基交换管中液面始终高于活性人造浮石。
用移液管加入提取液20mL ～60mL （使通过活性人造浮石的硫胺素总量约为2μg ～5μg ）。
加入约10mL 热蒸馏水冲洗交换柱，弃去洗液。如此重复三次。
加入20mL250g/L 酸性氯化钾（温度为90℃左右），收集此液于25mL 刻度试管内。冷至室温，用250g/L 酸性氯化钾定容至25mL ，即为试样净化液。
重复上述操作，将20mL 硫胺素标准使用液加入盐基交换管以代替样品提取液，即得到标准净化液。
氧化
将5mL 试样净化液分别加入A 、B 两个反应瓶。
在避光条件下将3mL150g/L 氢氧化钠加入反应瓶A ，将3mL 碱性铁氰化钾溶液加入反应瓶B ，振摇约15s ，然后加入10mL 正丁醇；将A 、B 两个反应瓶同时用力振摇1.5min 。
重复上述操作，用标准净化液将代替试样净化液。
静置分层后吸去下层碱性溶液，加入2g ～3g 无水硫酸钠使溶液脱水。
⑵ 测定
荧光测定条件：
激发波长365nm ；发射波长435nm ；激发波狭缝5nm ；发射波狭缝5nm 。
依次测定下列荧光强度：
a. 试样空白荧光强度（试样反应瓶A ）；
b. 标准空白荧光强度（标准反应瓶A ）；
c. 试样荧光强度（试样反应瓶B ）；
d. 标准荧光强度（标准反应瓶B ）。
5．结果计算
1000
1001)(21???-?-=m V V S S cV U U X b b 式中 X —样品中硫胺素含量，mg/100g ；
U —样品荧光强度；
U b —样品空白荧光强度；
S —标准荧光强度；
S b —标准空白荧光强度；
c —硫胺素标准使用液浓度，μg/m L ；
V —用于净化的硫胺素标准使用液体积，mL ；
V 1—样品水解后定容之体积，mL ；
V 2—样品用于净化的提取液体积，mL ；
m —样品质量，g ；
100/1000—样品含量由μg/g 换算成mg/100g 的系数。
6．说明及注意事项
⑴ 一般食品中的维生素B 1游离型的，也有结合型的，即与淀粉、蛋白质等结合在一起的，故需用酸或酶水解，是结合型维生素B 1成为游离型，再采用此法测定。一般淀粉酶含有维生素B 1要用白土吸附去除，但需要迅速处理，否则酶活性降低。
⑵ 谷物类物质不需酶分解，样品粉碎后用250g/L 酸性氯化钾直接提取。
⑶ 样品与铁氰化钾溶液混合后，所呈现的黄色应至少保持15s ，否则应再滴加铁氰化钾溶液1~2滴，因样品中含有还原性物质，而铁氰化钾用量不够时，硫胺素氧化不完全，但过多的铁氰化钾又会破坏硫胺素，其用量应恰当。
⑷紫外线破坏硫胺素，因此硫胺素形成后要迅速测定并力求避光操作。
⑸加热酸性KCL时不能使其沸腾，热KCL滤速较快，而不沸则是使其不至因过饱和而在洗涤中结晶析出阻塞交换柱。
⑹氧化中加铁氰化钾是整个实验的关键，对每个样品所加试剂的次序、快慢、振摇时间等都必须尽量一致，尤其是用正丁醇提取硫色素时必须保证准确振摇90s。
（二）高效液相色谱法(HPLC)
1．原理
维生素B1测定通常采用反相键结合相色谱法进行分离，利用紫外检测器或荧光检测器检测。利用荧光检测器检测时，应首先使从样品中提取出来的维生素B1氧化成硫色素，然后转入正丁醇或异丁醇中，再进行HPLC分析。HPLC法快速、简便、准确、灵敏度高。
2．试剂
⑴0.0025mol/L磷酸盐缓冲溶液（P H7.4）；
⑵流动相：以磷酸盐缓冲液80份和乙腈20份相互混合而成；
⑶碱性氰化钾溶液：吸收97mL150g/LNaOH溶液加入3mL10g/L铁氰化钾相互混合而成；
⑷维生素B1标准溶液：用0.01mol/L盐酸溶液将符合药典的盐酸硫胺素配制成100μg/mL维生素B1标准溶液；
⑸维生素B1标准使用溶液：取维生素B1标准溶液2mL，用重蒸馏水定容至100mL，最终浓度为2μg/mL；
⑹混合酶溶液：根据酶的活度和活力，用2mol/LCH3COONa溶液取适量的淀粉酶和木瓜蛋白酶配制成各3%的浓度。
3．仪器
⑴液相色谱仪（配荧光分光检测器和记录仪）；
⑵微量注射器（5、10μL微量注射器）；
⑶实验室常用设备。
4．操作步骤
⑴样品处理
将固体样品粉碎后过20目筛备用。肉类及水产品样品经捣碎机捣碎。果蔬类样品也经捣碎后备用。
称取样品1.00g（维生素B1含量不低于0.5μg）于50mL棕色容量瓶中，加入35mL0.1mol/L 盐酸溶液，在超声波浴中处理3min或转动摇动，在高压灭菌器内于121℃、20～30min或者置于沸水中加热30min，然后轻摇数次。取出，冷却至40℃以下，分别加入2.5mL混合酶液，摇匀，置于37℃下过夜或于42～43℃加热4h，冷却，用水定容至50mL,样液经3000r/min的速度离心后过滤，取约10mL滤液备用。
取上述滤液5mL于60mL分液漏斗中，边振边沿分液漏斗壁加入3mL碱性铁氰化钾溶液，继续振摇10s，立即加入8mL异丁醇，并猛烈振摇45s,静置分层后，弃去水层。有机相通过无水硫酸钠小柱，收集待测溶液维生素B1。
维生素B1标准使用溶液：分别取0.00、0.25、0.50、1.00、2.00和4.00mL维生素B1于50mL的棕色容量瓶中，再加入与样品等量的0.1mol/L盐酸溶液，以下操作方法与样品处理相同。
⑵样品测定
样品液与维生素B1分别进样分析（等量进样）。
色谱分析条件
色谱柱为YWG–C18，250mm×3.8mm（内径，简写为i.d.）；
激发波长为435nm ；
狭缝为10nm ；
发射波长为375nm ；
狭缝为12.5nm ；
灵敏度为10；
流动相速度为1mL/min ；
进样量为4μL 或8μL 。
5．结果结算
以标准系列的峰高为纵坐标，标准系列的维生素B 1含量（μg ）为横坐标，绘制标准曲线。
计算公式为：
m
m X 1 式中 X —维生素B 1含量，μg /g ；
m 1—由标准曲线查得相当于维生素B 1的质量，μg ；
m —进入色谱内的样品质量，g 。
二、食品中核黄素的测定(GB/T5009.85—2003)
维生素B 2即核黄素，在食品中以游离形式或磷酸酯等结合形式存在。核黄素是机体许多重要辅酶的组成成分，对机体内糖、蛋白质、脂肪代谢起着重要作用。缺乏时会发生口角炎、舌炎等。膳食中的主要来源是各种动物性食品，其中以肝、肾、心、蛋、奶含量最多，其次是植物性食品的豆类和新鲜绿叶蔬菜。人体不能合成。
核黄素为橙黄色针状结晶化合物，由于具有橙黄色，又称核黄素。味苦，易溶于水和乙醇，水溶液呈黄绿色荧光。维生素B 2在酸性溶液中稳定、耐热。在碱性溶液中极易受光照射而被破坏。游离核黄素对光、紫外线敏感。
维生素B2是由异咯嗪基和核糖醇基所组成的
核糖醇基 异咯嗪基维生素B 2的化学式
（一）荧光法
1．原理
核黄素在440nm ～500nm 波长光照射下发生黄绿色荧光。在稀溶液中其荧光强度与核黄素的浓度成正比。在波长525nm 下测定其荧光强度。试液再加入低亚硫酸钠（Na 2S 2O 4），将核黄素还原为无荧光的物质，然后再测定试液中残余荧光杂质的荧光强度，两者之差即为样品中核黄素所产生的荧光强度。
2．试剂
试验用水为蒸馏水。试剂不加说明为分析纯。
⑴ 盐酸（0.1mol/L ）；
⑵ 氢氧化钠（1mol/L ）；
⑶氢氧化钠（0.1mol/L）；
⑷硅镁吸附剂：60目～100目；
⑸无水乙酸钠溶液（2.5mol/L）；
⑹低亚硫酸钠溶液（200g/L）：此液用时现配。保存在冰水浴中，4h内有效；
⑺洗脱液：丙酮＋冰乙酸＋水（5＋2＋9）；
⑻溴甲酚绿指示剂：（0.4g/L）；
⑼高锰酸钾溶液（30g/L）；
⑽过氧化氢溶液（3%）；
⑾木瓜蛋白酶（10%）：用2.5mol/L乙酸钠溶液配制。使用时现配制；
⑿淀粉酶（10%）：用2.5mol/L乙酸钠溶液配制。使用时现配制；
⒀核黄素标准溶液的配制（纯度98％）；
核黄素标准储备液（25μg/L）：将标准品核黄素粉状结晶置于真空干燥器或盛有硫酸的干燥器中。经过24h后，准确称取50mg，置于2L容量瓶中，加入2.4mL冰醋酸和1.5L水。将容量瓶置于温水中摇动，待其溶解，冷至室温，稀释至2L，移至棕色瓶内，加少许甲苯盖于溶液表面，于冰箱中保存。
核黄素标准使用液：吸取2.00mL核黄素标准储备液，置于50mL棕色容量瓶中，用水稀释至刻度。避光，贮于4℃冰箱，可保存一周。此溶液每毫升相当于1.00μg核黄素。
3．仪器
⑴实验室常用设备；
⑵高压消毒锅；
⑶电热恒温培养箱；
⑷核黄素吸附柱；（图片）
⑸荧光分光光度计。
4．分析步骤
整个操作过程需避光进行。
⑴试样提取
试样的水解
准确称取2g～10g样品（约含10μg～200μg核黄素）于100mL三角瓶中，加50mL0.1mol/L 盐酸，搅拌直到颗粒物分散均匀。用40mL瓷坩埚为盖扣住瓶口，置于高压锅内高压水解，10.3×104Pa30min。水解液冷却后，滴加1mol/L氢氧化钠，取少许水解液，用0.4g/L溴甲酚绿检验呈草绿色，pH为4.5。
试样的酶解
a. 含有淀粉的水解液：加入3mL10%淀粉酶溶液，于37℃～40℃保温约16h。
b. 含高蛋白的水解液：加3mL10%木瓜蛋白酶溶液，于37℃～40℃保温约16h。
过滤
上述酶解液定容至100.0mL，用干滤纸过滤。此提取液在4℃冰箱中可保存一周。
⑵氧化去杂质
视试样中核黄素的含量取一定体积的试样提取液及核黄素标准使用液（约含1μg～10μg 核黄素）分别于20mL的带盖刻度试管中，加水至15mL。各管加0.5mL冰醋酸，混匀。加30g/L高锰酸钾溶液0.5mL，混匀，放置2min，使氧化去杂质。滴加3％双氧水溶液数滴，直至高锰酸钾的颜色退掉，剧烈震摇此管，使多余的氧气逸出。
⑶核黄素的吸附和洗脱
核黄素吸附柱：称硅镁吸附柱约1g用湿法装入柱，占柱长1/2～2/3（约5cm）为宜（吸附柱下端用一小团脱脂棉垫上），勿使柱内产生气泡，调节流速约为60滴/min。
过柱与洗脱：将全部氧化后的样液及标准液通过吸附柱后，用约20mL 热水洗去样液中的杂质。然后用5.00mL 洗脱液将试样中核黄素洗脱并收集于一带盖10mL 刻度试管中，再用水洗吸附柱，收集洗出之液并定容至10mL ，混匀后待测荧光。
⑷ 标准曲线的制备
分别精确吸取核黄素标准使用液0.3mL 、0.6 mL 、0.9 mL 、1.25 mL 、2.5 mL 、5.0 mL 、10.0 mL 、20.0mL （相当于0.3μg 、0.6μg 、0.9μg 、1.25μg 、2.5μg 、5.0μg 、10.0μg 、20.0μg 核黄素）或取与试样含量相近的单点标准按核黄素的吸附和洗脱步骤操作。
⑸ 测定
于激发光波长440nm ，发射光波长525nm ，测量试样管及标准管的荧光值。
待试样及标准的荧光值测量后，在各管的剩余液（约5mL ～7mL ）中加0.1mL20％低亚硫酸钠溶液，立即混匀，在20s 内测定各管的荧光值，作试样的空白值和标准的空白值。
5．结果计算
)()(1000
1000???-?-=F m D C m B A X 式中 X —样品中含核黄素的量,mg/100g ；
A —样品管荧光值；
B —样品管空白荧光值；
C —标准管荧光值；
D —标准管空白管荧光值；
F —稀释倍数；
m —样品的质量，g ；
m 0—标准管中核黄素的含量, μg ；
100/1000——将样品中核黄素量由μg/g 折算成mg/100g 的折算系数。
6．说明及注意事项
⑴ 核黄素对光敏感，整个操作应在避光条件下进行。
⑵ 核黄素可被低亚硫酸钠还原成无荧光型，但摇动后很快被空气氧化成有荧光物质，所以要立即测定。
⑶ 试样提取液中若有色素，可吸收部分荧光，因此要除去色素（用高锰酸钾氧化）。 ⑷ 在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算数平均值的10%。
（二）微生物法
1．原理
某一种微生物的生长（繁殖）必需某些维生素。例如干酪乳杆菌（Lactobacillus casei ，简称L.C.）生长需要核黄素，培养基中若缺乏这种维生素该细菌就不能生长。在一定条件下，该细菌生长情况，以及它的代谢物乳酸的浓度和培养基中该维生素含量成正比，因此可以用酸度及混浊度的测定方法来测定试样中核黄素的含量。
2．试剂
⑴ 盐酸（0.1mol/L ）；
⑵ 冰乙酸；
⑶ 氢氧化钠溶液（1 mol/L 和0.1 mol/L ）；
⑷ 氯化钠溶液（生理盐水，0.9g/L ）：使用前应进行灭菌处理；
⑸ 无水乙酸钠；
⑹ 氢氧化铵；
⑺ 乙酸铅；
⑻干酪乳杆菌（Lactobacillus casei ATCC 7469）；
⑼甲苯；
⑽核黄素标准储备液（25μg/mL）
将标准品核黄素粉末结晶置于真空干燥器或盛有硫酸的干燥器中。经过24小时后，准确称取50mg，置于2L容量瓶中，加入2.4mL冰乙酸和1.5L水。将容量瓶置于温水中摇动，待其溶解，冷至室温，稀释至2L，移至棕色瓶内，加少许甲苯盖于溶液表面，于冰箱中保存；
⑾核黄素标准中间液（10μg/mL）
准确吸取20mL标准储备液，加水稀释至50mL；
⑿核黄素标准使用液（0.1μg/mL）
准确吸取1.0mL中间液于100mL容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀。每次分析要配制新标准使用液；
⒀碱处理蛋白胨
分别称取40g蛋白陈和20g氢氧化钠于250mL水中。混合后，放于37℃±0.5℃恒温箱内，24h～48h后取出，用冰乙酸调节pH至6.8，加14g无水乙酸钠（或23.2g含有3分子结晶水的乙酸钠），稀释至800mL，加少许甲苯盖于溶液表面，于冰箱中保存；
⒁胱氨酸溶液（1g/L）
称取1g L-胱氨酸于小烧杯中。加20mL水，缓慢加入约5mL～10mL盐酸，直至其完全溶解，加水稀释至1L，加少许甲苯盖于溶液表面；
⒂酵母补充液
称取100g酵母提取物干粉于500mL水中，称取150g乙酸铅于500mL水中，将两溶液混合，以氢氧化铵调节pH至酚酞呈红色（取少许溶液检验）。离心或用布氏漏斗过滤，滤液用冰乙酸调节pH至6.5。通入硫化氢直至不生沉淀，过滤，通空气于滤液中，以排除多余的硫化氢。加少许甲苯盖于溶液表面，于冰箱中保存；
⒃甲盐溶液
称取25g磷酸氢二钾和25g磷酸二氢钾，加水溶解，并稀释至500mL。加入少许甲苯以保存之；
⒄乙盐溶液
称取10g硫酸镁（MgSO4·7H2O），0.5g硫酸亚铁（FeSO4·7H2O）和0.5g硫酸锰（MnSO4·4H2O），加水溶解，并稀释至500mL，加少许甲苯以保存之；
⒅基本培养储备液
将下列试剂混合于500mL烧杯中，加水至450mL，用1mol/L氢氧化钠溶液调节pH至6.8，用水稀释至500mL
碱处理蛋白胨100mL
0.1%胱氨酸溶液100mL
酵母补充液20mL
甲盐溶液10mL
乙盐溶液10mL
无水葡萄糖10g
⒆琼脂培养基
将下列试剂混合于250mL三角瓶中，加水至100mL，于水浴上煮至琼脂完全溶化，用1mol/L盐酸趁热调节pH至6.8。尽快倒入试管中，每管3mL～5mL，塞上棉塞，于高压锅内在6.9×104Pa压力下灭菌15min，取出后直立试管，冷至室温，于冰箱中保存；
无水葡萄糖1g
乙酸钠(NaA c·3H2O) 1.7g
蛋白胨0.8g
酵母提取物干粉0.2g
甲盐溶液0.2mL
乙盐溶液0.2mL
琼脂 1.2g
⒇溴甲酚绿指示剂（0.4g/L）
称取0.1g溴甲酚绿于小研钵中，加1.4mL0.1mol/L氢氧化钠溶液研磨，加少许水，继续研磨，直至完全溶解。用水稀释至250mL；
（21）溴麝香草酚蓝指示剂（0.04%）
称取0.1g溴麝香草酚蓝于小研钵中，加1.6mL0.1mol/L氢氧化钠溶液研磨。加少许水，继续研磨，直至完全溶解，用水稀释至250mL。
3．仪器与设备
⑴实验室常用设备；
⑵电热恒温培养箱；
⑶离心沉淀机；
⑷液体快速混合器；
⑸高压消毒锅。
4．菌种的制备与保存
⑴储备菌种的制备
以L.C.纯菌种接入2个或多个琼脂培养基管中。在37℃±0.5℃恒温培养箱中保温16h～24h。贮于冰箱内，至多不超过2周，最好每周移种一次。保存数周以上的储备菌种，不能立即用于制备接种液，一定要在使用前每天移种一次，连续2d～3d方可使用，否则生长不好。
⑵种子培养液的制备
取5mL核黄素标准使用液和5mL基本培养储备液于15mL离心管混匀，塞上棉塞，于高压锅内在6.9×104Pa压力下灭菌15min。每次可制备2管～4管。
5．操作步骤
因核黄素易被日光和紫外线破坏，故一切操作要在暗室内进行。
⑴接种液的制备
使用前一天，将菌种由储备菌种管中移入已消毒的种子培养液中，同时制做两管。在37℃±0.5℃保温16h～24h。取出后离心10min（3000r/min），以无菌操作方法倾去上部液体，用已消毒的生理盐水淋洗二次，再加10mL消毒生理盐水，在液体快速混合器上振摇试管，使菌种成混悬体。将此液倾入已消毒的注射器内，立即使用。
⑵试样的制备
将样品用磨粉机、研钵磨成粉末或用打碎机打成匀浆。
称取约含5μg～10μg的核黄素样品（谷类约10g，干豆类约4g，肉类约5g），加入50mL 0.1mol/L盐酸溶液，混匀。置于高压锅内，在10.3×104Pa压力下水解30min。
冷至室温，用1mol/L氢氧化钠溶液调节pH至4.6（取少许水解液，用溴甲酚绿检验，溶液呈草绿色即可）。
加入淀粉酶或木瓜蛋白酶，每克样品加入20mg酶。在40℃恒温箱中过夜，大约16h。
冷至室温，加水稀释到100mL，过滤。对于脂肪量高的食物，可用乙醚提取，以除去脂肪。
⑶标准管的制备
三组试管中每管各加核黄素标准使用液0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL ，每管加水至5mL ，再每管加5mL 基本培养储备液混匀。
⑷ 试样管的制备
吸取试样溶液5mL ～10mL ，置于25mL 具塞试管中，用0.1mol/L 氢氧化钠调节pH 至
6.8（取少许溶液，用溴麝香草酚蓝检验），加水稀释至刻度。
取两组试管，各加试样稀释液1，2，3，4mL ，每管加水至5mL ，每管再加5mL 基本培养储备液混匀。
⑸ 灭菌：将以上样品管和标准管全部塞上棉塞，置于高压锅内，在6.9×104Pa 压力下灭菌15min 。
⑹ 接种和培养
待试管冷至室温，在无菌操作条件下接种，每管加一滴接种液，接种时注射器针头不要碰试管壁，要使接种液直接滴在培养液内。
置于37℃±0.5℃恒温箱中培养约72h ，培养时每管必须在同一温度。培养时间可延长18h 或减少12h 。必要时可在冰箱内保存一夜再滴定。若用混浊度测定法，以培养18h ～24h 为宜。
⑺ 滴定
将试管中培养液倒入50mL 三角瓶中，加0.001%溴麝香草酚蓝溶液5mL ，分二次淋洗试管，洗液倒至该三角瓶中，以0.1mol/L 氢氧化钠溶液滴定，终点呈绿色。以第一瓶的滴定终点作为变色参照瓶。约30min 后再换一参照瓶，因溶液放置过久颜色变浅。
⑻ 标准曲线的绘制
用标准核黄素溶液的不同浓度为横坐标及在滴定时所需0.1mol/L 氢氧化钠的毫升数为纵坐标，绘制标准曲线。
6．结果计算
1000
100???=F m V c X 式中 X —试样中核黄素含量，单位为毫克每一百克（mg/100g ）；
c —以曲线查得每毫升试样中核黄素含量，单位为微克每毫升（μg /mL ）；
V —试样水解液定容总体积，单位为毫升（mL ）；
F —试样液的稀释倍数；
m —试样质量，单位为g ；
100/1000—试样含量由微克每克(μg /g)换算成毫克每一百克(mg/100g )的换算系数。
7．说明及注意事项
⑴ 在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算数平均值的10%。 ⑵ 计算结果保留到小数点后第二位。
反相高效液相色谱法测定食品中水溶性维 生素的含量 分析洲第16卷第3期1997.525 FENXICKSHIXUEB&O(Jota'naloflnstmmel~talAzasis, 反相高效液相色谱法测定食品中 水溶性维生素的含量 李来生张江华功午 (南昌大学应用化学研究所南昌330047j 摘要采坍反相色l蒋时洲宜传?溶性维生求(vtir_]c,,Bl,B2剜Bt2的古培.PC8一IO/S2504【4.0 25010)牡.0】I..艘铵一l_盹蒲漩(pH:45,青04%己胺)+甲醇(75+25)为流曲丰日.流速1 nalJminuY2_54呲I】l12…l1_j瑚r岛好汁离.己酰苯胺为内标物.苹果及强化奶粉中维生索平均收率井别为 925f)%一I(∞%干Ⅱ9500%～】∞80%.该法拇怍简便,迅谜可靠,测试费用低一 业= 水溶性堆生素是维持凡体正常生理代谢的一类重要化台物.有关其测定方j击较多,其中有}硼Lc法小1 报道但个别检测为主,食品中系列测定方法偏少,现在普遍栗用的离子对色谱法需耗鞍贵的己烷磺酸盐等 离子对试剂,且对色谱柱和高压泵甫…定的腐蚀作用, 本文采用选扦性较高的c8吲定棚,价格便宜的甲醇一水为流动栩.通过改变pH值等色谱条件,短时间内实 现了上述6种维生素的分离浚法平衡时间短,测定迅速,实用性强. 1实验材料与方法 11主要仪器与试剂
日本岛津I￡一6A液相色谱仪,酸度计等 甲醇(AR)用前重蒸次:维生素对照品均符中国药典(1990版)规定;淀粉酶(杭l州大学生物制品厂 产):其它试剂均为分析纯 果蔬及强化奶粉样品购于集贸市场. 1.2色谱条件 色谱拄:PC8—10/s25O4(40『¨mx2501111"131,日本岛津产;流动相:0.1mol/L甲酸铵一甲酸(DH=4.5,舍o.4% 二己胺)+甲醇(75+25),1tv,]g'mJn;柱温3【);【254nm:【)04AUFS. 1.3标准液配镧c避光操作) 准确称取下靖(mg)的标准品:VitaminC13帅,Vitamin12.25,Vitanfin20.15,VitaminBL8.65 Vha~nB211.15,Vitamin111,20,己酰苯胺6 用0.1mol/LHCI溶解并定容至 50ml-作储备被,VitaminC改用 3%偏磷酸溶解:依次等鼙移取 各组分储备ji蔓5,10,20,1'00,500, 10(30于10mL棕色餐瓶中,用 水定容(每个容量瓶预先分别加 内标储备液1'00l正),得六组标准 液,分别进样测定标准品及强 化奶粉样品色谱圈见图1和圈 2c 1.4样品前处理 05l00, nt~dtt 圉j标样色谱圈圈2强化奶粉色谱图 1~tattmaC;2,VilaminB5;3Vilam/n;4.viIBj; 5Vitatn~n;6内杯;7.~PaminB12.
Chapter10维生素的分析测定复习题 一、填空题： 1.维生素是从营养观点归纳而成的一类有机化合物。维生素C又叫抗坏血酸，属于溶性维生素。 2.测维生素C通常采用草酸溶液直接提取，原因是：在一定浓度的酸性介质中，可以消除某些还原性杂质对维生素C的破坏作用。。 3.测定食品中维生素C方法之一是2,6-二氯酚靛酚法,其原理是染料2,6-二氯酚靛酚在酸性中呈红色，被还原后颜色消失。还原型抗坏血酸还原2,6-二氯酚靛酚后，本身被氧化成脱氢抗坏血酸。用标准的2.6-二氯靛酚染料溶液滴定含维生素C溶液，滴定至溶液呈粉红色于15秒内不褪色为终点。 二、判断 1.（√）比色法检测维生素A 时，必须在比色槽内反应。 三、选择题： 1. （A）“GB/T5009.159-2003”中规定的还原型总抗坏血酸的测定方法是。 A. 固蓝盐B比色法 B. 2,6-二氯靛酚滴定法 C. 荧光法 D. 2,4-二硝基苯肼比色法 四、简答题 1.测定脂溶性维生素时，通常采用的样品预处理方法是什么？ 答:皂化样品→水洗去除类脂物→有机溶剂提取脂溶性维生素(不皂化物) →浓缩→单样→溶于适当的溶剂→测定。 ↓ 多样→分离（纸层析、薄层层析、柱层析）→单样（同上） 五、综合题 1.请详细介绍实验室中测定食品中维生素A含量时的样品预处理方法以及用比色法测定的原理、适用范围和注意事项。 答:皂化样品→水洗去除类脂物→有机溶剂提取脂溶性维生素(不皂化物) →浓缩→溶于适当的溶剂→测定。 在皂化和浓缩时，为防止维生素的氧化分解，常加入抗氧化剂(如焦性没食子酸、维生素C等)。 在氯仿溶液中，V A与三氯化锑可生成蓝色可溶性络合物，在620 nm 波长处有最大吸收峰，其吸光度与V A的含量在一定的范围内成正比，故可比色测定。 ?适用范围及特点 本法适用于维生素A含量较高的各种样品(高于5—10μg／g )，对低含量样品，因受其他脂溶性物质的干扰．不易比色测定： 该法的主要缺点是生成的蓝色络合物的稳定性差。比色测定必须在六秒钟完成，否则蓝色会迅速消退，将造成极大误差。 注意： 1. 维生素A见光易分解，整个实验应在暗处进行，防止阳光照射，或采用棕色玻璃避光。 2. 三氯化锑腐蚀性强，不能沾在手上，三氯化锑遇水生成白色沉淀．因此用过的仪器要先用稀盐酸浸泡后再清洗。
维生素C 中国居民膳食营养素参考摄入量（2013版）摘录 维生素C又名抗坏血酸，是人体内重要的水溶性抗氧化营养素之一。维生素C缺乏导致的坏血病是最早被发现的维生素缺乏病之一，早在公元前1550年就有坏血病的记载。公元前450年，希腊的医学资料记在了坏血病的症状。15~16世纪，坏血病曾波及整个欧洲，并导致多起远航海员死亡事件。1747年英国的一名海军军医首次发现柑橘和柠檬能治疗坏血病。1928年剑桥大学的学者从牛肾上腺、柑橘和甘蓝叶中分离出了抗坏血酸。到20世纪30年代，科学家们以阐明了维生素C的结构，并成功地合成了维生素C。 近年来，营养学界对人类维生素C的摄入量与慢性病的预防进行了多项研究，取得了许多重要研究进展。本书根据有关研究资料，就修订了我国维生素C的DRIs提出建议。 一、消化吸收与代谢 （一）吸收 食物中的维生素C在小肠上段吸收，吸收方式是通过一种转运蛋白以主动转运为主，经被动扩散吸收量较少。维生素C的吸收率与摄入量有关，其吸收率随摄入量的增加而减少。维生素C的摄入量较低时几乎完全被吸收；摄入量30~200mg/d，吸收率为80%~100%；摄入量达500mg时，吸收率下降至75%左右；摄入量达1250mg/d时，吸收率下降至50%左右。 （二）分布 维生素C被吸收后迅速进入血压循环，分布在体内不同组织器官中。人体组织中，维生素C浓度以脑下垂体最高，其次是肾上腺、肾脏、脾脏和肝脏，胰腺和胸腺也存在一定量的维生素C，血浆和唾液中含量最低。当组织中的维生素C达到饱和后，多余的维生素C将从组织中排出。 维生素C能逆浓度梯度被转运至细胞内储存。人体内可有少量维生素C储存，健康人体代谢池内维生素C的含量一般在1200~2000mg，最多可达3000mg，总转换率是45~60mg/d。体内储存的维生素C大部分在细胞内，不同细胞的维生素C通常要比血浆高很多。体内维生素C的储存量随摄入量变化，但不成线性关系，在不连续摄入维生素C时，其在体内储存较少。 （三）排泄 维生素C及其代谢产物主要随尿排出，其次由汗和粪便排出。正常情况下，大部分维生素C在体内经代谢分解为草酸、2,3-二酮古洛糖酸或与硫酸结合生成抗坏血酸-2-硫酸有尿排出；一部分可直接有尿排出。尿中排除量受摄入量、体内储存量及肾功能影响。人体处于稳态时，维生素C摄入量在60~100mg/d，可以在尿中检测出维生素C的排出。摄入量＜60mg/d 时，尿中无维生素C排出。静脉注射高剂量维生素C500mg/d和1250mg/d时，绝大部分维生素C经尿排出（Levine et al.,2001）。 二、生理功能 （一）羟化作用
第十八章维生素 复习测试 （一）名词解释 1．维生素 2．维生素需要量 3．脂溶性维生素 4．水溶性维生素5．辅酶Ⅰ 6．辅酶Ⅱ 7．辅酶A 8．黄素酶 （二）选择题 A型题： 1．下列关于维生素的叙述正确的是： A．维生素是一类高分子有机化合物 B．维生素每天需要量约数克 C．B族维生素的主要作用是构成辅酶或辅基 D．维生素参与机体组织细胞的构成 E．维生素主要在机体合成 2．关于水溶性维生素的叙述错误的是： A．在人体内只有少量储存 B．易随尿排出体外 C，每日必须通过膳食提供足够的数量 D．当膳食供给不足时，易导致人体出现相应的缺乏症 E．在人体内主要储存于脂肪组织 3．关于脂溶性维生素的叙述错误的是： A．溶于脂肪和脂溶剂 B．不溶于水 C．在肠道中与脂肪共同吸收 D．长期摄入量过多可引起相应的中毒症 E．可随尿排除体外
4．有关维生素A的叙述错误的是：A．维生素A缺乏可引起夜盲症。B．维生素A是水溶性维生素 C．维生素A可由β-胡萝卜素转变而来 D．维生素A有两种形式，即A 1和A 2 E．维生素A参与视紫红质的形成 5．胡萝卜素类物质转为维生素A的转变率最高的是： A．α-胡萝卜素 B．β-胡萝卜素 C．γ-胡萝卜素 D．玉米黄素 E．新玉米黄素 6．关于维生素D的叙述错误的是： A．在酵母和植物油中的麦角固醇可以转化为维生素D 2 B．皮肤的7-脱氢胆固醇可转化为维生素D 3 C．维生素D 3的生理活性型是25-（OH）D 3 D．化学性质稳定，光照下不被破坏 E．儿童缺乏维生素D可引起佝偻病 7．下面关于维生素E的叙述正确的是： A．是6-羟苯骈二氢吡喃衍生物，极易被氧化B．易溶于水 C．具有抗生育和抗氧化作用 D．缺乏维生素E，可产生癞皮病
第十一章微生素 1.单项选择题 1)下面关于维生素A的叙述哪一个是错误的 A.维生素A异构体中,活性最高的是全反式结构。 B.维生素A醋酸酯的化学稳定性比维生素A高。 C.维生素A对光照稳定,但加热或重金属离子可促进氧化。 D.维生素A在食物中对热有一定稳定性。 E.维生素A及维生素A醋酸酯临床用于防止维生素A缺乏症。 C 2)目前发现的维生素A的几何异构体有 A.2个 B.4个 C.6个 D.8个 E.10个 C 3)下面关于核黄素的叙述哪项是错误的 A.化学名为7,8-二甲基-10-(D-核糖型-2,3,4,5-四羟基戊基)异咯嗪。 B.本品干燥时性质稳定,耐热性好,对大多数氧化剂稳定,但可被铬酸和高锰酸钾氧化。 C.本品是碱性化合物,溶于酸不溶于碱。 D.本品母核中N1和N5间有共轭双键,连二亚硫酸钠等强还原剂可生成不具荧光的二氢核黄素。 E.本品用于治疗维生素B2缺乏造成的唇炎、舌炎、脂溢性皮炎等。 C 4)维生素C的异构体有 A.2个 B.3个 C.4个 D.5个 E.6个 C 5)下列哪一项是VitB1的适应症 A.硫胺缺乏症 B.妊娠呕吐 C.放射病呕吐 D.异烟肼中毒 E.糙皮病 A 2.配比选择题
1) A.Vit B6 B.Vit D2 C.Vit E D.Vit B2 F.Vit C 1.又名:生育酚 2.又名:抗坏血酸 3.又名:核黄素 4.又名:骨化醇 5.又名:吡多辛 1.C 2.E 3.D 4.B 5.A 2) 下列维生素类药物的化学结构分别是 A. B. C. D. E. 1.维生素A1醋酸酯 2.维生素B1 3.维生素B6 4.维生素D2 5.维生素D3 1.A 2.D 3.E 4.C 5.B 3) A.维生素D2 B.维生素D3 C.维生素C D.维生素B1 E.维生素B2 1. 氯化-3-[(2-甲基-4-氨基-5-嘧啶基)甲基]-5-(2-羟基乙基)-4-甲基噻唑盐酸盐 2. L(+)-苏阿糖-2,3,4,5,6-五羟基-2-己烯酸-4-内酯 3. 7,8-二甲基-10-(D-核糖型-2,3,4,5-四羟基戊基)异咯嗪 4. 3β,5Z、7E-9,10-开链胆甾-5,7,10(19)-三烯 -3-醇 5. 3β、5Z、7E、22E、9,10-开链麦角甾-5,7,10(19),22-四烯-3-醇
《维生素B12注射液含量测定》项目教学设计方案 《维生素B12注射液含量测定》
项目教学案例：维生素B12注射液含量测定 一项目任务：维生素B12注射液含量测定 1 适用专业：中专药剂、检验专业 2 适用岗位： QC人员 3 学习时间：2课时 二教学设计的指导思想 在基础化学相关章节的学习中，学生已掌握了溶液的浓度及其计算、紫外-可见分光光度法、注射液含量计算等理论知识，具备了一定的实验操作技能，掌握了配制一定浓度的溶液、使用紫外-可见分光光度计测定溶液的吸收值等实验方法。但是他们对化学知识在职业岗位中的意义及应用方法缺乏正确的认识。我们选择该课题作为载体，通过项目教学法，培养学生将知识和技能与实际工作联系起来的思维习惯，以提高他们综合运用化学知识与技能完成实际工作的能力。采用以具体工作任务引领的项目教学,以职场实际操作为依据,满足相应职业资格要求，使学生在校期间就能掌握今后检验工作的方法、程序及要领，毕业后到企业工作能尽快进入岗位角色。 三项目教学目标： 根据学以致用的现代化学教育理念，职业教育以能力为本位、促进学生综合职业能力和发展能力的形成的改革方向，结合一线技能型人才的培养目标以及本课程的特点和优势，特制订以下目标。 1.知识与技能目标： 1）学会查阅所需检验药品的质量标准；
2）按照操作规程准确地配制一定浓度的溶液； 3）能够熟练地使用紫外-可见分光光度计测定物质溶液的浓度并进行含量测定的结果计算； 2.过程与方法目标： 1）注重对学生专业实作技能的培养，培养学生严谨、规范的操作；2）能运用理论知识解释操作过程； 3）使学生掌握工作思路与方法，培养学生观察、动手、发现和解决问题的能力以及独立与协作工作的能力； 3.情感与价值观目标： 1)学会自觉地以医药行业标准规范自己的工作行为； 2)培养学生认真负责的工作态度，科学、严谨的的工作作风，树立质量第一的原则； 四教学重点和难点 项目教学中以项目贯穿整个教学过程，因此项目是整个教学过程的主线，是能力形成的载体，是学生实践活动的对象，学生通过项目获得知识，提高技能，因此项目的选取与确定是关键。由于学生缺乏综合运用化学知识与技能完成实际工作的能力，对具体的项目往往不知如何下手，因此工作项目的分解也成为难点。 重点：（1）将工作项目分解为具体的工作任务； （2）分组完成各项工作。 难点：工作项目的分解。 五教学方法
第二章食品样品的采集与处理 一、选择题 3．可用“四分法”制备平均样品的是（ 1 ）。 （1）稻谷（2）蜂蜜（3）鲜乳（4）苹果 4．湿法消化方法通常采用的消化剂是（ 3 ）。 （1）强还原剂（2）强萃取剂（3）强氧化剂（4）强吸附剂8．用溶剂浸泡固体样品，抽提其中的溶质，习惯上称为（ 1 ）。 (1)浸提 (2)抽提 (3)萃取 (4)抽取 二、填空题 2．对于液体样品，正确采样的方法是。从样品的上、中、下分别取样混合均匀 3．样品预处理的目的、和。消除干扰因素、使被测组分浓缩、完整保留被测组分 5．样品预处理的常用方法有：、、、和。有机物破坏法、蒸馏法、溶剂提取法、色层分离法、化学分离法、浓缩法 6．按照样品采集的过程，依次得到、和等三类。检样、原始样品、平均样品 四、简答题 1．简述采样必须遵循的原则。 答：（1）采集的样品具有代表性； ⑵采样方法必须与分析目的保持一致； ⑶采样及样品制备过程中高潮保持原有理化指标，避免预测组分发生化学变化或丢失； ⑷要防止和避免预测组分的玷污； ⑸样品的处理过程尽可能简单易行。 6．为什么要对样品进行预处理？选择预处理方法的原则是什么? 答：在食品分析中，由于食品或食品原料种类繁多，组分复杂，而组分之间往往又以复杂的结合形式存在，常对直接分析带来干扰，这就需要在正式测定之前，对样品进行适当的处理，使被测组分同其他组分分离，或者将干扰物除去。有的被测组分由于浓度太低或含量太少，直接测有困难，这就需要对被测组分进行浓缩，这些过程称为样品的预处理。而且，食品中有些预测组分常有较大的不稳定性，需要经过样品的预处理才能获得可靠的测定结果。 样品预处理的原则是：（1）消除干扰因素；（2）完整保留被测组分；（3）使被测组分浓缩。 第四章食品的物理检测法 一、选择题 6．下列说法正确的是（ 1 ）。 （1）全脂牛乳相对密度为1.028—1.032（20/20℃） （2）不饱和脂肪酸的折射率比饱和脂肪酸的折射率小得多 （3）锤度计专用于测定糖液浓度，是以蔗糖溶液的密度百分含量为刻度，以°Bx 表示 （4）蜂蜡的折射率在1.4410～1.4430（25℃） 7．水色度的常用测定方法是（2 ）
饲料添加剂中七种水溶性维生素的检测 1.摘要 应用HALO柱，建立一种用反相高效液相色谱测定饲料添加剂中7种水溶性维生素的分析方法。方法采用HALO C18色谱柱（4.6×50 mm，2.7 μm），以乙腈－磷酸二氢钠缓冲溶液（pH=6.2）为流动相进行梯度洗脱，流速1.5 mL/min，检测波长200 nm，7种水溶性维生素在5 min内完成分离检测。测得维生素的检测限介于0.5×10-9 g/mL~1.0×10-8 g/mL之间(S/N>2)。回收率91%-115%。这一方法操作简便快速、准确可靠，适用于饲料中水溶维生素的测定。 2.关键词 反相高效液相色谱；水溶性维生素；HALO柱。 3.范围 本方法适用于饲料中水溶维生素的检测。 本方法适用于高效液相色谱法分析水溶性维生素。 本方法可测定7种维生素，包括烟酸、叶酸、维生素B1、维生素B2、维生素B5、维生素B6、维生素B12。 本方法测定各维生素最低检测限不高于1×10-8 g/mL。 4.规范性引用文件 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法。 5.定义 5.1维生素 维生素又名维他命，通俗来讲，即维持生命的物质，是维持生物体生命活动必须的一类有机物质，也是保持生物体健康的重要活性物质。维生素在体内的含量很少，但不可或缺。各种维生素的化学结构以及性质不同。 维生素是个庞大的家族，目前所知的维生素就有几十种，大致可分为脂溶性和水溶性两大类。 6.原理 样品经提取后，用反相高效液相色谱进行色谱分析，采用外标法定量。
7.试剂与材料 除非另有说明，所有试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的一级水。 7.1 乙腈：色谱纯 7.2 磷酸二氢钠：分析纯 7.3 磷酸氢二钠：分析纯 7.4 20 mM磷酸二氢钠缓冲溶液（pH=6.2）：精密称取磷酸二氢钠（NaH2PO4·12H2O）0.6625 g，磷酸氢二钠（Na2HPO4·2H2O）1.9070 g完全溶于500 mL水，以0.22 um水系滤膜过滤即得。 7.5 标准品：烟酸、叶酸、维生素B1、维生素B2、维生素B5、维生素B6、维生素B12，纯度均大于等于98%。 7.6 5种维生素标准储备液：分别称取烟酸10.0 mg、维生素B1 50.0 mg、维生素B5 20.0 mg、维生素B6 50.0 mg、维生素B12 100.0 mg标准品，分别置于100 mL棕色容量瓶中，加纯水溶解并定容即为水溶性维生素的标准品储备溶液，低温保存。 7.7 维生素B2标准储备液：称取维生素B2标准品50.0 mg，置于洁净小烧杯中，加500 ul 冰乙酸，补加少量纯水，沸水浴至完全溶解后冷却至室温，移至100 mL棕色容量瓶中。以纯水定容至100 mL即为维生素B2的标准储备溶液，低温保存。 7.8 叶酸标准储备液：称取叶酸标准品10 mg置于洁净小烧杯中，加0.10 mol/L磷酸氢二钠溶液10 ml溶解后移至100 mL棕色容量瓶中，以纯水定容至100 mL即为叶酸标准储备液，低温保存。 7.9 7种维生素混合标准溶液：分别精确量取烟酸标准储备液2.0 mL、叶酸标准储备液2.0 mL、维生素B1标准储备液0.8 mL、维生素B2标准储备液2.0 mL、维生素B5标准储备液2.0 mL、维生素B6标准储备液0.8 mL、维生素B12标准储备液0.4 mL置于10 mL容量瓶中混匀，即为7种维生素标准溶液。 7.9 微孔滤膜：0.22 μm水系 7.10 微孔滤膜：0.22 μm有机系 8.仪器与设备 8.1EasySep TM -1020型高效液相色谱仪（上海通微分析技术有限公司） 8.2FA1004型电子天平：感量0.1 mg 8.3AS5150A型超声波水浴（奥特赛恩斯仪器有限公司）
实验3 食品中维生素C含量的测定（2，6-二氯酚靛酚滴定法） 一、实验原理 维生素C又称抗坏血酸，还原型抗坏血酸能还原染料2，6-二氯酚靛酚钠盐，本身则氧化成脱氢抗坏血酸。 2，6-二氯酚靛酚的钠盐水溶液呈蓝色，在酸性溶液中呈玫瑰红色，当其被还原时就变为无色，因此，可用2，6-二氯酚靛酚滴定样品中的还原型抗坏血酸。当抗坏血酸完全被氧化后，稍多加一点染料，使滴定液呈淡红色，即为终点。如无其他杂质干扰，样品提取液所还原的标准染料量与样品中所含的还原型抗坏血酸量成正比。 二、试剂和器材 偏磷酸醋酸溶液：取15g（用时研细）溶于40mL醋酸及20mL水的混合液中，然后用水稀释至500mL，过滤后储入试剂瓶中。 标准2，6-二氯酚靛酚溶液：取0.25g2，6-二氯酚靛酚溶于700mL蒸馏水中（用力 搅动），加入300mL磷酸缓冲液（预先配制9.078g/L KH 2PO 4 -11.867g/L Na 2HPO 4 ·2H 2 O水溶液，用时以KH 2 PO 4 ：Na 2 HPO 4 ·2H 2 O=4：6的比率将其混合，pH 值为6.9-7.0），翌日过滤，滤液储于棕色瓶中，临用时，以抗坏血酸溶液标定。 标准维生素C溶液：以少量偏磷酸醋酸溶液溶解0.1g维生素C于100mL容量瓶中，再以该液稀释至刻度。 2，6-二氯酚靛酚液的标定：在3个100mL锥形瓶中，各置5mL偏磷酸醋酸液，再各加2mL标准维生素C溶液，摇匀。用上面所制的标准2，6-二氯酚靛酚液滴定，呈玫瑰红色保持30s不褪色为止。记下所用2，6-二氯酚靛酚溶液体积平均值，再以同样方法做一空白实验，取7mL偏磷酸醋酸液加水若干毫升（相当于以上所用的2，6-二氯酚靛酚溶液的低定量），仍用2，6-二氯酚靛酚溶液滴定。将第一次滴定的量减去空白实验的量，即为标准维生素的反应量，求出1mL 2，6-二氯酚靛酚对应于维生素C的质量（mg）。 研钵、容量瓶、剪刀、锥形瓶、微量滴定管 三、实验步骤 1、用自来水冲洗果蔬样品，再以蒸馏水清洗，用纱布或吸水纸吸干表面水分，然后
水溶性维生素检测分析的研究进展 摘要：维生素是维持生命活动必不可少的一类有机化合物，摄入不足或过量均可导致机体功能障碍，因其易在烹调、加工过程中损失，因此分析和评价食品和营养保健品中的维生素含量将对指导人群科学摄取维生素具有重要参考价值。水溶性维生素多为强极性化合物，其检测难度较大，因此系统介绍了微生物法、分光光度法、高效液相色谱法等水溶性维生素的检测方法，并针对多种水溶性维生素联合检测的高效液相色谱法，从同时提取、分离以及检测等方面进行综述，以期为今后开展水溶性维生素的高通量快速分析提供借鉴和参考。 关键词：水溶性维生素；联合检测；高效液相色谱法 维生素是一类人体不能合成或合成量不足、必须直接或间接从食品中摄取的化合物，广泛存在于谷类、果蔬、肉禽及蛋类等动植物细胞中。根据其溶解性差异，分为水溶性维生素（Water-soluble vitamins，WSVs）和脂溶性维生素（Fat-soluble vitamins，FSVs）。WSVs通常指极性较大，易溶于水的一类维生素，包括B族维生素、生物素（H）和抗坏血酸（VC）等。现已知WSVs具备多种生理生化功能。例如：B族维生素是多种辅酶的组成成分，参与有机体中的糖、脂肪、蛋白质及核苷酸的合成代谢；VC作为强氧化剂参与了氨基酸羟化反应和去除自由基等过程。目前已建立了单一WSV的检测方法[1-3]，现行分析方法（国标、欧盟指令条例和AOAC标准等）多数为微生物法、分光光度法，但这类方法耗时、费力，已难以满足当前分析要求和发展趋势。基于色谱技术的分析方法准确、快速、重现性好等特点，目前已在WSVs上得到了应用，高通量WSVs 检测方法已有报道，但由于WSVs结构各异，理化性质差异大，导致建立高通量的维生素前处理和检测方法难度较大，本研究将围绕相关进展进行评述，以期为开展相关工作提供参考。 1 微生物法 1889年Beijerinck首次发现酵母菌的生长与其生长环境中的某些营养成分存在对应关系，由Williams首次提出微生物测定维生素的构想，随后B族维生素的微生物法相继建立，并于20世纪50年代广泛地应用于食物、药剂和饲料等各类样品的分析[4-6]。尽管早期微生物法是分析WSVs的标准方法，但是该方法检测时间长、操作复杂，检测结果的相对不确定度达到±20%，而且还存在培养污染、菌株个体差异、样品基质影响菌株生长等[7]不确定性因素，导致方法重现性较差。基于上述原因，目前微生物法在常规WSVs分析中已基本淘汰。 2 光度法 光度法（Spectrophotometry）是继微生物法之后开发的一类方法，包括紫外分光光度法和分子荧光法等。这类方法一般是测定维生素或其衍生物在特定波长或激发光下的吸光度或发射光强度从而进行定性定量分析的一类方法。紫外分光
第十二章维生素 自测练习 一、单项选择题 12-1、下面哪一项叙述与维生素A不符 A. 维生素A的化学稳定性比维生素A醋酸酯高 B. 维生素A对紫外线不稳定 C. 日光可使维生素A发生变化，生成无活性的二聚体 D. 维生素A对酸十分稳定 E. 维生素A的生物效价用国际单位（IU）表示 12-2、在维生素E异构体中活性最强的是 12-3、说维生素D是甾醇衍生物的原因是 A. 具有环戊烷氢化菲的结构 B. 光照后可转化为甾醇 C. 由甾醇B环开环衍生而得 D. 具有甾醇的基本性质 E. 其体内代谢物是甾醇 12-4、维生素D在下列哪一项上与维生素的概念不符 A. 是维持人体正常代谢机能所必需的微量物质 B. 只能从食物中摄取，不能在体内合成 C. 不是细胞的一个组成部分 D. 不能供给体内能量 E. 体内需保持一定水平 12-5、维生素D3的活性代谢物为 A. 维生素D2 B. 1，25-二羟基D2 C. 25-（OH）D3 D. 1Α，25-（OH）2D3 E. 24，25-（OH）2D3 12-6、维生素C中酸性最强的羟基是 A. 2位羟基 B. 3位羟基 C. 4位羟基 D. 5位羟基 E. 6位羟基 12-7、维生素A2的生物效价为维生素A1的 A. 90% B. 70% C. 60% D. 50% E. 40% 12-8、在维生素E异构体中活性最强的是 A. α-生育三烯酚 B. β-生育三烯酚 C. α-生育酚 D. β-生育酚 E. γ-生育酚 12-9、维生素C有酸性，是因为其化学结构上有： A. 羰基 B. 无机酸根 C. 酸羟基 D. 共轭系统 E. 连二烯醇 12-10、下列哪一项叙述与维生素的概念不相符合
注射用水溶性维生素说明书 【药品名称】 通用名：注射用水溶性维生素 商品名：V佳林 英文名：Water-soluble vitamin for injection 汉语拼音：：Zhusheyong Shuirongxing Weishengsu 【成份】 1. 本品为复方制剂，每瓶中组分为：硝酸硫胺3.1mg ,核黄素磷酸钠4.9 m g,烟酰胺40mg,盐酸吡哆辛 4.9mg,泛酸钠16.5mg,维生素C钠113mg,生物素60μg,叶酸0.4mg,维生素B12 5.0μg,甘氨酸300mg,对羟基苯甲酸甲酯0.5mg,乙二胺四醋酸二钠0.5mg。 2. 辅料：盐酸半胱氨酸、甘氨酸、对羟基苯甲酸甲酯、乙二胺四醋酸二钠。 【性状】本品为淡黄色的疏松块状物或粉末。 【适应症】用于水溶性维生素缺乏的预防和治疗。 【规格】复方 【用法用量】 临用前，加灭菌注射用水适量使溶解，加入0.9%氯化钠注射液或5%或10%葡萄糖注射液中静脉滴注。成人以及体重10kg 以上小儿，一次量为1瓶；体重低于10kg 的儿童常用剂量为每公斤体重1/10瓶。 【不良反应】对本品中任何一种成分过敏的患者，对本品均可能发生过敏反应。 【禁忌症】对本品中任一成分有过敏的患者禁用。 【注意事项】 某些高危病人可发生过敏反应；本品加入葡萄糖注射液中进行输注时，应注意避光。【孕妇及哺乳期妇女用药】尚不明确。 【儿童用药】新生儿及体重不满10kg 的儿童，需按体重计算给药剂量。 【老年患者用药】尚不明确。 【药物相互作用】 1、本品所含维生素B6能降低左旋多巴的作用； 2、本品所含叶酸可降低苯妥英钠的血浆浓度和掩盖恶性贫血的临床表现； 3、维生素B12对大剂量羟钴胺治疗某些神经疾病有不利影响。 【药物过量】尚不明确。 【药理毒理】 本品是静脉营养的一部分，用以补充每日各种水溶性维生素的生理需要， 使机体各有关生化反应能正常进行。 【药代动力学】尚不明确。 【贮藏】遮光，严封，在15℃以下保存。 【包装】低硼硅玻璃管制注射剂瓶，注射用无菌粉末用卤化丁基橡胶塞；10瓶/盒。 【有效期】30个月。
要想维持人体正常生理活动，还需要维生素。 维生素是人体代谢中必不可少的有机化合物。人体有如一座极为复杂的化工厂，不断地进行着各种生化反应。其反应与酶的催化作用有密切关系。酶要产生活性，必须有辅酶参加。已知许多维生素是酶的辅酶或者是辅酶的组成分子。因此，维生素是维持和调节机体正常代谢的重要物质。可以认为，维生素是以“生物活性物质”的形式，存在于人体组织中。 维生素大部分不能在人体内合成，或者合成量不足，不能满足人体的需要。因而，必须从食物中摄取。 食物中维生素的含量较少，人体的需要量也不多，但却是绝不可少的物质。膳食中如缺乏维生素，就会引起人体代谢紊乱，以致发生维生素缺乏症。如缺乏维生素A会出现夜盲症、干眼病和皮肤干燥；缺乏维生素D可患佝偻病；缺乏维生素B1可得脚气病；缺乏维生素B2可患唇炎、口角炎、舌炎和阴囊炎；缺乏PP可患癞皮病；缺乏维生素B12可患恶性贫血；缺乏维生素C可患坏血病。 维生素是个庞大的家族，就目前所知的维生素就有几十种，大致可分为脂溶性和水溶性两大类。前者包括维生素A、D、E、K，后一类包括维生素B族和维生素C，以及许多“类维生素”。 现在医学上发现的维生素主要有： 脂溶性维生素 1.维生素A。维持正常视力，预防夜盲症；维持上皮细胞组织健康；促进生长发育；增加对传染病 的抵抗力；预防和治疗干眼病。 2.维生素D。调节人体内钙和磷的代谢，促进吸收利用，促进骨骼成长。 3.维生素E。维持正常的生殖能力和肌肉正常代谢；维持中枢神经和血管系统的完整。 4.维生素K。止血。它不但是凝血酶原的主要成分，而且还能促使肝脏制造凝血酶原。小儿维生素K 缺乏症 水溶性维生素 1.维生素B1。保持循环、消化、神经和肌内正常功能；调整胃肠道的功能；构成脱羧酶的辅酶，参 加糖的代谢；能预防脚气病。 2.维生素B2。又叫核黄素。核典素是体内许多重要辅酶类的组成成分，这些酶能在体内物质代谢过 程中传递氢，它还是蛋白质、糖、脂肪酸代谢和能量利用与组成所必需的物质。能促进生长发育，保护眼睛、皮肤的健康。 3.泛酸(维生素B5)。抗应激、抗寒冷、抗感染、防止某些抗生素的毒性，消除术后腹胀。 4.维生素B6。在蛋白质代谢中起重要作用。治疗神经衰弱、眩晕、动脉粥样硬化等。 5.维生素B12。抗脂肪肝，促进维生素A在肝中的贮存；促进细胞发育成熟和机体代谢；治疗恶性 贫血。 6.维生素B13（乳酸清）。 7.维生素B15（潘氨酸）。主要用于抗脂肪肝，提高组织的氧气代谢率。有时用来治疗冠心病和慢 性酒精中毒。 8.维生素B17。剧毒。有人认为有控制及预防癌症的作用。 9.对氨基苯甲酸。在维生素B族中属于最新发现的维生素之一。在人体内可合成。 10.肌醇。维生素B族中的一种，和胆碱一样是亲脂肪性的维生素。 11.维生素C。连接骨骼、牙齿、结缔组织结构；对毛细血管壁的各个细胞间有粘合功能；增加抗体， 增强抵抗力；促进红细胞成熟。 12.维生素P。 13.维生素PP(烟酸)。在细胞生理氧化过程中起传递氢作用，具有防治癞皮病的功效。 14.叶酸(维生素M)。抗贫血；维护细胞的正常生长和免疫系统的功能。
[作者简介] 崔蓉(1967-),女,副教授,主要从事食品及生物样 品中金属及有机物的测定。 【测定方法】水溶性维生素的高效液相色谱测定方法的研究 崔 蓉,李 皎,王洪玮 (北京大学公共卫生学院,北京 100083) [中图分类号] O65717+2 [文献标识码] A [文章编号] 1004-8685(2005)01-0055-03 水溶性维生素与人体的生长发育及健康密切相关。水溶 性维生素中又以维生素C及B族维生素较为重要。水溶性维 生素的测定方法主要包括荧光法[1]、微生物法[1]、高效液相色 谱法[2～6]等。本课题对维生素C、B1、B2、烟酸和烟酰胺的高效 液相色谱测定方法进行了研究,并采用该法对复合维生素制 剂和饮料中的上述5种水溶性维生素的含量进行了测定。 1 材料与方法 111 仪器与试剂 Waters高效液相色谱仪包括Waters1525Binary HPLC Pump;Waters717plus Autosampler;Waters2487DualλAb2 sorbance Detector。 抗坏血酸、磷酸二氢钾均为分析纯;盐酸硫胺、核黄素均 为生化纯;烟酸、烟酰胺均为化学纯;甲醇为色谱纯。 112 色谱条件 色谱柱:Waters Symmetry C18柱(416mm×150mm, 5μm);流动相:甲醇-磷酸二氢钾溶液(35+63)(p H=5111), 等度洗脱;柱温:室温;流速:0198ml/min;紫外检测波长: 265nm;进样量:10μl。 113 样品处理 11311 复合维生素片 取复合维生素片3片,精确称量,研 细。准确称取100mg研细的样品粉末置于烧杯中,加入 01001mol/L盐酸使其溶解,转移至100ml容量瓶中定容,室 温下水浴振荡10min,取上清液经0145μm针筒式微孔滤膜 过滤器过滤。 11312 饮料 移取一定体积的样品溶液,用01001mol/L盐 酸稀释定容至一定体积,经0145μm针筒式微孔滤膜过滤器 过滤。 2 结果与讨论 211 色谱条件的选择 21111 流动相离子强度的选择 已报道的文献中多以甲醇 -磷酸二氢钾体系作为流动相分析测定水溶性维生素。本课 题以甲醇-磷酸二氢钾溶液(25+75)为流动相,固定其它实 验条件不变,比较了0101mol/L、01025mol/L、0105mol/L3 种不同浓度的磷酸二氢钾溶液作流动相时维生素C、B1、B2和 烟酸4种水溶性维生素的分离效果。结果表明,01025mol/L 磷酸二氢钾溶液作流动相时,上述4种水溶性维生素分离较 好。 21112 流动相pH值的选择 本课题以甲醇-磷酸二氢钾溶 液(25+75)为流动相,固定其它实验条件不变,改变流动相的 pH值,比较了不同pH值对维生素C、B1、B2和烟酸4种水溶性 维生素分离的影响。结果表明,当流动相pH=5111时,上述4 种水溶性维生素分离较好。 21113 流动相配比及流速的选择 本课题以甲醇-磷酸二氢 钾溶液(pH=5111)为流动相,考察了不同的流动相配比及流速 对维生素C、B1、B2和烟酸4种水溶性维生素分离的影响。结果 表明,当甲醇-磷酸二氢钾溶液的配比为35+63,流速为 0198ml/min时,上述4种水溶性维生素色谱分离效果较好。 在上述已选定的色谱条件下,我们又考察了维生素C、B1、 B2、烟酸和烟酰胺5种水溶性维生素的分离情况。结果表明, 上述5种水溶性维生素在已选定的色谱条件下均可得到良好 分离,6min内即可完成分离测定。实验结果参见图1 。 图1 5种水溶性维生素分离色谱图 11维生素C;21烟酸;31烟酰胺;41维生素B1;51维生素B2
水乐维他(注射用水溶性维生素) 【药品名称】 商品名称：水乐维他 通用名称：注射用水溶性维生素 英文名称：Verapamil Hydrochloride T ablets 【成份】 本品主要成分为多种维生素，每1000瓶中组分为：硝酸硫胺3.1g ,核黄素磷酸钠4.9g,烟酰胺40g,盐酸吡哆辛4.9g,泛酸钠16.5g,维生素C钠113g,生物素60mg,叶酸0.4g,维生素B12 5.0mg,甘氨酸300g,乙二胺四醋酸二钠0.5g,对羟基苯甲酸甲酯0.5g。【适应症】 本品系肠外营养不可少的组成部分之一，用以满足成人和儿童每日对水溶性维生素的生理需要。 【用法用量】 大多数成人和体重在10公斤以上的儿童每日需要1瓶，体重不满10公斤的儿童，每日每公斤需要1/10瓶。本品可用10ml脂肪乳剂、注射用水或5%～50%葡萄糖液溶解，加入脂肪乳剂或%～50%葡萄糖液中静脉滴注。 【不良反应】 对本品中任何一种成分过敏的患者，对本品均可能发生过敏反应。 【禁忌】 对本品中任一成分有过敏的患者禁用。 【注意事项】 某些高敏病人可发生过敏反应。本品加入葡萄糖注射液中进行输注时，应注意避光。新生儿
及体重不满10kg的儿童，需按体重计算给药剂量。 【特殊人群用药】 儿童注意事项： 新生儿及体重不满10kg的儿童，需按体重计算给药剂量。 妊娠与哺乳期注意事项： 尚不明确。 老人注意事项： 未进行该项实验且无可靠参考文献。 【药物相互作用】 1 本品所含维生素B6能降低左旋多巴的作用。 2 本品所含叶酸可能降低苯妥英钠的血浆浓度和掩盖恶性贫血的临床表现。 3 维生素B12对剂量羟钴胺治疗某些神经疾病有不利影响。 【药理作用】 本品是静脉营养的一部分，用以补充每日各种水溶性维生素的生理需要，使机体各有关生化反应能正常进行。 【贮藏】 15°C以下避光保存。有效期2年半。 【有效期】 30个月 【批准文号】 国药准字H32023002 【说明书修订日期】
第七章维生素 一、填空 1、维生素D的缺乏症有、骨质软化症、和。 2、水溶性维生素包括和。 3、烟酸缺乏引起的“3D”症状包括、和。 4、谷类是膳食中族维生素的重要来源。 5、与胎儿“神经管畸形”形成密切相关的维生素是。 6、硫胺素缺乏引起的脚气病主要有、、急性暴发性脚气病三种类型。 7、硫胺素在条件下易被氧化失活，缺乏它易引。 8、当出现口角炎、口腔黏膜溃疡时，很可能与水溶性维生素缺乏有关。 9、维生素B2的化学名称为。 10、人体暗适应能力下降与缺乏相关。 11、维生素D缺乏症在成人表现为，在婴幼儿表现为。 二、选择 1、具有激素性质的维生素是。 A.维生素B1 B. 维生素B2 C. 维生素D D. 维生素PP 2、维生素B2缺乏体征之一是。 A.脂溢性皮炎 B.周围神经炎 C.“3D”症状 D.牙龈疼痛出血 3、含维生素C最多的蔬菜是。 A.大白菜 B.油菜 C.柿子椒 D.大萝卜 4、野果的营养特点是。 A.富含维生素C和胡萝卜素 B. 富含维生素B1 C. 富含维生素A和D D. 富含维生素E 5、豆芽中富含。 A.维生素E B.叶酸 C.维生素B D.维生素C 6、几乎不能通过乳腺，故母乳中的含量很低。 A.维生素A B.维生素B C.维生素C D.维生素D 7、婴幼儿佝偻病主要是由缺乏引起的。 A.维生素A B.维生素C C.维生素D D.硫胺素
8、增加维生素能作为亚硝酸化合物的阻断剂。 A.维生素A B.维生素B C.维生素C D.维生素D 9、下列哪种维生素具有抗氧化功能? A.维生素A B.维生素B2 C.维生素C D.维生素D 10、以下属于脂溶性维生素的选项是。 A.维生素B1、维生素B2 B.维生素A、维生素D C.维生素B1、维生素C D. 维生素E、维生素C 三、名词解释 1、维生素 2、食品添加剂 四、简答 (一)简述维生素的特点。 (二)简述维生素B1的生理功能 (三)简述维生素B2的生理功能 (四)简述维生素PP的生理功能。 (五)简述维生素B12的生理功能。 (六)简述如何预防维生素缺乏。
第三节水溶性维生素的测定 水溶性维生素B1、B2和C，广泛存在于动植物组织中，饮食来源充足，但由于它们本身的水溶性质，除满足人体生理、生化需求外，任何多余量都会从机体中排出。为避免缺乏，需要经常由饮食来提供。 水溶性维生素都易溶于水，而不溶于苯、乙醚、氯仿等大多数有机溶剂。在酸性介质中很稳定，既使加热也不破坏；但在碱性介质中不稳定，易于分解，特别在碱性条件下加热，可大部分或全部被破坏。它们易受空气、光、热、酶、金属离子等的影响；维生素B2对光，特别是紫外线敏感，易被光线破坏；维生素C对氧、铜离子敏感，易被氧化。 由于水溶性维生素具有上述特性，测定水溶性维生素时，一般都在酸性溶液中进行前处理。维生素B1、B2通常采用盐酸水解，或再经淀粉酶、木瓜蛋白酶等酶解作用，使结合态维生素游离出来，还可用活性人造浮石、硅镁吸附剂等进行纯化处理。 测定水溶性维生素常用高效液相色谱法、荧光法、比色法和微生物法等。 一、维生素B1的测定(荧光法，GB/T5009.84—2003) 维生素B1又名硫胺素、抗神经炎素，通常以游离态，或以焦磷酸酯形式存在于自然界。在酵母、米糠、麦胚、花生、黄豆以及绿色蔬菜和牛乳、蛋黄中含量较为丰富。动物组织不如植物含量丰富。 维生素B1在水中溶解度较大，在酸性溶液中较稳定，在碱性溶液中加热极易分解。 近年来对利用带荧光检测器的高效液相色谱测定法进行了许多研究，并应用于实际试样测定。这里我们主要介绍荧光法（参考GB/T 5009.84-2003食品中硫胺素(维生素B1)的测定） （一）荧光法 1．原理 试样在酸性溶液中加热，提取维生素B1，经蛋白分解酶处理，使维生素B1成为游离型。再经层析柱纯化，去除荧光淬灭物质，同时浓缩，用碱性铁氰化钾溶液将其氧化成硫色素，在紫外线下，硫色素发出荧光，再给定的条件下以及没有其他物质干扰时，此荧光之强度与硫色素量成正比即与溶液中维生素B1量成正比。如试样中含杂质过多，应经过离子交换剂处理，使硫胺素与杂志分离，然后以所得溶液做测定。 2．试剂 ⑴盐酸（0.1mol/L）：8.5mL浓盐酸（相对密度1.19或1.20）用水稀释至1000mL； ⑵盐酸（0.3mol/L）：25.5mL浓盐酸用水稀释至1000mL； ⑶乙酸溶液：30mL冰乙酸用水稀释至1000mL； ⑷氢氧化钠溶液（150g/L）：15g氢氧化钠溶于水中稀释至100mL； ⑸无水硫酸钠； ⑹乙酸钠溶液（2mol/L）：164g无水乙酸钠溶于水中稀释至1000mL； ⑺氯化钾溶液（250g/L）：250g氯化钾溶于水中稀释至1000mL； ⑻酸性氯化钾溶液（250g/L）：8.5mL浓盐酸用25%氯化钾溶液稀释至1000mL； ⑼1%铁氰化钾溶液（10g/L）：1g铁氰化钾溶于水中稀释至100mL。放于棕色瓶内保存； ⑽碱性铁氰化钾溶液：取4mL 10g/L铁氰化钾溶液，用150g/L氢氧化钠溶液稀释至60mL。用时现配，避光使用； ⑾正丁醇：需经重蒸馏后使用；