中山大学人类X染色质标本的制备与观察报告

人类X染色质标本的制备与观察

张皓予1533５20３

一、实验目的

1.掌握人体口腔黏膜上皮细胞制备的方法。

２、正确识别巴氏小体的特征及其所在位置。

3、说明人体细胞中核内Ｘ染色体的数目与性染色体数目之间存在的关系。

二、实验原理

Ｘ染色质呈现于女性体细胞间期细胞核内。在口腔黏膜细胞、羊水脱落细胞、皮肤结缔组织等细胞中均可检出。用苯酚品红改良染液染色后,便可观察到染色较浓,多位于核膜内侧缘,呈凸平形、卵圆形、扁平或三角形,直径约１μm大小的小体。女性细胞核中出现率为40％~60%。

Baｒr与Berｔｒam首先(1949)在雌性猫的神经细胞核中发现,在多数核中部有一个小的深染的小体,而在雄性猫的同样细胞中只能偶而观察到这种小体,此后许多人的研究指出这种与性别有关的两型现象在有袋类、偶蹄类、食肉类与灵长类等动物的多数组织细胞中存在,而在噬齿类中只在少数组织中可以观察到。这种染色质小体现在称为“性染色质”(sex ｃhｒomaｔin),或称为“巴氏小体”(Baｒｒboｄy)。这种小体常位于核膜的内表面,呈Fｅｕlｇe ｎ阳性反应,表明就是DNA的成分,有证据表明,性染色质的存在就是由于在雌性哺乳动物核中存在两个X染色体,其中一个X染色体处于失活状态。雄性个体只有一个X染色体。因此原则上男性不应有性染色质。但如果一个男人有XXY染色体,那就会有一个性染色质,虽然表现为男性。同样,ＸXＸ的三体应当有两个巴氏小体。因此,性染色质实质上就是一个失活的X 染色体。为什么失活的X染色体会以巴氏小体的形式显示出来？目前,已有许多证据证明,在雌性个体中那根失活的X染色体已经异染质化,成为功能性异染质。使用放射自显影的方法已经证明,失活的X染色体的固缩周期与其它染色体就是不同步的,它在S期就是晚复制的。此外,人们也已发现,晚复制的这根X染色体常位于核的边缘,这个位置也正好就是巴氏小体出现的位置。

三、实验仪器与试剂

１.仪器与用具

显微镜,水浴锅,牙签,载玻片,盖玻片,镊子,吸水纸。

2、试剂

95%乙醇,１ｍｏl/L盐酸,改良苯酚品红染色液

四、实验材料

男性与女性人体口腔黏膜细胞。

五、实验步骤

1、受检者用水漱口,用牙签刮取受检者口腔颊部黏膜,把第一次刮取物弃去,然后再次用牙签刮取黏膜,将第二次刮取物均匀涂布到干净的载玻片上,晾干。

2、将涂片放入95％的乙醇中固定２0min,取出晾干。

3、将涂片放入１M ＨＣl中３７摄氏度下水解2０ｍｉn,取出后自来水缓缓冲洗。

４、用改良品红染液染色８mｉn,不干燥,轻轻盖上盖玻片,用吸水纸盖住轻轻压片。

5、镜检,从低倍镜到高倍镜依次观察。

六、实验结果

图1、2、3 女性口腔上皮细胞被染色的细胞核与巴氏小体(箭头)

图4 男性口腔上皮细胞被染色的细胞核

如图１、2所示,可在染成淡紫色的女性上皮细胞细胞核的边缘较清楚地观察到一颗染色较深的小体,即巴氏小体。图3右下角的有一不明显的深色斑块,可能就是巴氏小体。

图4为染成紫色的男性上皮细胞细胞核,没有观察到明显的巴氏小体。

经观察男性、女性细胞个五十个发现:5０个女性细胞有2１个有巴氏小体,占4２%;50个男性细胞有0个有巴氏小体。

七、讨论

１、镜检时发现女性上皮细胞标本中的细胞数较少,密度低较分散(图3对比图４)。可能就是由于涂片时不够均匀,大部分涂在玻片边缘导致在后续固定、冲洗、染色、压片等步骤时有细胞流失。也有可能就是染色时间不够或者刮取细胞时刮得太少所致。

2、观察发现女性上皮细胞当中的巴氏小体形态多有些模糊,且染色较浅,可能就是由于染色时间较短导致。本实验染色时间为8min,后续实验可以适当延长染色时间(>10mｉn)以使实验效果更加明显。

八、思考题

1、男性没有巴氏小体的理论基础

为维持雌雄两性生物基因表达一致,细胞中存在一种剂量补偿效应,使细胞中只含有一份有活性的Ｘ染色体,而多余的染色体失活形成巴氏小体,雌性的两个X染色体所携带的两份基因的遗传效应即可与雄性一个X染色体所具有的一份基因的遗传效应基本相当。而由于男性本身就只有一条X染色体,所以不需要使多出的X染色体失活,从而也就没有巴氏小体。

２、男变女的变性手术后,该女性有无巴氏小体?

没有,因为变性手术只就是改变了个体的外在表型如个别器官的形状与功能等,不能改变其细胞内染色体的构成,故该个体仍只有一条X染色体,不可能形成巴氏小体。

3、鉴定巴氏小体有什么临床意义?

巴氏小体的临床意义在于能够用来鉴别性别。例如可以通过对胎儿羊水中取得的脱落的细胞的检查判断性别,如有巴氏小体,胎儿为女性,如果细胞中无巴氏小体,胎儿为男性。原男性变性运动员参加女子项目,可通过检查其白细胞中有无巴氏小体而确定其性别。

通过巴氏小体检查可确定胎儿性别与查出性染色体异常的患者,如克氏(Kｌineｆｅlｔer′s)综合征患者外貌为男性,但有一个巴氏小体,可判定患者的核型就是47,XXY;而外表为女性的特纳氏(Turnｅr＇s)综合征患者却无巴氏小体,故判断患者的核型就是45,XO。其她性染色体异常的患者如XＸY、XXＹＹ有1个巴氏小体,而ＸXX、XＸXY有2个巴氏小体等。