重组质粒的酶切鉴定及PCR实验
一、【实验目的】
1、酶切鉴定重组质粒插入片段的大小；
2、学习和掌握PCR反应的基本原理和操作技术，了解引物设计的基本要求。
二、【实验原理】
1、PCR反应基本原理
PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物
结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环变性--退火--延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的
基因扩增放大几百万倍。
PCR反应原理图
2、PCR反应体系与反应条件
(1) 标准的PCR反应体系
①PCR反应的缓冲液提供合适的酸碱度与某些离子
②镁离子浓度总量应比dNTPs的浓度高，常用1.5mmol/L
③底物浓度 dNTP以等摩尔浓度配制，20～200umol/L
④TaqDNA聚合酶 2.5U(100ul）
⑤引物浓度一般为0.1 ～ 0.5umol/L
⑥反应温度和循环次数
变性温度和时间95℃，30s
退火温度和时间低于引物Tm值5 ℃左右，一般在45～55℃
延伸温度和时间72℃，1min/kb(10kb内）
Tm值=4(G+C) +2(A+T)
循环次数：一般为25 ～ 30次。循环数决定PCR扩增的产量。模板初始浓度低，可增加循环数以便达到有效的扩增量。但循环数并不是可以无限增加的。一般循环数为30个左右，循环数超过30个以后，DNA聚合酶活性逐渐达到饱和，产物的量不再随循环数的增加而增加，出现了所谓的“平台期”。
3、PCR的循环参数
(!)预变性（Initial denaturation）
模板DNA完全变性与PCR酶的完全激活对PCR能否成功至关重要，建议加热时间参考试剂说明书，一般未修饰的Taq酶激活时间为两分钟。
（2）循环中的变性步骤
循环中一般95℃，30秒足以使各种靶DNA序列完全变性，可能的情况下可缩短该步骤时间。变性时间过长损害酶活性，过短靶序列变性不彻底，易造成扩增失败。
（3）引物退火（Primer annealing）
退火温度需要从多方面去决定，一般根据引物的Tm值为参考，根据扩增的长度适当下调作为退火温度。然后在此次实验基础上做出预估。退火温度对PCR 的特异性有较大影响。
（4）引物延伸
引物延伸一般在72℃进行（Taq酶最适温度）。但在扩增长度较短且退火温度较高时，本步骤可省略。延伸时间随扩增片段长短而定，一般推荐在
1000bp以上，含Pfu及其衍生物的衍生设定为1min/kbp。
（5）循环数
大多数PCR含25-40循环，过多易产生非特异扩增。
（6）最后延伸
在最后一个循环后，反应在72℃维持5-15分钟．使引物延伸完全，并使单链产物退火成双链。
三、【实验步骤】
1、重组质粒的酶切、电泳检测
（1）按下表进行加样后置于37℃水浴锅中反应1h
（2）将酶切后的片段全部（即上述10ul）点样进行琼脂糖凝胶电泳鉴定2、PCR扩增
（1）PCR反应体系如下
1、酶切电泳结果图
DL 5000 DNA markeλDNA/HindⅢ
分析:第一泳道:pUC19/ HindⅢ;
第二泳道：λDNA/HindⅢ；
第三、五、七、九、十一、十三泳道分别为第一、二、三、四、五、六组同学提取的未酶切的重组质粒；
第四、六、八、十、十二、十四泳道分别为第一、二、三、四、五、六组同学的酶切的重组质粒；
第十五泳道：λDNA/HindⅢ
第十六泳道：DL 5000 DNA marker
我在第一组，第三泳道为我组的未酶切的重组质粒，第四泳道为酶切的重组质粒，由图可见两条明亮的带，从上往下依次为带一、带二。其中带一与第一泳道pUC19/ Hind Ⅲ中最亮的那条带平齐，可判断带一为线性pUC19，则带二为插入片段，且与第二泳道λDNA/HindⅢ中第五条带平齐，于是可确定插入片段大小为
2322bp。
第十七至第二十二泳道为某三个小组的第二个重组子样品及相应的酶切片段。以第十八泳道为例，从上而下依次出现三条带，最亮的那条带与线性pUC19带平齐，判断为重组质粒被酶切出来的载体DNA，即pUC19,亮带下方不远那条带与未酶切的重组质粒在一水平线上，易知其为未被酶切的重组质粒，推知酶切体系中可能酶液加量不够，或酶切反应时间不够。十八泳道最下方的那条较暗的带则为插入片段，将它与DL 5000 DNA marker对比可知其大小在100-250之间，对比λDNA/HindⅢ
酶切图谱可知这个插入片段即为λDNA/HindⅢ酶切开的其中大小为125bp的片段。
2、PCR反应产物电泳结果图
分析：第一泳道：师姐扩增的模版；
第二、十五、二十泳道：DL 5000 DNA marker；
第三至第十四泳道：第1——12组同学的以老师所提供模版的PCR产物；
第十六至十九泳道：第10、12、5、7组第二个样品。
我在第1组，本组的PCR产物点在第三泳道，由图可见一条很明亮的带，此带与第一泳道样品带平齐，说明我们成功地扩增了老师的模版，此模板在DL 5000 DNA marker第六条带稍下方，可判断其大小在500-750bp之间。因为此模板为
λDNA/HindⅢ酶切片段，且PCR引物大小为150bp,于是可确定模版和PCR产物大
小为564bp+150bp=714bp。其它几条亮度较暗的条带则可能为非特异性扩增产物。
第十六至第十九泳道中条带较多，但它们的最亮的那条带大致平齐，可判断最亮的那条带是以他们的插入片段为模版特异性扩增的产物，将它们与DL 5000 DNA marker对比可知它们的大小略大于250bp,而引物大小为150bp，据此判断模
版大小为125bp，即这些组同学们的插入片段大小为125bp，于是这些扩增产物大
小为125bp+150bp=275bp。而其它的亮度较暗的条带则可判断为非特性扩增产物。
