细菌的芽孢染色
一．实验目的
1．学习并掌握细菌的芽孢染色法。
2．了解并观察细菌芽孢的结构和形态。
3. 巩固显微操作技术及无菌操作技术
二．实验原理
芽胞是芽孢杆菌属和梭菌属细菌生长到一定阶段形成的一种抗逆性很强的休眠体结构，又称内生孢子，通常为圆形或椭圆形。能否形成芽孢及芽孢的形状、芽孢在孢囊的位置、芽孢囊是否膨大等特征是细菌分类的重要依据之一。芽胞壁厚，透性低，不易着色，一般染色法只能使菌体着色而芽胞不着色（芽胞呈无色透明状），但芽胞一旦着色后就很难被脱色。
芽胞染色法：根据芽胞特点设计，除了用着色力强的染料外，还需要加热，以促进芽胞着色。当染芽胞时，菌体也会着色，然后水洗，芽胞染上的颜色难以渗出，而菌体会脱色。然后用对比度强的染料对菌体复染，使菌体和芽胞呈现出不同的颜色，因而能更明显地衬托出芽胞，便于观察。
三．实验器材
1．菌种：枯草芽孢杆菌（芽孢位于菌体中央）、梭状芽孢杆菌（中部膨大）。
2．溶液和试剂：5%孔雀绿水溶液、0.5%番红水溶液、乙醚、香柏油、蒸馏
水、95%乙醇。
3．器材：显微镜、接种环、酒精灯、载玻片、擦镜纸、吸水纸、双层瓶等。
四．实验步骤
1．制片
取一块载玻片，在中央滴一滴蒸馏水，用接种环无菌操作从枯草芽孢杆
菌（梭状芽孢杆菌)斜面上挑数环菌置于载玻片液滴上，小液滴呈混浊状
即可。并按常规方法干燥、固定（每隔几秒在酒精灯火焰上过一遍）。
2．加热染色
向载玻片滴加数滴5%孔雀绿水溶液覆盖涂菌部位，用夹子夹住载玻片在
微火上加热至染液冒蒸汽（此时开始计时）并维持5min，加热时注意补
充染液，切勿让涂片干涸。
3．脱色
带玻片冷却后，用缓流自来水冲洗至流出水无色为止。
4．复染
用0.5%的番红水溶液复染2min。
5．水洗
用缓流自来水冲洗至流出水无色为止，室温下自然干燥。
6．镜检
带载玻片自然干燥后（可在酒精灯火焰上每隔几秒过一遍），先低倍镜后
高倍镜最后油镜镜检，观察芽孢的形态并绘图。
五．实验结果记录
枯草芽孢杆菌10×100（油镜）
梭状芽孢杆菌10×100（油镜）
表一细菌形态记录表
六．思考题
1．为什么芽孢染色法需要进行加热？能否用简单染色法观察到细菌芽孢？
答:因为与正常细胞或菌体相比，芽孢壁厚，通透性低而不易着色，而加热时芽孢壁的通透性变高，此时染液可以进入芽孢从而使芽孢着色。
简单染色法不能使芽孢着色，而能使菌体着色，此时可以看到透明状
的芽孢，所以能用简单染色观察到细菌芽胞，但看到的芽孢不清晰、
不明显。。
2．若在你的制片中仅看到游离芽孢，而很少看到芽孢囊和营养细胞，试分析原因。
答：如果只看到芽孢，可能是：
（1）菌种培养的环境太恶劣了，营养体几乎都变成芽孢了。
（2）可能是给芽孢染色后，用水洗时染料没洗干净，细胞还是孔雀绿的色彩。
（3）复染出现问题了，可能是复染时间不够，没染上，或是水洗的太厉害，把复染液都冲走了。
3．用孔雀绿初染芽孢后，为什么必须等玻片冷却后再用水冲洗？
答：如果直接将热的玻片放到水下冲洗，可能会导致玻片骤然受冷而破裂。
高氏I号培养基的制备：
高氏I号培养基配方
配制时，先用少量冷水，将淀粉调成糊状，再倒入煮沸的水中，在火上加热，边搅拌边加入其它成分，溶化后，补足水分至200ml。121摄氏度灭菌20min。
