细菌的芽孢染色

实验四细菌的革兰氏染色与芽孢染色一、目的要求1.学习并初步掌握细菌的革兰氏染色法。

2.了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性。

二、实验材料1.菌种：金黄色葡萄球菌（StapHylococcus aureus）大肠杆菌（E.coli）2.试剂：草酸铵结晶紫、路哥氏碘液、95%乙醇、番红液3.其他：显微镜、载玻片、接种环、酒精灯、无菌水、香柏油、二甲苯等。

三、实验原理革兰氏染色法是细菌学中最重要的鉴别染色法。

是1884年由丹麦病理学家Christain Gram创立的。

通过革兰氏染色可把细菌区分为两大类。

革兰氏染色的基本步骤：先用结晶紫初染、次经碘液媒染、再用95%乙醇脱色、最后用蕃红复染。

经过此法染色后，细胞保留初染剂蓝紫色的细菌为革兰氏阳性菌；如果细胞染上复染的红色的细菌为革兰氏阴性菌。

大肠杆菌是标准的革兰氏阴性菌，金黄色葡萄球菌是标准的革兰氏阳性菌。

革兰氏染色的机理，与细菌细胞壁的化学组成和结构有关。

经结晶紫初染以后，所有的细菌都被染成蓝紫色。

碘作为媒染剂，它能与结晶紫结合形成复合物，从而增强了染料与细菌的结合力。

当用乙醇脱色时，两类细菌的脱色效果是不同的，革兰氏阳性细菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成、壁厚、类脂含量低，用乙醇脱色处理时细胞壁脱水、使肽聚糖层的网状结构孔径缩小，透性降低，从而使结晶紫-碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内；革兰氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖层在内层且较薄、类脂含量高，所以当脱色处理时，类脂被乙醇溶解、细胞壁透性增加，使结晶紫-碘的复合物被洗脱出来。

用蕃红复染时染上红色。

四、操作步骤1.细菌的活化：将细菌接种营养琼脂斜面，培养约24h。

2.制片：取菌种培养物常规涂片、干燥、固定。

3.初染：于制片上滴加结晶紫染液，染色1min后，用水洗去剩余染料。

4.媒染：用碘液冲去残水，并用碘液覆盖约1min，水洗。

5.脱色：用滤纸吸去玻片上的残水，将玻片倾斜，在白色背景下，直接用95%乙醇从载玻片上端冲洗脱色，直到流下的酒精无明显的紫色时，立即水洗。

芽孢染色法的原理
芽孢染色法是一种用于检测和鉴定芽孢形成菌类的常用方法。

其原理基于芽孢的特殊结构和反应性。

首先，芽孢是一种形成于某些细菌和真菌细胞内的一种耐受性很高的休眠状态。

在适当条件下，芽孢可以在短时间内释放，使其周围环境进行细胞增殖。

这一特性使得芽孢成为了一种理想的适应生存环境恶劣的细菌的策略，也使得芽孢形成菌类在食品、环境和医疗等领域的检测工作中具有重要意义。

芽孢染色法的目的就是通过染色方法将芽孢从其他细胞和杂质中区分开来，并使其能够进行清晰可见的观察。

其中最常用的芽孢染色方法包括热染法、抗酸染色法和国际染色法等。

热染法是基于芽孢对高温的特殊耐受性，通过将样本加热到大约80-90℃，使其他非芽孢细胞受到破坏和溶解，而芽孢则保持完整且可染色。

一般使用石碱溶液对样品进行染色，然后使用显微镜观察。

抗酸染色法是通过将样品加入酸性以及带有对比染色剂的染色液中进行染色，然后使用显微镜观察。

正常的细胞会被酸性环境破坏，而芽孢则能够在酸性环境下存活并保持染色。

最常用的抗酸染色方法是梅尔候特染色法。

国际染色法则是通过将芽孢样品加入固定剂中，使其固定在载玻片上，然后使用Grocott染色进行处理。

这种染色法的优点是可清晰显示芽孢内部的结构，并能够区分不同种类的芽孢形
成菌类。

综上所述，芽孢染色法利用了芽孢的特殊结构和反应性，通过不同的染色方法能够使芽孢与其他细胞和杂质进行区分，并能够进行清晰可见的观察和鉴定工作。

芽孢染色法的原理芽孢染色法，又称核酸染色法，是一种用于细菌和真菌的鉴定、分类和研究的常用技术。

芽孢染色法是一种使用有机染料的染色试验，其最大的特点是在无氧的环境中，如直接打开封闭瓶中染料液，或放置在非活性氣氛中，或加入抑制芽孢形成的剂量，就能有效阻抑细菌的芽孢形成，在残存的芽孢附近观察到明亮的染料色彩，而死芽孢则不显色，以此做为鉴定细菌芽孢形态特征的主要依据。

基本原理芽孢染色法的基本原理是细菌或真菌的芽孢在只要添加一些特定的有机染料，就会显示出特殊的颜色，而这种有机染料可以准确识别出对细菌或真菌的形态和生理特性，从而将不同的菌株区分开来，鉴定出菌体中的特定抗体类型。

比如，品尔梅斯染料可以用于染色结构紊乱，不稳定或不典型囊杆菌纲下（如普萤氏菌）等。

使用方法自从1897年芽孢染色法最初被提出以来，芽孢染色法一直都是最为受推崇的染色技术，它也可以被应用于更多种的菌株，也可以染出更加精确的芽孢形态特征和胞壁结构特征。

一般来说，芽孢染色的过程应该包括三个步骤：芽孢形成、染色和观察。

第一步：芽孢形成芽孢形成是一个关键步骤，用于制备样品，它是染色显色的前提：首先在染色板上用刮刀将所需观察的样品刮成大小末，然后将其加入恒定温度的热水池中温度维持37℃，为细菌的芽孢形成提供了良好的条件，在细菌的芽孢发育到一定的成熟时芽孢就会出现在细菌附近；然后用冻结剂或影响其芽孢形成的所有其他因素冻结细菌的芽孢形态，使其保持原样，以便染色和观察。

第二步：染色在细菌芽孢形成之后，即可进行染色，将特定的有机染料溶液（如品尔梅斯染料）加入细菌芽孢上，染红色，将芽孢完全包被，涂上一层薄膜，以使芽孢变得显著，而无芽孢的细菌则没有任何色彩变化。

第三步：观察在染色后，细菌芽孢的形态和特征就会变得十分明显，可以明亮的颜色就可以观察出来，这时就可以观察芽孢的数量、形状、分布和相互间的排列，这些芽孢的特性它可以用来鉴别和识别细菌的种类。

应用芽孢染色法的实际多是为了鉴定和诊断实现而设计的，芽孢染色法在病毒和细菌的鉴定检测中非常重要，可用来染出大量芽孢，有效鉴定出某些细菌的病原性和抗性。

细菌的荚膜染色、芽孢染色及其运动性观察实验报告马子午生命科学学院食品科学与工程专业 14101班 02号1.引言1.1实验目的学习荚膜染色技术，观察和分辨细菌的荚膜形态，进一步理解细菌细胞的特殊结构；了解细菌芽孢染色的原理意义，掌握芽孢染色的方法。

学习水浸片的制作方法，观察细菌的运动。

1.2实验原理芽孢染色法：芽孢具有厚而致密的壁，通透性低，对各种不利因素如高温、冷冻、射线、干燥、化学药品和染料等具有很强的抵抗力。

因此，当用一般染色方法染色时，只能使菌体着色，芽孢不易着色（芽孢呈透明）或仅显很淡的颜色。

威力使芽孢着色便于观察，需采用特殊染色法——芽孢染色法。

先用一弱碱性染料，如孔雀绿或碱性品红在加热条件在进行长时间染色，此染料不仅可以进入菌体，也可以进入芽孢，进入菌体的染料可经睡洗脱掉，而进入芽孢的染料则难以透出。

若再用复染液（如番红染液）或衬托染液（如黑色素液）处理，芽孢和菌体就呈现不同的颜色，借此将芽孢与菌体区别开。

荚膜染色法：荚膜的主要成分是多糖，多糖与染料亲和力差，不易着色，但荚膜通透性较好，某些染料可通过荚膜使菌体着色，正因如此，染色后呈浅色或无色的菌体就形成了一个明显的色差，荚膜染色常采用负染法，即将背景染成淡蓝色，此法使菌体和背景显色以衬托无色的荚膜。

细菌的运动性观察：细菌是否具有鞭毛是细菌分类鉴定的主要特征之一，因鞭毛较细，在普通光学显微镜下不易观察，但有鞭毛的细菌在液体中能借助鞭毛的旋转和摆动使菌体能定向的运动，可以借此判断细菌是否有鞭毛。

2.材料与方法2.1材料与试剂枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），孔雀绿，番红染液，无菌水，6%的葡萄糖，胶质芽孢杆菌（Bacillus mucilaginosus），黑色素液，甲醇，甲基紫染液，香柏油，二甲苯。

2.2仪器与设备显微镜，载玻片，盖玻片，酒精灯，接种环，镊子，试管，凹玻片，擦镜纸，吸水纸。

2.3方法与步骤2.3.1细菌的芽孢染色法取一支试管，滴一滴无菌水，用接种环取2~3环枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）充分混合成菌悬液，再滴加两滴孔雀绿，沸水浴15~20分钟后用接种环取3~5环菌悬液涂抹在载玻片上，自然干燥，固定，冷却后水洗至水流无色，用吸水纸吸干后滴加番红染液复染5分钟，用吸水纸吸干多余染料，在显微镜下镜检。

实验五——细菌芽孢染色山东大学生命科学学院09级四班张行润200900140177 摘要细菌的芽孢具有厚而致密的壁，透性低，不易着色，若用一般染色法只能使菌体着色而芽孢不着色（芽孢呈无色透明状）。

芽孢染色法就是根据芽孢既难以染色而一旦染上色后又难以脱色这一特点而设计的。

所有的芽孢染色法都基于一个原则：除了用着色强的染料外，还须要加热，以促进芽孢着色，再使菌体脱色，而芽孢上的染料则难以渗出，故仍保留原有的颜色，然后用对比度强的染料对菌体复染，使菌体和芽孢呈现出不同的颜色，因而能更明显地衬托出芽孢，便于观察。

关键词芽孢（gemma of a fungus）芽孢染色法（Spore staining）复染（counterstain）前言细菌的芽孢的某些细菌的特殊结构。

芽孢是某些细菌生长到一定阶段在体内形成的一个圆形或椭圆形的休眠体，它对不良环境具有很强的抗性。

在合适条件下，可吸水萌发，重新形成一个新的菌体。

芽孢的大小、形状及其在菌体内的位置是鉴定细菌的重要依据。

在一般实验室中通常用芽孢染色法来观察其形态。

此外，由于芽孢具有很强的抗性，因此在生产实践中都以是否有杀死抗性最强的芽孢来评定高温灭菌及某些化学杀菌剂的效果。

一、实验目的1.学习并掌握芽孢染色法2.了解芽孢杆菌的形态特征3.巩固显微镜操作技术及无菌操作技术二、实验原理芽孢是芽孢杆菌属和梭菌属细菌生长到一定阶段形成的一种抗逆性很强的休眠体结构，液被称为内生孢子，通常呈圆形或椭圆形。

细菌能否形成芽孢及芽孢的形状，着生位置、芽孢囊是否膨大等特征都是鉴定细菌的重要指标。

与正常细胞或菌体相比，芽孢壁厚、透性低而不易着色，但是芽孢一旦着色就很难被脱色。

利用这一特点，首先用着色能力较强的染料，如孔雀绿（malachite green）或碱性品红（basicfuchsin）在加热条件下进行染色时，此染料不仅可以进入菌体，而且也可以进入芽孢，进入菌体的染料可经水洗脱色，而进入芽孢的染料则难以透出。

细菌的芽孢染色姓名：俞华军班级：09生科三班学号：200900140157 日期：2010/10/29 组别：四同组者：谢英健余振洋岳永胜张刚刚一．实验目的1．学习并掌握细菌的芽孢染色法。

2．了解并观察细菌芽孢的结构和形态。

二．实验原理芽胞又称内生孢子，能否形成芽孢及芽孢的形状、芽孢在孢囊的位置、芽孢囊是否膨大等特征是鉴定细菌的依据之一。

芽胞壁厚，透性低，不易着色，一般染色法只能使菌体着色而芽胞不着色（芽胞呈无色透明状），而一旦染上色后又难以脱色。

芽胞染色法：根据芽胞特点设计，除了用着色力强的染料外，还需要加热，以促进芽胞着色。

当染芽胞时，菌体也会着色，然后水洗，芽胞染上的颜色难以渗出，而菌体会脱色。

然后用对比度强的染料对菌体复染，使菌体和芽胞呈现出不同的颜色，因而能更明显地衬托出芽胞，便于观察。

三．实验器材1．菌种：枯草芽孢杆菌（芽孢位于菌体中央）、梭状芽孢杆菌（中部膨大）。

2．溶液和试剂：5%孔雀绿水溶液、0.5%番红水溶液、二甲苯、香柏油、蒸馏水、95%乙醇。

3．器材：显微镜、接种环、酒精灯、载玻片、盖玻片、擦镜纸、吸水纸。

四．实验步骤1．制片取一块载玻片，在中央滴一滴蒸馏水，用接种环无菌操作从枯草芽孢杆菌（梭状芽孢杆菌)斜面上挑数环菌置于载玻片液滴上，小液滴呈混浊状即可。

并按常规方法干燥、固定（每隔几秒在酒精灯火焰上过一遍）。

2．加热染色向载玻片滴加数滴5%孔雀绿水溶液覆盖涂菌部位，用夹子夹住载玻片在微火上加热至染液冒蒸汽（此时开始计时）并维持5min，加热时注意补充染液，切勿让涂片干涸。

3．脱色带玻片冷却后，用缓流自来水冲洗至流出水无色为止。

4．复染用0.5%的番红水溶液复染1.5min。

5．水洗用缓流自来水冲洗至流出水无色为止。

6．镜检带载玻片自然干燥后（可在酒精灯火焰上每隔几秒过一遍）油镜镜检，观察芽孢的形态并绘图。

五．实验结果记录枯草芽孢杆菌10×100（油镜）梭状芽孢杆菌10×100（油镜）表一细菌形态记录表六．思考题1．为什么芽孢染色法需要进行加热？能否用简单染色法观察到细菌芽孢？答:因为与正常细胞或菌体相比，芽孢壁厚，通透性低而不易着色，而加热时芽孢的通透性高，此时染液可以进入从而使芽孢着色，而简单染色法不能使芽孢染色，所以不能看到。

实验三细菌芽孢及荚膜染色观察细菌芽孢和荚膜是细菌的两种重要结构，它们具有重要的生理功能和防御性质。

在本实验中，我们将使用适当的染色方法观察细菌芽孢和荚膜的形态和结构。

通过观察和比较不同菌株的芽孢和荚膜的特点，我们可以更好地理解细菌的生理和生态适应策略。

实验材料：1.细菌培养物2.荚膜染色试剂盒3.芽孢染色试剂盒4.无菌玻璃片和盖玻片5.显微镜6.消毒剂7.实验耗材：移液器、离心管、无菌培养皿等实验步骤：1.细菌培养：选择想要观察的菌株，将其接种到含有适宜培养基的无菌培养皿中，并进行孵育。

注意控制培养条件，如温度、pH值和营养成分等。

2.收获菌液：在适宜生长阶段（对于芽孢形成菌株为静止期）时，采集菌液至离心管中。

3.芽孢染色：将适宜量的菌液滴于无菌玻璃片上，使之均匀分布，然后用火焰或消毒剂灭菌。

接下来，按照芽孢染色试剂盒的说明书进行染色，一般会采用目前常用的热染法。

4.荚膜染色：将适宜量的菌液滴于无菌玻璃片上，使之均匀分布，然后用火焰或消毒剂灭菌。

接下来，按照荚膜染色试剂盒的说明书进行染色，一般会采用耐热酸性颜料法。

5.观察和记录：将染色玻片放在显微镜下，用低倍镜首先寻找目标，然后切换到高倍镜仔细观察和记录芽孢和荚膜的形态和结构特点。

6.分析和比较：根据不同菌株的观察结果，比较芽孢和荚膜的数量、形态和结构特点。

同时，可以观察不同菌株的生长状态、产芽孢和释放芽孢的时间等生理特点。

实验注意事项：1.实验操作要求严格遵守无菌技术，以防止外源性污染。

2.在染色过程中，注意使用适当的染色剂和工具，并按照说明书的要求进行操作。

3.在显微镜下观察时，调整光源和焦距，以获得清晰的观察结果。

4.在记录观察结果时，要准确描述芽孢和荚膜的形态和结构特点，并尽量进行定量比较分析。

5.在实验结束后，要及时清理实验用具和消毒实验台面，以防止细菌的扩散和传播。

总结：通过本实验，我们可以通过适当的染色方法观察细菌芽孢和荚膜的形态和结构，并且比较不同菌株之间的差异。

芽孢染色的注意事项芽孢染色是一种常用的实验方法，用于观察和鉴定微生物中的芽孢形态和结构。

下面是关于芽孢染色的注意事项。

首先，要注意实验室的卫生和安全。

在进行芽孢染色实验时，应确保工作区域和操作台面清洁。

必须穿戴实验室必需的个人防护装备，如实验手套和眼镜。

同时，要遵守微生物实验室的安全操作规程，避免微生物的意外释放和传播。

其次，选择适当的培养基和培养条件。

根据需要染色的芽孢类型，选择适合的培养基，如肉蔻胰蛋白琼脂培养基、营养琼脂培养基等。

同时，确定适宜的培养条件，包括温度、时间、适宜的气氛条件等。

第三，要准确制备菌液和制备刷片。

要确保菌液的浓度适宜，以保证在染色过程中能够清晰地观察到芽孢。

制备刷片时，要注意避免刷片的污染和受损，确保刷片表面平整，避免影响染色结果。

第四，准备适当的染色试剂。

芽孢染色常用的染色试剂包括马尔奇鲍尔蓝、墨汁、格拉姆染色液等。

在制备或购买染色试剂时，要注意检查其保存期限和质量，避免使用过期或受污染的试剂。

第五，染色的操作要细致。

在染色前，要通过热处理或酶处理等方法，使芽孢解壁，以便染色试剂能够渗透到芽孢内部。

在染色过程中，要遵循染色试剂的使用说明，控制染色时间和温度，并轻轻晃动刷片，以保证染色试剂均匀地分布在芽孢表面。

第六，观察和记录。

染色后，应使用显微镜观察刷片上的芽孢形态和结构。

观察过程中，要注意调节显微镜的焦距和光源亮度，以获得清晰的观察结果。

同时，要准确地记录观察到的芽孢数量、形态特征等信息，以便后续的分析和鉴定。

最后，要正确处理和保存实验产物。

染色后的刷片可以用石蜡封片法进行固定和保存，以便长期保存和后续的分析。

实验过程中产生的废液、废染色液等实验废弃物应正确处理，避免对环境和人体健康造成影响。

以上是关于芽孢染色的注意事项，通过遵循这些注意事项，可以保证芽孢染色实验的顺利进行，获得准确可靠的实验结果。