两大泛素化E3连接酶家族 cullins及ring家族的金华关系和适应意义

“国家大学生创新性实验计划”项目
结题报告
两大泛素化E3连接酶家族——Cullins 及RING家族的进化关系和适应意义
杨燕雯 蒋春平
指导老师：杨继
2008年3月
摘要 泛素化作为蛋白质翻译后调控的重要途径，已被证明与蛋白质降解、肿瘤发
生、细胞周期调控等有密切关联，而E3连接酶作为泛素化过程中最具复杂性和多
样性的环节，近十多年成为国内外的研究热点，特别是与细胞周期调控相关的
Cullins家族以及与泛素化降解肿瘤抑制基因p53相关的RING家族成为研究细胞生
长、凋亡和肿瘤发生的重点。

本文选择RING家族中与p53相互作用的MDM2、
COP1、Pirh2进行了结构预测，并研究了这三个蛋白与泛素蛋白（Ub）的结合、
高能位点及其作用。

对于分类较明确、序列较齐全的Cullins家族，本文从动物中
选取了172条序列，构建了Cullins家族及各亚家族的系统发育树。

除此之外，本
文还将现存的所有cullin家族序列进行收集和比对，确定了各家族之间关系以及
关键的位点。

关键词 E3连接酶，RING家族，结构预测，泛素蛋白，Cullins家族，系统发育树
背景介绍 从1994年确认泛素化过程需要E1活化酶（E1，ubiquitin-activating enzyme）、E2结合酶(E2, ubiquitin-conjugation enzyme)和E3连接酶(E3,
ubiquitin protein ligase)共同作用以来（Martin et al.），对于泛素化的机
制已有了基本的了解：E1激活泛素分子，这种反应需要ATP能量；激活后的泛
素分子通过转酰基作用被进一步转移到E2上，继而与特异性地结合了底物蛋白
的E3结合，完成底物蛋白质的泛素化过程，随后与26S蛋白酶体相偶联，使蛋
白质降解（图1）。

蛋白质泛素化降解途径已经被证明与许多重要的生命过程有密切关系，现已
知道参与了细胞周期调控（对CDKs,CKIs,cyclins的分解）、细胞增殖（促进
EGF-R,PDGF-R）、细胞凋亡（P53）、信号转导（抑制BMP,TGF-ß）、细胞免疫
和炎症反应（IKKs的活性调节）、肿瘤发生（促进HIF-1alfa分解以及K6－polyub
形成）、调控基因转录（促进c-jun,c-fos,c-myc分解）以及调控DNA的复制与
修复过程。

研究发现，癌性恶病质病人骨骼肌蛋白的大量丢失与蛋白质泛素化降
解有关，可降低病人生存质量，缩短生存时间（Zhou et al., 2003）；一些肾
脏疾病及肾组织损伤也与泛素蛋白酶体途径成分的缺陷或功能异常有关（Wang
et al., 2005）。

此外，近年来还发现泛素－蛋白酶体途径参与了多种病因导致
的动脉粥样硬化发病过程，干扰泛素-蛋白酶体途径可能成为防治动脉粥样硬化的重要靶标（Ding et al., 2005）。

目前的研究结果显示，E3连接酶种类很多，可分为N末段规则类型、HECT、环指类（Ring-finger）和U-box几大类，不同类型的E3连接酶之间同源性较低。

其中，环指类E3连接酶都具有环指结构，并可分为Cullins家族、RING家族等，Cullins家族的E3连接酶常以多亚基蛋白复合体的形式存在，需要与具有ring 结构的Roc蛋白互作，才能对Cyclin B，Sic1等底物发挥泛素化E3连接酶的功能；而RING家族蛋白本身就具有ring结构，所以不需要Roc蛋白的协助就可以发挥其泛素化功能。

Cullin-Roc家族约300－500种，Built-in RING家族约450种。

图 1 泛素化过程需要
E1，E2，E3的协助完成，
使得Ub（泛素蛋白）能
够与底物结合并且在
蛋白酶体中泛素化降
解底物。

Ub蛋白可被回
收。

该过程与细胞周
期，转录调控，DNA修
复，受体调控，新陈代
谢，质量控制，信号传
导，免疫应答等都有密
切相关。

虽然Cullin家族的E3都有这类似的结构，然而他们需要特异的连接蛋白（adaptor）和底物(substrate)结合。

这些连接蛋白通过特殊的结构分类，并且与特异的底物结合。

通过这种分子机制，使得cullin家族的E3可以与各种各样的底物结合，发挥泛素化功能。

（Petroski, M.D. et al., 2005） RING家族的蛋白质由于和抑癌基因p53的密切相关而成为研究的热点，其中最著名的三个RING家族E3就是mdm2, Pirh2, cop1（图2）。

在通常条件下，mdm2与p53的结合能够导致p53的降解。

转录因子YY1能够加强这个过程(Sui G. et al., 2004)，而去泛素化酶HAUSP能够逆转这个过程(Li M et al., 2004)。

一些蛋白质比如说p14ARF能够与mdm2结合使mdm2无法行使泛素化功能。

类似
的，一些核糖体蛋白质，例如Rb(Hsieh J-K et al., 1999)，L11(Lohrum MA et
al., 2003)，能够与mdm2的酸性区域结合防止p53的降解。

有许多蛋白质都能
通过mdm2来调节p53的稳定性，不同的蛋白质有着各自不同的分子机制。

例如，
14-3-3 sigma通过与mdm2的C端结合来调控p53的泛素化(Yang HY et al.,
2003)。

而PML能够与mdm2结合并在细胞核出聚集(Bernardi R et al., 2004)。

细胞核对于通过mdm2来调节p53的机制有着重要意义，许多蛋白质，例如mdm2,
p14ARF, Rb和L11都在核中被发现。

然而，为何细胞核能够调节p53的稳定性
依然是未知的(Rubbi CP et al., 2003)。

和mdm2类似的，其他一些拥有RING
区域的蛋白质，例如Pirh2(Leng RP et al., 2003)以及Cop1(Dornan D et al.,
2004)，也能和p53结合并且行使泛素化降解功能。

然而，除了他们与p53的结
合之外，这些蛋白质的其他功能依然有待研究。

这些E3连接酶的不同表达模式
对其在降解p53时的不同作用有着重要意义。

图2 三个E3连接酶与肿瘤抑制基
因p53密切相关，它们是mdm2,
Pirh2, Cop1，均能介导p53的泛素
化降解。

其中，关于mdm2-p53途径
的研究最为广泛，其中包括关于转
录因子YY1的研究，以及其他蛋白
质包括Ab1，p14ARF, L11, PML, Rb
等等。

材料与方法 1．NCBI Protein Database：获取人类中MDM2、Pirh2、COP1等RING家族200余条序列以及Cullins家族400余条序列；
2．PDB：寻找已被测定的蛋白质结构；
3．blastp：寻找同源序列和保守区域；
4．SWISS‐MODEL (Guex N. et al., 1997)：结构预测及预测结果评价；
5．DeepView (Guex N. et al., 1997)：分析预测结果的Ramachandran plot，模拟MDM2、Pirh2、COP1与Ub的结合；
6．ClustalX：多序列对位排列；
7．MEGA 3.1(S Kumar et al., 2004)：Bootstrap N‐J法构建Cullins家族及各亚家族
的系统发育树；
8．DIVERGE 2.0 (Gu X, 2001)：计算Cullins亚家族间θ值，构建功能距离树。

9．Protein rate shift analysis server (Knudsen, B. et al., 2003):
http://www.daimi.au.dk/~compbio/LRTs/protein.html 分析哪些位点是区分各家族的
关键位点。

10. DAMBE(Xia, X. et al., 2001): 去处冗余序列，编辑序列。

结果 1．MDM2, Pirh2, COP1结构预测（附录图1至图12）
以SWISS‐MODEL分别处理以上3条氨基酸序列（Homo sapiens），获得了6
个结构域的结构预测图谱（MDM2的SWIB、zf和D III，COP1的RING与WD40，
Pirh2的zf‐CHY）以及各自的Ramachandran plot，并对高能位点及可能修饰位点
进行了预测。

预测图谱，Ramachandran plot及高能位点、修饰位点（糖基化，
甲基化，乙酰化，磷酸化）的说明见附录。

2． MDM2, Pirh2, COP1与Ub的结合区域与关键位点预测
MDM2与Ub的结合区域与关键位点（图13、14）：Ub与RING finger模拟
结合区域为β‐sheet，关键位点为G35（Ub）‐M404（MDM2），G10（Ub）‐K391
（MDM2），点突变后显著改变蛋白质构象的位点有：Cys394, Ile395, Val396,
His397; Thr400, Gly401, His402; Met429, Ile430, Val431。

Pirh2与Ub的结合区域与关键位点（图15、16）:Ub与RING finger 模拟结
合区域（灰色部分）呈弯沟形状，易与配体结合，关键位点为G10（Ub）‐T127
（Pirh2），G27（Ub）‐C135（Pirh2）。

结合区域中，Cys135, Pro140, Ile136, His133
处于转角处，其点突变显著改变该区域构象。

COP1与Ub的结合区域与关键位点（图17、18）:Ub与RING finger模拟结合区
域（灰色和黄色部分）中关键位点为G10（Ub）‐Tyr175（COP1），G47（Ub）‐Tyr47
（COP1）。

结合区域中，两个β‐sheet（Ala146‐Tyr147‐Met148,
His153‐Ser154‐Phe155）以及转角处的Pro137, Phe140, Met142显著影响蛋白质的
构象。

3．Cullins家族（动物中）系统发育树的构建
Cullins家族最早被发现的成员是线虫中的CUL‐1，分别以线虫中的CUL‐1至
CUL‐5进行BLAST获得了总计约400条蛋白质序列，手工筛选除去冗余序列和多
拷贝序列后约剩300条，其中明确确定为模式动物中Cullins家族蛋白的有127条，选取CULLIN Domain构树(图3)。

Cullins家族系统发育树(图3)有几处地方引起了我们的注意：
1)Cul1，Cul2, Cul5比较接近，建树的时候倾向于聚在一起。

2)CUL‐6数据过少且CUL‐6与CUL‐1具有较高同源性，CUL‐6被吸收到CUL‐1的
边缘；
3)Cul3和Cul4比较接近；
4)Cul7与其他的亚家族差别较大。

5)通过动物序列的排列情况，我们可以看出使用Cullin Domain进行建树是非常
合理的，能够将各个家族的Cullin E3连接酶清晰的分类。

6)Cul6应该是和Cul1类似的某一种（和某个Cul1排在一起），然而和Cul1的
确也有一些差异。

Cul1 Cul2 Cul3 Cul4 Cul5 Cul6 Cul7
Apis mellifera 1 1 1 1 1
Bos taurus 1 1 1 1 1 Caenorhabditis
elegans
1 5
2 2 1 1
Danio rerio 2 2 2 2 Drosophila
melanogaster
1 1 1 1
Gallus gallus 1 1 1 1
Homo sapiens 3 3 6 13 2 1
Mus musculus 4 1 4 3 4
Pan troglodytes 13 1 6
Rattus norvegicus 4 3 2 2 3
图 3（上页） 动物中Cullin家族的进化树，以及所搜集的序列的分布。

其中我们可以清晰地看到Cul3和Cul4的关系较为密切。

Cul1，Cul5，Cul2的关系也相对较为密切。

Cul7与他们的关系均较远，序列差异较大。

Cul6只有一条序列，可能是命名上的问题，由于其和某条Cul1排在一起，我们认为它是一种物种特殊的Cul1，不应该单独命名。

4．Cullins家族在各个物种中的关系
由于除了动物中的cullin有比较好的注释之外，其他物种中的cullin都没有细致的注释。

因此，我们搜集了所有物种中的Cullin序列，包括动物，植物，真菌，原生生物中所有拥有全基因组的生物，除去冗余的重复序列后，共计237条。

同样选取CULLIN Domain建树（图4）。

观察这颗进化树，我们可以发现许多值得的地方：
1)植物的序列和其他物种的相差较大，需要单独的分类与研究。

2)通过这棵树，我们可以看出真菌，原生生物和动物的序列都有较为清晰的分
类，由此，我们可以通过动物中Cullin序列的注释对相应的真菌和原生生物的Cullin进行分类，这对它们功能的研究也有一定的参考意义。

3)通过这棵树，我们可以看出在原生生物时期，Cullin家族就有了很明显的分
化，这似乎预示着Cullin家族是一个相当古老的家族。

然而，在微生物和细菌中并没有发现与Cullin家族匹配度较高的序列。

因此，Cullin家族的起源有待进一步的研究和确认。

4)在这棵树中，我们可以发现有些植物，真菌和原生生物的命名似乎不是那么
准确。

起码从系统发育的角度来说，许多命名都是欠妥的。

图4（下页） 在所有物种的Cullin E3连接酶系统进化树。

我们可以明显看出动物，真菌，原生生物都有很明显的亚家族分化，可以根据这棵树为许多没有确定命名的真菌，原生生物中的Cullin序列命名。

然而植物的Cullin序列却难以用这种方法进行分类和命名，需要单独的分类和命名。

pr ot ozoa
i n pr ot ozoa
C ul7 i n ani m al s
ul l i ns i n pl ant s
0.1
5．Cullins家族中各个亚家族分化的关键位点（表1）
在该项工作中我们使用的是Protein rate shift analysis server帮助分析。

在分析结果中我们进行了以下猜测：
1)通过这个分析，我们可以明显地看出，Cul3与Cul4有着比较密切的关系，Cul1，
Cul2，Cul5的关系也较为密切，有着许多共同的位点。

2)为了寻找最古老的Cullin起源，我们试着摸索哪一种Cullin才是最古老的。

起
先，我们怀疑Cul7是否比较古老。

原因有二：1. Cul7与其他Cullin的关系最远，在动物的进化树上明显被甩在一边。

在所有物种中Cullin家族蛋白质的进化树上，也离家族的其他成员较远。

2. 在位点分析的结果中，我们看到有些结果也支持着这一观点。

第32，33，36，37，70，106，128个位点也表明了Cul7的序列是很与众不同。

然而，最后我们否定了这一设想，也有以下几个原因：1) Cul7的功能以及作用模式和Cullin家族的其他成员不太一样，Cul7与p53密切相关，并且能够直接与p53结合。

而Cullin家族的其他成员是不能与底物直接结合的。

在这个层面上，Cul7更类似于后来起源的RING家族E3连接酶。

2) 位点分析的结果也可以解释为Cul7的变化速率相比其他Cullin 家族E3更快。

3) 动物中Cullin家族E3的情况来看，Cul7主要分布在哺乳动物中，在较为原始的线虫，果蝇中均没有分布。

因此认为，Cul7更有可能是后期分化形成的，而且进化速率较快，使得其序列与Cullin家族其他E3差别甚大。

3)单单从CULLIN DOMAIN的信息中难以找出哪个家族最古老的准确证据，因此
有待关于Cullin家族E3连接酶序列的其他部分的研究完善之后才能揭晓确切的谜底。

表1 Cullins家族中各个亚家族分化的关键位点。

该分析由Protein rate shift
analysis server帮助完成。

此结果已经考虑到物种差异性的原因，选取了多种物
种进行比较，在很多程度上已经杜绝了物种差异而导致的位点差异被统计。

讨论 1.关于RING家族E3连接酶的猜想
RING家族中MDM2, COP1, Pirh2这三个蛋白质有着类似的作用机制和生物学
功能，但是结构上又有着明显不同，因此具有较大的代表性，正处于研究的热点，
希望我们所作的结构预测和分析对今后的结构、功能研究有一定的参考价值。

为了便于进一步的研究，我们把RING家族的200余条蛋白质序列按照文献
中RING结构域的3个型进行了分类，这个工作在下面的研究中起到了不可忽视
的作用。

由于RING以及Cullins家族殊途同归的分子作用机制，我们猜测两个家族在
进化历史上可能存在基因融合的事件。

对于基因融合事件的判断并没有现成的软
件，也没有统一的标准。

我们尝试了分析基因重组的软件RDP‐V2 Beta 08，但是
由于E3连接酶的进化速率较快，全长保守性较低，软件分析后没有得到阳性的
结果。

如下是我们对位排列分析得到的结果：
I．RING家族本身就具有RING结构域，Cullins家族不具有RING结构域，需要带有RING结构域的小蛋白ROC的协助才能与E2结合（图 7），而ROC的RING结构域
与RING家族成员中RING‐H2型RING结构域具有相同的保守位点，即Zn2+结合
位点（图 5）；
II．Cul‐4通过本身的WD40结构域与底物结合（图 7），而部分RING家族成员COP1也具有WD40结构域（图 6）。

这些间接的证据增添了我们对于Gene Fusion假说的信心，我们今后可能从以下角度入手来验证这个假说：
1) 分别以RING和Cullins家族的成员在各代表性物种的基因组数据库中进行BLAST，搜集拷贝数等信息，明确其分布样式；
2)从核苷酸的层面来发掘假基因所包含的信息；
图 5 ROC vs. RING：ROC蛋白与RING家族E3的RING domain有很高同源性。

图 6 WD40 in RING: 作为Cul4与底物结合所需的复合物的组
成部分，WD40也在许多RING家族E3中存在，包括COP1等。

2．关于Cullin家族E3连接酶的猜测以及还可进行的工作
Cullin家族的E3是一个很有共性的集体。

它们发挥泛素化作用的方式非常相似（除了Cul7稍有不同），需要ROC蛋白，以及特异性Adaptor。

总体的模式都是Cullin被Nedd8化，Cullin Domain（C端）与Roc/Rbx家族蛋白质结合，而另一端（N端）区域则是与特异的Linker蛋白以及Adaptor结合。

Adaptor在用其特殊的结构域与底物结合。

Cullin的Nedd8化与E3连接酶的聚集以及酶活性密切相关（图7）。

图7 Cullin家族E3连接酶行使泛素化功能的模式图。

其中黄色代表Linker蛋白，
绿色代表Adaptor蛋白，蓝色代表底物。

每个Cullin亚家族都有自己特异的Linker
以及Adaptor来协助发挥泛素化功能。

由于Cullin Domain是Cullin家族共有的特征，因此一开始是以此整理Cullin
家族的序列来建立进化树的。

通过对Cullin序列的搜集，整理以及分析，的确从
Cullin domain出发，得到了不少有用的信息。

包括Cullin家族E3的分类，对于各
个物种（动物，植物，真菌，原生生物）中Cullin的分布以及对于Cullin起源的
猜测。

然而，要对各种猜测给出一个确切的答案，还有很多许多工作需要做，大部
分工作已经开展或者计划开展。

首先，由于Cullin Domain与Roc/Rbx结合，因此我们也需要对Roc/Rbx进行
一些进化上的分析，数据已经收集齐全。

其次，对于Linker以及Adaptor的研究。

这是一项比较重要的工作，也将在
现在研究成果的基础之上继续进行下去。

与Linker连接的Cullin N端区域，Linker
本身以及Adaptor的序列是我们接下来分析的重点。

相信如果对这些序列也进行
细致的分析的话，应该能够得到关于Cullin家族进化上更多的信息，包括Cullin
的祖先，与Linker以及Adaptor的协同进化等等。

致谢 感谢“国家基础科学人才培养基金”项目 复旦大学生物学基地 J0630643]”。

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