猪心肌高铁肌红蛋白荧光光谱测定条件的确定及功能域的指认

遗传性高铁血红蛋白血症的检查项目有哪些？检查项目：MHb定量测定、MHb还原试验、酶活性测定多数患者红细胞不增多，少数患者骨髓红系统增生。

血中红细胞增多，网织红细胞增多，但MCV、MCH、MCHC正常。

红细胞盐水脆性正常，表明红细胞厚径正常。

红细胞寿命多正常。

少数病例有合并黄疸(溶血)者。

1.肉眼观察取肝素抗凝血于中号试管，血液呈巧克力样棕褐色，空气中振摇1min后颜色不变。

或取外周血1滴于滤纸上，空气中晃动30s后，颜色仍显棕褐色，必要时以正常血对照。

以上试验可以排除因呼吸或循环衰竭引起的缺氧性发绀。

2.MHb的吸收光谱血液用蒸馏水稀释5～20倍，用分光镜直接观察，在红色区有1条暗带，加入10%氰化钾(钠)或连二亚硫酸钠(dithionke)1滴，此带消失。

或用记录式分光光度计波长扫描，观察加入氰化钾前后在630nm附近吸收光谱的变化。

试验时应有正常血对照。

3.MHb定量测定按Evelyn和Malloy分光光度法测定MetHb含量。

4.MHb还原试验将患者或正常人红细胞经亚硝酸盐处理，于乳酸一磷酸盐缓冲液中温育数小时(或过夜)，正常人和中毒性MetHb血症红细胞颜色由巧克力色变为鲜红色，先天性MetHb血症红细胞颜色仍为巧克力色，杂合子红细胞呈褐红色。

5.酶活性测定以氰化高铁血红蛋白为底物测定NADH-MetHb还原酶活性，或以二氯酚靛酚为底物测定黄递酶活性，或以细胞色素b5为底物测定b5R活性。

不同方法测得的结果，尽管不完全平行，但与正常人比较，均有明显减低，杂合子居中。

需强调指出的是，由于不同遗传变异型的作用机制不同，试管中(高底物浓度下)测定的结果并不能确切地反映在活细胞内(低底物浓度下)催化效率减低的程度。

因为，如果酶分子结构的改变使其与底物NADH的亲和力减低(Km值增大)，在生理情况下，细胞内的NADH浓度很低，酶活性几乎完全丧失;但在试管中测定酶活力时，加入的NADH相当于生理浓度的几十倍甚至上百倍，完全可以测出酶的活性。

河南农业科学,2021,50(1):142-151Journal of Henan Agricultural Sciencesdoi :10.15933/ki.1004-3268.2021.01.018收稿日期:2020-06-28基金项目:河南省农业科学院杰出青年科技基金项目(2020JQ06);河南省生猪产业体系创新团队项目(S2012-06);现代农业(生猪)产业技术体系专项基金项目(CARS -35)作者简介:周新宇(1996-),女,河南信阳人,在读硕士研究生,研究方向:预防兽医学㊂E -mail:1973539304@陈鑫鑫为同等贡献作者通信作者:张改平(1960-),男,河南内黄人,中国工程院院士,研究员,博士,主要从事动物免疫学及动物病毒分子致病机制研究㊂E -mail:zhanggaip@猪繁殖与呼吸综合征病毒类NADC30毒株与JXA1-R 疫苗株荧光定量PCR 鉴别检测方法的建立及应用周新宇1,2,陈鑫鑫2,乔松林2,郭振华2,李㊀睿2,邓瑞广2,张改平1,2(1.河南农业大学动物医学院,河南郑州450002;2.河南省农业科学院动物免疫学重点实验室,河南郑州450002)摘要:为鉴别检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV )类NADC30毒株HNhx 和JXA1-R 疫苗株,根据类NADC30毒株HNhx 和JXA1-R 疫苗株非结构蛋白2(Nsp2)基因序列差异,设计特异性引物和探针,建立TaqMan 荧光定量PCR 和SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR 检测方法㊂结果显示,2种方法中,标准品在103~108拷贝/μL 均具有良好线性关系,标准曲线R 2值均在0.990以上;基于TaqMan 探针法的荧光定量PCR 方法,JXA1-R 株㊁HNhx 株的最低检出量分别为104㊁103拷贝/μL ,SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR 方法的最低检出量均为100拷贝/μL ;重复性分析结果显示,批内和批间试验的变异系数均小于1.5%,呈现出良好重复性㊂综上,成功建立了鉴别检测类NADC30毒株HNhx 和JXA1-R 疫苗株的方法,且稳定性好㊁特异性强,可以为PRRSV 的鉴别检测提供技术支持㊂关键词:猪繁殖与呼吸综合征病毒;JXA1-R 疫苗株;HNhx 毒株;TaqMan 荧光定量PCR ;SYBRGreen Ⅰ荧光定量PCR ;鉴别检测中图分类号:S852.65㊀㊀文献标志码:A㊀㊀文章编号:1004-3268(2021)01-0142-10Establishment and Application of Real-time PCR for Differentiation of Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus StrainsNADC30-like and JXA1-RZHOU Xinyu 1,2,CHEN Xinxin 2,QIAO Songlin 2,GUO Zhenhua 2,LI Rui 2,DENG Ruiguang 2,ZHANG Gaiping 1,2(1.College of Veterinary Medicine,Henan Agricultural University,Zhengzhou 450002,China;2.Key Laboratory of Animal Immunology,Henan Academy of Agricultural Sciences,Zhengzhou 450002,China)Abstract :To distinguish JXA1-R vaccine strain and NADC30-like HNhx strain of porcine reproductive and respiratory syndrome virus(PRRSV),TaqMan real-time quantitative PCR and SYBR Green Ⅰreal-time quantitative PCR were established by using specific primers based on the difference of the regions of Nsp2genes between HNhx and JXA1-R.The results indicated that the standard products had a good linear relationship in the range of 103 108copies /μL,and the R 2of the standard curves were over 0.990in twomethods.The detection limit of the TaqMan-based fluorescent quantitative PCR was 104copies /μL (JXA1-R)and 103copies /μL(HNhx),respectively.The detection limit of SYBR Green Ⅰfluorescent quantitative PCR was 100copies /μL.The reproducibility of intra-and inter-assay displayed that the㊀第1期㊀周新宇等:猪繁殖与呼吸综合征病毒类NADC30毒株与JXA1-R疫苗株荧光定量PCR鉴别检测方法的建立及应用coefficient of variations was less than1.5%,the repeatability was good.In conclusion,the method for differentiation of HNhx and JXA1-R was successfully established in this study,which exhibited good stability and high specificity,and provided a new technical support for the differential detection of PRRSV.Key words:PRRSV;JXA1-R vaccine strain;HNhx strain;TaqMan real-time quantitative PCR;SYBR GreenⅠreal-time quantitative PCR;Differential detection㊀㊀猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起的以妊娠母猪发生流产㊁木乃伊胎㊁死胎及弱胎等繁殖障碍以及仔猪与育肥猪呼吸道疾病为主要特征的病毒性传染病[1-2],该病在全球范围内传播,给世界养猪业造成了巨大的经济损失㊂PRRSV是一种有囊膜的单股正链RNA病毒,基因组全长约15kb,含有10个开放阅读框[3-4]㊂ORF1a和ORF1b分别编码pp1a和pp1ab多聚蛋白,pp1a和pp1ab分别被酶切裂解为至少16种非结构蛋白[5-6]㊂其中,非结构蛋白Nsp2是不同毒株基因组差异最大的区域[7]㊂2006年,我国暴发了由高致病性PRRSV(High pathogenic PRRSV,HP-PRRSV)引发的以高热㊁高发病率和高死亡率为特征的PRRS疫情,HP-PRRSV在Nsp2蛋白序列中存在30个氨基酸的不连续缺失[8-9];2012年,我国报道了与PRRSV经典毒株NADC30核苷酸相似性很高的毒株,命名为类NADC30毒株(NADC30-like strain),其在Nsp2蛋白上存在131个氨基酸的不连续缺失[10-11]㊂自2013年以来,类NADC30毒株检测率急剧上升,并且类NADC30毒株与其他田间毒株重组频繁,迅速成为河南省乃至全国的优势流行毒株[12-14]㊂PRRSV的检测方法有很多种,包括病毒分离和鉴定㊁ELISA㊁间接免疫荧光试验(IFA)㊁血清中和试验(SN)㊁实时荧光定量PCR(Real-time PCR)㊁逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)等方法[15-16]㊂但在实际的生产应用中,大部分方法只能检测而无法区分不同PRRSV毒株㊂运用荧光定量PCR技术和基因测序等分子生物学技术是目前鉴别检测PRRSV 最有效的方法[17],根据Nsp2基因序列建立的荧光定量PCR检测方法是目前用于区分PRRSV不同毒株的主要方法㊂鉴于此,基于不同毒株Nsp2基因序列缺失差异[18],针对以HP-PRRSV毒株JXA1为亲本得到的疫苗株JXA1-R和河南省滑县采集样品中新分离鉴定的类NADC30毒株HNhx基因序列[19],以期建立能够检测区分疫苗株JXA1-R和类NADC30毒株HNhx的TaqMan荧光定量PCR方法和SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法,旨在为PRRSV的快速鉴别检测提供技术支持㊂1㊀材料和方法1.1㊀病毒及模板PRRSV疫苗株JXA1-R购自普莱柯生物工程股份有限公司;类NADC30毒株HNhx(GenBank No.KX766379.1)由河南省农业科学院动物免疫学重点实验室分离保存㊂猪流行性腹泻病毒(PEDV) cDNA㊁塞尼卡病毒(SVA)cDNA㊁猪伪狂犬病毒(PRV)DNA㊁猪圆环病毒2型(PCV2)DNA和非洲猪瘟病毒(ASFV)的p72基因质粒均由河南省农业科学院动物免疫学重点实验室保存㊂1.2㊀主要试剂TRIzol LS试剂购自Invitrogen公司;反转录试剂盒PrimeScript RT Master Mix㊁Ex Taq DNA聚合酶㊁JM109感受态细胞㊁pMD20-T载体和Premix Ex Taq(Probe qPCR)试剂盒等均购自宝生物工程(大连)有限公司;SYBR Green Master购自Roche公司;质粒提取试剂盒购自康为世纪生物科技有限公司㊂1.3㊀引物和探针设计合成应用MegAlign软件对PRRSV JXA1-R株和HNhx株的Nsp2基因序列进行分析,运用NCBI中在线软件Primer-BLAST分别设计引物,并根据探针设计原则设计探针,用Oligo7软件评估探针㊂通过对修饰基团分析,选择FAM和CY-5作为探针5ᶄ端标记的荧光报告基团,针对荧光报告基团选择BHQ-1和BHQ-2作为3ᶄ端标记的荧光淬灭基团㊂本研究使用的引物和探针(表1)均由生工生物(上海)股份有限公司合成㊂1.4㊀病毒RNA的提取和cDNA合成用TRIzol LS分别提取待检样品㊁疫苗株JXA1-R 和类NADC30毒株HNhx的总RNA,按照TRIzol LS 说明书,分别用TRIzol LS裂解样品,再用氯仿分离有机相和水相,异丙醇沉淀RNA,75%乙醇洗涤,最后用RNase free dH2O溶解,测定RNA浓度㊂按照PrimerScript RT Master Mix操作步骤,以20μL的反转体系为准,反转录得到cDNA㊂1.5㊀标准质粒的制备根据疫苗株JXA1-R和类NADC30毒株HNhx 的Nsp2序列,利用表1中克隆引物JXA1-R和HNhx分别进行普通PCR扩增,连接到pMD20-T 载体,转化至JM109感受态细胞,挑选阳性重组克341河南农业科学第50卷隆,进行测序鉴定㊂构建的重组质粒测定浓度并计算拷贝数,作为荧光定量PCR的标准品㊂表1㊀引物及探针序列Tab.1㊀Sequences of primers and probes引物/探针名称Primer/probe name序列(5ᶄ 3ᶄ)Sequence(5ᶄ 3ᶄ)产物大小/bpProduct size JXA1-R F:TGTCCTGGAAGAATATGGG307R:GCAATCGGATCTGACCTTJXA1-R-TaqMan F:AACTAACCAACACCCAGGCG86R:CGGGTAGCTTTTGACCCAAGJXA1-R-SYBR F:CTAACCAACACCCAGGCGAC85R:GCGGGTAGCTTTTGACCCAAJXA1-R-Probe FAM-CGACTTCAGAAATGATG-GCCTGGGCGG-BHQ-1HNhx F:GGTGGTTCCTTCCATTCTCC266R:CTCTGCGGCAACGTCAAAHNhx-TaqMan F:GCTGAAGCCGTCACCGATA75R:TTCATTCCTCCCACCTGCTG HNhx-SYBR F:TGGGAGGAATGAACTTGGCG93R:GGGGAGCCTCGTATTCAGTCHNhx-Probe CY5-CGTCAACCCCTGTGCCCGCA-CCAC-BHQ-21.6㊀标准曲线的建立以10倍系列倍比稀释质粒标准品103~109拷贝/μL,分别取2μL作为荧光定量PCR的模板进行扩增,每个梯度设3个重复㊂对于探针法,经优化确定20μL最佳反应体系:Premix Ex Taq(2ˑ) 10μL,ROX Reference DyeⅡ(50ˑ)0.2μL,引物0.6μL,探针0.1μL,模板2μL,RNase free dH2O补至20μL;反应条件:95ħ20s;95ħ3s,60ħ30s,40个循环㊂对于SYBR GreenⅠ方法,经优化20μL反应体系:SYBR Green Master(2ˑ)10μL,引物1μL,模板2μL,RNase free dH2O补至20μL;反应条件:95ħ10min;95ħ15s,60ħ45s,40个循环㊂使用ABI7500Fast Real-time PCR System进行荧光定量PCR检测,生成标准曲线㊂1.7㊀敏感性试验将质粒标准品按10倍倍比稀释,以每个稀释度的标准品为荧光定量PCR模板,同时设仅加水的阴性对照组,以确定建立方法可检测到的最低拷贝数㊂1.8㊀重复性试验选取JXA1-R株和HNhx株不同拷贝数的标准品分别进行3组批内和批间重复,并计算批内和批间的标准差及变异系数,以评估建立方法的稳定性㊂1.9㊀特异性试验以PEDV㊁SVA㊁PRV㊁PCV2㊁ASFV的基因组为模板,以JXA1-R株和HNhx株的cDNA为阳性对照,同时设仅加水的阴性对照,进行荧光定量PCR 检测,以检测建立方法的特异性㊂1.10㊀样品检测所检血清样品来源于以下处理:将PRRSV阴性仔猪12头随机分为A㊁B㊁C3组,A组接种疫苗株JXA1-R,B组接种PBS,C组不做处理;仔猪7日龄时,A组和B组均接种类NADC30毒株HNhx,C组不做处理㊂攻毒后15d,采集血清样品进行检测㊂2㊀结果与分析2.1㊀荧光定量PCR标准质粒的制备利用克隆引物经过PCR扩增分别获得Nsp2区JXA1-R株307bp和HNhx株266bp片段(图1),将目的基因片段连接到pMD20-T载体上,作为标准质粒对照㊂重组质粒经过测序鉴定,并测定其DNA含量:JXA1-R株为2244.32ng/μL,HNhx株为2421.23ng/μL,计算拷贝数后作为荧光定量PCR的标准品稀释使用㊂M:DNA Marker DL2000;1㊁2:JXA1-R株扩增产物;3㊁4:HNhx株扩增产物;5:RNase free dH2OM:DNA Marker DL2000;1,2:JXA1-R amplification products;3,4:HNhx amplification products;5:RNase free dH2O图1㊀标准质粒构建Fig.1㊀Construction of standard plasmids2.2㊀荧光定量PCR标准曲线的建立将2.1中针对JXA1-R株和HNhx株的质粒标准品进行10倍系列稀释后作为模板,根据反应条件进行荧光定量PCR,生成扩增曲线和标准曲线(图2和图3),对应的扩增曲线呈现出显著的S形,对应的标准曲线R2均达到0.990以上㊂2.3㊀荧光定量PCR敏感性试验将针对JXA1-R株和HNhx株的质粒标准品进行10倍倍比稀释,使标准品浓度依次为101~1010拷贝/μL,进行TaqMan荧光定量PCR检测,结果如图4所示㊂JXA1-R株和HNhx株的检出下限分别为104拷贝/μL和103拷贝/μL,对应的循环数分别约为33.67个和35.59个㊂根据阴性对照及3次重复试验结果,最终确定判定标准:对JXA1-R株,当循441㊀第1期㊀周新宇等:猪繁殖与呼吸综合征病毒类NADC30毒株与JXA1-R 疫苗株荧光定量PCR鉴别检测方法的建立及应用A㊁B:JXA1-R 株扩增曲线㊁标准曲线;C㊁D;HNhx 株扩增曲线㊁标准曲线A,B:Amplification curve and standard curve of JXA1-R;C,D:Amplification curve and standard curve of HNhx图2㊀TaqMan 荧光定量PCR 方法的建立Fig.2㊀Establishment of TaqMan real-timePCRA㊁B:JXA1-R 株扩增曲线㊁标准曲线;C㊁D:HNhx 株扩增曲线㊁标准曲线A,B:Amplification curve and standard curve of JXA1-R;C,D:Amplification curve and standard curve of HNhx图3㊀SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR 方法的建立Fig.3㊀Establishment of SYBR Green Ⅰreal-time PCR541河南农业科学第50卷A:JXA1-R株;B:HNhx株A:JXA1-R strain;B:HNhx strain图4㊀TaqMan荧光定量PCR敏感性分析Fig.4㊀The sensitive assay of TaqMan real-time PCR环数ɤ33时,可以判定为阳性,当循环数ȡ34时,判定为阴性,当33<循环数<34时,判定为可疑;对HNhx株,当循环数ɤ35时,可以判定为阳性,当循环数ȡ36时,判定为阴性,当35<循环数<36时,判定为可疑㊂将针对JXA1-R株和HNhx株的质粒标准品进行10倍倍比稀释,使标准品含量依次为101~108拷贝/μL,进行SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测,结果如图5所示㊂JXA1-R株和HNhx株的检出下限均为102拷贝/μL,对应的循环数分别约为36.34个和36.94个,此时阴性对照对应的循环数分别约为35.92个和36.02个㊂根据阴性对照及3次重复试验结果,最终确定判断标准:对于JXA1-R株和HNhx株,当循环数ɤ35时,可以判定为阳性,当循环数ȡ36时,判定为阴性,当35<循环数<36时,判定为可疑㊂2.4㊀荧光定量PCR方法的稳定性分析将针对JXA1-R株和HNhx株的3份拷贝数不同的标准品进行3组批内和批间重复,根据循环数进行分析,其变异系数均小于1.5%(表2),表明建立的Taq Man荧光定量PCR和SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法均具有良好的稳定性㊂2.5㊀荧光定量PCR方法的特异性检测利用建立的荧光定量PCR方法对PEDV和SVA的cDNA㊁PRV和PCV2的DNA㊁ASFV的质粒进行检测,结果如图6和图7所示㊂阳性对照出现特异性扩增,其他样品检测结果均为阴性,表明建立的方法具有良好的特异性㊂641㊀第1期㊀周新宇等:猪繁殖与呼吸综合征病毒类NADC30毒株与JXA1-R 疫苗株荧光定量PCR鉴别检测方法的建立及应用A:JXA1-R 株;B:HNhx 株A:JXA1-R strain;B:HNhx strain图5㊀SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR 敏感性分析Fig.5㊀The sensitive assay of SYBR Green Ⅰreal-time PCR表2㊀荧光定量PCR 检测3份不同拷贝数样品的批内和批间检测结果Tab.2㊀Intra-assay and inter-assay reproducibility of fluorescent quantitative PCR方法Method 标准品Standard 拷贝数Copies 批内重复(循环数/个)Intra-assay (Cycle)平均值X标准差SDCV /%批间重复(循环数/个)Inter-assay (Cycle)平均值X标准差SDCV /%TaqManJXA1-R10917.0430.07410.43516.7610.1839 1.09710820.1930.20000.99119.9560.17130.85810723.7660.10270.43223.7780.15550.654TaqMan HNhx 10918.1580.03600.19818.2160.06340.34810821.6210.16040.74221.7630.15550.71410724.9620.05230.20924.8790.09130.367SYBR Green ⅠJXA1-R10813.2440.11090.83713.3990.17311.29210717.9890.11960.66517.8310.18651.04610620.7160.16680.80520.5090.21421.044SYBR Green ⅠHNhx10624.4840.12100.49424.4360.07750.31710527.4850.06100.22227.5410.05200.18910432.1840.24110.74932.1220.05480.171741河南农业科学第50卷A:JXA1-R 株;B:HNhx 株A:JXA1-R strain;B:HNhx strain图6㊀TaqMan 荧光定量PCR 特异性分析Fig.6㊀The specific assay of TaqMan real-timePCRA:JXA1-R 株;B:HNhx 株A:JXA1-R strain;B:HNhx strain图7㊀SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR 特异性分析Fig.7㊀The specific assay of SYBR Green Ⅰreal-time PCR841㊀第1期㊀周新宇等:猪繁殖与呼吸综合征病毒类NADC30毒株与JXA1-R 疫苗株荧光定量PCR 鉴别检测方法的建立及应用2.6㊀血清样品检测利用建立的荧光定量PCR 对动物试验各组采集的血清样品进行检测,检测结果见表3㊂由表3可知,A 组JXA1-R㊁HNhx 检测均为阳性,B 组HNhx 检测阳性㊂可见,建立的荧光定量PCR 方法可有效检测疫苗株JXA1-R 和类NADC30毒株HNhx㊂TaqMan 荧光定量PCR 探针法可同时在一个反应体系中进行JXA1-R 株和HNhx 株的检测(图8),若待检样品中同时含有JXA1-R 株和HNhx 株,FAM 和CY5两种探针都呈现出扩增曲线;若待检样品中只含有HNhx,只有CY5探针具有扩增曲线㊂而SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR 需要分别检测待检样品中JXA1-R 株和HNhx 株㊂表3㊀荧光定量PCR 对样品的检测结果Tab.3㊀Detection of samples by fluorescentquantitative PCR样品名Sample nameTaqMan 循环数/个TaqMan cycleJXA1-R HNhxSYBR Green Ⅰ循环数/个SYBR Green ⅠcycleJXA1-RHNhxA -130.9728.9132.7930.77A -228.6323.0130.1122.34A -329.4826.0331.4827.09B -133.6714.6936.6315.96B -233.4416.6133.0917.57B -333.7921.7433.8623.06C -134.1735.4635.8835.53C -233.8134.1336.2535.20C -335.9236.7835.2036.42A:接种JXA1-R 疫苗株后接种HNhx 毒株的待检样品扩增曲线;B:接种PBS 后接种HNhx 毒株的待检样品扩增曲线A:Amplification curve of samples from pigs after JXA1-R vaccination and HNhx challenge;B:Amplification curve of samples from pigs afterPBS inoculation and HNhx challenge图8㊀TaqMan 荧光定量PCR 特异性扩增曲线Fig.8㊀The specific amplification curve of the TaqMan real-time PCR3㊀结论与讨论PRRSV 自1987年在美国发现以来,每年给世界养猪业造成巨大的经济损失㊂PRRSV 具有高度变异的特征,其进化速度远远高于其他RNA 病毒[20]㊂2014 2019年,中国类NADC30毒株检出率已高达60%左右[13]㊂类NADC30毒株与我国本土流行毒株极易发生基因重组[14,21],其在流行毒株中所占比例急剧上升成为优势毒株[22-23]㊂荧光定量PCR 由于其简单㊁稳定㊁快速以及准确的特点[24],现已经成为实验室检测PRRSV 的主要方法之一㊂常用的荧光定量PCR 方法主要是TaqMan 探针法和SYBR Green Ⅰ荧光染料法㊂本试验通过对JXA1-R 疫苗株和类NADC30毒株HNhx Nsp2基因序列进行比对,找出各自缺失区域,分别设计特异性引物和探针,成功建立TaqMan 荧光定量PCR 方法和SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR 方法,可以对PRRSV 疫苗株JXA1-R 和类NADC30毒株HNhx 进行鉴别检测,且与其他猪病病毒无交叉反应㊂使用此方法对人工感染仔猪临床样品进行检测,可以有效地检测血清样本㊂此外,本试验对建立的TaqMan 荧光定量PCR 和SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR 2种方法进行分析比较,结果表明,2种荧光定量PCR 方法都可以对PRRSV JXA1-R 疫苗株和类NADC30毒株HNhx 进行鉴别检测㊂TaqMan 荧光定量PCR 方法中荧光探针的加入使特异性增强,可以同时鉴别检测JXA1-R 疫苗株和类NADC30毒株HNhx,节省了时间㊂但可能由于特异性引物和探针均需针对Nsp2各基因序列缺失区域设计,探针的保守性及设计要求使得针对基因的设计范围非常有限,其敏感性有所降低;而SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR 方法只需考虑特异性引物的保守性及设计要求,针对基因的设计范围相941河南农业科学第50卷对较广,进行优化后所建立的方法敏感度较高㊂综上,本研究成功建立了能够有效区分PRRSV JXA1-R疫苗株和类NADC30毒株HNhx的2种荧光定量PCR方法,为PRRSV的鉴别检测提供一定的技术参考㊂参考文献:[1]㊀COLLINS J E,BENFIELD D A,CHRISTIANSON W T,etal.Isolation of swine infertility and respiratory syndromevirus(isolate ATCC VR-2332)in North America andexperimental 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恩施黑猪PTGFR基因SNP检测及遗传多态性分析开题报告长江大学毕业设计（论文）开题报告题目名称恩施黑猪PTGFR基因SNP检测及遗传多态性分析题目类别毕业论文学院（系）动物科学学院专业班级动科31002班学生姓名毕四海指导教师杨军辅导教师罗家琴开题报告日期2013年12月7日恩施黑猪PTGFR基因SNP检测及遗传多态性分析学生：毕四海长江大学动物科学学院指导教师：杨军长江大学动物科学学院1 题目来源本题目来自于生产实践。

2 研究目的和意义猪肉是我国人民膳食结构中动物蛋白的主要来源，在猪的许多经济性状中，除生长速度、饲料利用率和瘦肉率以外，繁殖性状也是影响养猪生产与经济效益的基本因素。

猪的繁殖性能作为衡量其生产力的重要标准，它由几个主基因或数量性状位点控制，妊娠期是繁殖性状中的一个重要的指标，通过缩减妊娠期可以提高猪的生产性能，但是单纯的通过表型是很难进行选择的，并且利用常规的选择方式所需要的时间周期也是特别长的。

利用分子技术来对猪的妊娠期性状进行选择将会大大提高选择的效率和准确率。

在过去的半个世纪里，通过常规育种技术，猪的许多重要经济性状都在遗传上得到了很好的改良(如瘦肉率，背膘厚等)，但对繁殖性状的改良却十分有限，这主要是因为该性状遗传力低，受环境因素影响大。

几十年来，西方猪种在此性状上的改进效果很小，传统的育种方法其育种周期长，遗传进度小，因此开发和利用新的选育标记来提高猪的繁殖性能就倍受重视。

前列腺素F2α（PTGF2α）在哺乳动物繁殖过程中起重要作用，它与排卵、黄体溶解、分娩、子宫平滑肌收缩等生理过程密切相关。

在分娩早期母猪就通过PGF2α调控大脑与子宫的相互作用从而引起产前行为的改变。

本研究拟建立恩施黑猪前列腺素F2α受体基因（PTGFR）多态性检测的PCR-RFLPs方法，对恩施黑猪前列腺素F2α受体基因（PTGFR）多态性进行检测，同时与妊娠期短的清平猪前列腺素F2α受体基因（PTGFR）多态性进行对比，为猪妊娠期的分子遗传调控研究奠定基础。

猪心肌高铁肌红蛋白高级结构动态信息的光谱指认李亚东;吴名草;汤宇;金邦荃;黄鹤勇;李钢;冯玉英【期刊名称】《食品科学》【年(卷),期】2016(037)009【摘要】本实验采用扫描电子显微镜、X射线衍射、拉曼、红外等现代光谱技术和数据库、计算软件等,层层剖析猪心肌高铁肌红蛋白(pig metmyoglobin,pMetMb)冻干粉的结构特征和分子动态结构信息.结果表明,pMetMb冻干粉表观呈明显的棱状结晶体,结晶度为(95.60±1.37)％,三晶胞轴长不相等(a≠b≠c),可归属于高晶度含水单斜结晶体.根据晶体数据库同类化合物比对,得到pMetMb肽链和heme-Fe的关键基团来源;经拉曼和红外光谱解析和推算,pMetMb肽链均有α螺旋、β折叠、β转角和无规卷曲4种蛋白质二级结构,分别占50％、14％、24％和12％;分别由3个酰胺区中C=O、C=C、C-N、-COO-、C-H、N-H的不同振动形式所产生;六配位低自旋的Fe-C-N形成heme-Fe3+.因此,pMetMb为六配位低自旋构象,是结构紧密、性质稳定的球状蛋白质.【总页数】6页(P111-116)【作者】李亚东;吴名草;汤宇;金邦荃;黄鹤勇;李钢;冯玉英【作者单位】南京师范大学金陵女子学院,江苏南京 210097;南京师范大学金陵女子学院,江苏南京 210097;南京师范大学金陵女子学院,江苏南京 210097;南京师范大学金陵女子学院,江苏南京 210097;南京师范大学分析测试中心,江苏南京210097;南京师范大学分析测试中心,江苏南京 210097;南京师范大学分析测试中心,江苏南京 210097【正文语种】中文【中图分类】TS251【相关文献】1.猪心肌高铁肌红蛋白分子结构解析 [J], 李亚东;吴名草;金邦荃2.光谱法研究高铁肌红蛋白活性中心与一氧化氮的配位反应 [J], 唐乾;张越;曹洪玉;史珊珊;郑学仿3.猪心肌高铁肌红蛋白荧光光谱测定条件的确定及功能域的指认 [J], 吴名草;金邦荃;冯玉英;陈许明;黄鹤勇4.光谱法研究高铁肌红蛋白活性中心与咪唑的配位反应 [J], 周华伟;曹洪玉;唐乾;李进京;郑学仿5.基于高光谱开发滩羊肉中高铁肌红蛋白含量的定量函数 [J], 程丽娟; 刘贵珊; 何建国; 万国玲; 马超; 班晶晶; 马丽敏; 杨国华; 袁瑞瑞因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

猪血红蛋白的测定原理
猪血红蛋白的测定原理主要基于血红蛋白与某些特定试剂发生颜色反应的原理。

血红蛋白是一种红色的金属卟啉化合物，其中心原子为铁。

其分子结构中有一个咪唑官能团，可以与某些试剂形成裂解反应，生成染料化合物，这一特性可用于测定血红蛋白的含量。

常用的测定猪血红蛋白的方法有氰化法、硫氰酸法和分光光度法。

氰化法：该方法通过将红细胞溶解后加入含有氢氰酸的溶液，使血红蛋白在氰离子作用下裂解，生成一种具有红色的配合物——联铁血红蛋白。

这种联铁血红蛋白能够吸收540 nm左右的特定波长的光线，所以可以通过分光光度法测定其吸光度来推算血红蛋白的浓度。

硫氰酸法：该方法利用硫氰酸离子能与血红蛋白中的铁离子发生络合反应，生成具有深红色的铁硫氰血红蛋白，它吸收λ=540 nm的波长光线。

在实验中，可先将猪血红细胞裂解并去除蛋白质，在加入硫氰酸和硫酸铵等试剂，经过反应后用分光光度法测定吸光度，并根据吸光度与溶液中铁硫氰血红蛋白的浓度成正比的关系，便可求得猪血红蛋白的浓度。

分光光度法：该方法基于分光光度计的原理，通过测量在某一特定波长下，染料溶液的吸光度，来计算目标物质的浓度。

在猪血红蛋白测定中，可先将样品处理，使血红蛋白在某种试剂的作用下产生光谱吸收峰。

然后，通过光谱测定，测量吸
光度，并与标准曲线或校准曲线比对，计算出猪血红蛋白的浓度。

猪血红蛋白的测定原理主要是基于血红蛋白与特定试剂的化学反应产物的颜色反应。

根据测定方法的不同，可以选择氰化法、硫氰酸法或分光光度法进行准确测定。

这些方法在实验室中被广泛用于研究和临床医学领域，可以迅速、准确地测定猪血中血红蛋白的含量。

中图分类号:S 852.64:Q 503　文献标识码:A 文章编号:167324696(2007)022*******猪附红细胞体实时荧光定量PCR 检测方法的建立朱绍辉1,2,吴延功2,单　虎1,王志亮2,姜同泉1,孙承英2,赵永刚2(1.莱阳农学院动物科技学院,山东青岛　266109;2.中国动物卫生与流行病学中心,山东青岛　266032) 摘要:参照猪附红细胞体16S rRNA 基因序列设计了1对引物,分别以标准株和分离株的基因组DNA 为模板,采用S Y BR Green Ⅰ实时荧光定量PCR 方法检测猪附红细胞体,确定特异性产物的Tm 值,同时做普通PCR 。

试验结果表明,特异性产物的Tm 值为88.5℃,最低能检测到含0.036fg/μL 阳性质粒的标准品。

以阳性质粒标准品10倍倍比稀释的模板进行实时荧光定量PCR ,通过对反应体系和反应条件进行筛选和优化,建立了检测猪附红细胞体的标准曲线。

建立的S Y BR Green Ⅰ实时荧光定量PCR 检测方法显示了较好的特异性、敏感性和广谱性,为猪附红细胞体病的临床检测和流行情况调查提供了新的技术手段。

关键词:猪附红细胞体;实时荧光定量PCR ;荧光染料Establishment of a real 2time fluorescent qu antitative PCR assayfor the detection of Eper yt hrozoon suisZHU Shao 2hui 1,2,WU Yan 2gong 2,SHAN Hu 1,WAN G Zhi 2liang 2,J IAN G Tong 2quan 1,SUN Cheng 2ying 2,ZHAO Y ong 2gang 2(1.De partment of A nimal S cience and Technology ,L ai y ang A g ricultural College ,Qing dao 266109,China;2.China A nimal Health and Epi demiology Center ,Qing dao 266032,China ) Abstract :A pair of p rimers were designed based o n t he 16S rRNA sequence of E pery t hroz oon s uis ,and a real 2time fluorescent quantitative PCR (real 2time FQ 2PCR )assay was established for t he detection of E.suis by using DNA ext racted from po sitive st rain and t he ferret isolated as templates.Tm value of t he spe 2cific p roduction was confirmed to be 88.5℃.An ordinary PCR was also performed.This technique was highly sensitive wit h a detection limit of 0.036f g/μL of positive recombinant plasmid.After t he reaction conditions and reactio n systems of t he real 2time FQ 2PCR were optimized ,a standard curve was obtained wit h t he po sitive recombinant plasmid diluted by 10times as template.The developed real 2time FQ 2PCR using S Y BR Green Ⅰwas specific ,highly sensitive and had broad applications ,and could be f urt her used in clinic detection and epidemic investigatio n of E.s uis .K ey w ords :E pery t hroz oon s uis ;real 2time fluoresent quantitative PCR ;S Y BR Green Ⅰ 猪附红细胞体病(eperyt hrozoono sis )是由猪附红细胞体(E pery t hroz oon s uis )寄生于人畜红细胞表面、血浆和骨髓中而引起的一种人畜共患传染病[1]。

血中高铁血红蛋白测定方法
血中高铁血红蛋白测定方法主要包括以下几种：
1. 高铁血红蛋白定量法：根据高铁血红蛋白与碱性染料亚甲蓝反应形成紫蓝色的配合物，通过分光光度计测定其吸光度来定量高铁血红蛋白浓度。

2. 甲醛染色法：使用甲醛处理血液样本，然后用碱性染料苏丹Ⅲ染色，并用显微镜观察血液中的红细胞形态，根据高铁血红蛋白使红细胞变圆形的特征来判断高铁血红蛋白的存在与浓度。

3. 放射性同位素法：使用放射性同位素标记的铁离子注射到血液中，然后通过血液样本的放射性测量来测定高铁血红蛋白的浓度。

这些方法各有其优缺点，具体选择哪种方法取决于实验室设备和操作条件的限制，以及测定的准确性和灵敏度的要求。

猪瘟病毒实时荧光定量RT PCR检测方法的建立和初步应用李军,潘艳,禤雄标,胡帅,马春霞,谢宇舟,陈泽祥,许力干,谢永平,杨威(广西兽医研究所,广西南宁 530001)摘要:根据G enBank公布的猪瘟病毒基因组5 非编码区基因序列进行同源性比较分析,选择保守序列区作为扩增区域,设计1对特异性扩增引物,通过优化反应条件,建立了一个用于猪瘟病毒快速定量检测的SY BR Gr een 荧光定量RT P CR 方法。

试验结果表明该方法重复性好,反应批内循环阈值差异不显著。

与猪繁殖与呼吸综合征病毒、伪狂犬病病毒和猪圆环病毒2型等猪源病毒无交叉反应,具有高度的特异性,而且灵敏度高,最小检出量为2 102病毒基因组拷贝数。

利用此方法对15例临床样本进行检测,其结果与兔体交叉免疫试验一致,表明此方法可作为猪瘟实验室快速诊断和疫情监测的一种快速、准确、简便的检测工具。

关键词:猪瘟病毒;实时荧光定量RT PCR中图分类号:Q78 文献标识码:A 文章编号:1671 7236(2011)03 0116 04猪瘟病毒(classical sw ine fev er virus,CSFV)属于黄病毒科瘟病毒属,是猪的一种重要传染性疾病病原,猪是本病的唯一宿主,病猪和带毒猪是最主要的传染源,直接接触是病毒传播的主要方式。

猪瘟发病特征为发病急,高热稽留和细小血管壁变性,引起全身广泛性小点出血,脾梗死,具有很高的发病率和死亡率,对养猪业造成了严重的经济损失,被世界动物卫生组织列为A类传染病,是国际贸易重要检疫对象之一(Meuw issen等,1999)。

目前,CSFV的检测方法主要有3大类,即兔体交叉免疫试验、基于病毒抗原和抗体反应的血清学诊断方法和针对病毒核酸检测的PCR技术(梁仕岩等,2009)。

兔体交叉免疫试验和血清学诊断方法检测病毒抗原虽然具有一定的灵敏度,但是操作繁琐,周期较长。

PCR可以检测血液、粪便、分泌物中CS FV的核酸,实现早期诊断,在CSFV的检测中发挥重要的作用(傅烈振等,1998;张朝红等,2007;刘建柱等,2003)。

高铁血红蛋白还原试验比色法作业指导书1.实验原理有足量的NADPH存在下，反应液中的高铁血红蛋白能被高铁血红蛋白还原酶（即细胞色素b5，亦称黄酶素）还原成（亚铁）血红蛋白。

在体外，这一还原过程还需要递氢体亚甲基蓝的参与。

当红细胞内葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD）含量正常时，由磷酸戊糖代谢途径生成的NADPH的数量足以完成上述还原反应。

当红细胞内G6PD含量不足或缺乏时，高铁血红蛋白还原速度减慢，甚至不能还原。

高铁血红蛋白呈褐色，在波长635nm处有吸收峰，可用分光光度计加以测定。

2. 标本：2.1 病人准备：无特殊。

2.2 类型：枸櫞酸钠抗凝血（葡萄糖20mg）。

2.3 标本采集：在试管中加入葡萄糖20mg，109mmol/L枸橼酸钠溶液0.2ml，静脉血1.8ml，混匀。

3. 标本存放标本不宜存放。

4. 标本运输常温条件下运输。

5. 标本拒收标准抗凝剂不符合的、细菌污染的标本。

6. 实验材料6.1. 0.18mol/L亚硝酸钠和0.28mol/L葡萄糖混合溶液亚硝酸钠 1.25g+葡萄糖 5.0g+蒸馏水加至100ml；贮存于棕色瓶中，放4℃冰箱，可保存1个月。

6.2 0.4mmol/L亚甲基蓝溶液亚甲基蓝（含3个结晶水）0.15g+蒸馏水加至100ml；先将亚甲基蓝放入乳钵中，加蒸馏水少量研磨，待溶解后移到100ml容量瓶中，再加蒸馏水至100ml混匀过滤，此液可贮存3个月。

6.1.3 0.02mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.4）磷酸氢二钠229.5mg+磷酸二氢钾52.2mg+蒸馏水加至100ml（或用0.0667mol/L pH7.4磷酸盐缓冲液稀释3倍。

6.1.4 109mmol/L枸橼酸钠溶液（32g/L）.7. 仪器722分光光度计，使用方法见其操作与维护规程.SOP文件。

8 操作步骤8.1 将标本离心15min取出，调整血细胞与血浆比例为1:1后再混匀。

8.2 取上述抗凝血1ml，加亚硝酸钠葡萄糖混合溶液和亚甲基蓝溶液各0.05ml，颠倒混合15次，使与氧气充分接触，加塞后放37℃水浴或孵箱中3h。

2020年第7期 吉林畜牧兽医·养猪专栏·YangZhu ZhuanLan荧光RAA检测方法快速诊断一起猪附红细胞体病郑秀红1，袁 莉2，乔启波3，李丽婧4，杜秋明3*1.吉林省龙井市德新乡畜牧兽医站，吉林龙井 133400；2.吉林省龙井市老头沟镇畜牧兽医站，吉林龙井 133400；3.吉林省延边州动物疫病预防控制中心，吉林延吉 133000；4.吉林省龙井市动物疫病预防控制中心，吉林龙井 133400摘 要：猪附红细胞体病是现代养猪场户中高发、常发的一种疫病，因其临床症状、病理变化均缺少特异性表征，常常被漏诊，实验室常用的猪附红细胞体检测方法都有灵敏性低、特异性差或操作复杂、对设备人员要求高等缺点，致使该病的检出率不高，近年来有很多养猪场户因发生猪附红细胞体病造成了巨大的经济损失。

本文利用荧光RAA检测方法对一起猪附红细胞体病进行了快速诊断，为养殖户减少了经济损失，以期为该病的防控提供借鉴。

关键词：荧光RAA；猪附红细胞体病1 概述附红细胞体可寄生在多种动物的红细胞表面、血浆、骨髓等部位，使感染动物发生附红细胞体病[1～3]，该病也可以感染人，是一种人兽共患传染病[4～7]。

猪附红细胞体病可在不同日龄的猪群发生，仔猪的发病率和死亡率都相对较高，母猪感染情况也较为严重。

本病的传染源主要是患病猪和隐性感染的猪只。

本病可通过虱子、蚊子、蜱虫、疥螨等媒介昆虫传播，也可通过猪只咬尾、舔舐伤口等方式传播，不更换注射器，使用同一支注射器对多个猪只进行免疫或注射也可造成该病的传播。

发病猪临床多表现为体温升高、精神沉郁、眼结膜苍白或黄染、贫血、生长缓慢、甚至死亡。

黄疸、皮下组织水肿、心包积液、肝脾肾肿大、淋巴结水肿是该病的主要病理变化。

该病的临床症状和病理变化均无特异表征，是导致该病临床诊断困难的主要原因。

2 常规实验室检测方法因通过临床症状和病理变化无法对该病进行准确的诊断，为提高诊断的准确性和检出率，血液镜检、血片染色、ELISA等血清学检测方法相继应用到该病，但上述方法在敏感性、特异性上都存在不足，致使该病的检出率和诊断准确性未能得到大幅度提高。

肉及肉制品中猪、牛、羊、马、驴、鸡、鸭、鹅、兔源性成分的快速鉴定实时PCR法编制说明一、任务来源本标准由中华人民共和国商务部提出并归口，由商务部流通产业促进中心实验室生物检测室研究小组完成方法的建立优化、标准的起草制定工作。

二、编制依据本标准遵循GB/T1.1-2009《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写》、GB/T20001.4-2001《标准编写规则第4部分：化学分析方法》的编写规则、GB/T6379《测量方法与结果的准确度（正确度与精密度》第2部分：确定标准测量方法重复性与再现性的方法》。

三、目的和意义随着市场经济的不断深入发展，部分不法商贩为了谋求不正当利益，在肉（制）品中掺杂其他价格便宜的肉种，在肉（制）品市场出现了一种“以次充好、以假乱真”的现象。

通过实验室前期大量的调查研究分析，我们发现肉（制）品中掺杂、掺假的现象已经十分普遍，大部分肉（制）品中掺有标称以外的其他价格便宜的动物源性成分，有的甚至全部为标称以外的其他价格便宜的动物源性成分。

这极大地损害了消费者的利益，扰乱了流通市场秩序和健康发展，同时也对民族宗教信仰造成一定的潜在冲突。

但目前，相应的检测鉴定方法标准的缺失，使得检测监测机构对此无标可依，无法可循，难于判断和裁决。

为了规范国内市场流通秩序，保证市场的正当竞争，保护消费者的经济利益和对所购买商品的选择权、知情权及宗教信仰归属，制定本检测标准。

四、编制过程《肉及肉制品中猪、牛、羊、马、驴、鸡、鸭、鹅、兔源性成分的快速鉴定实时PCR法》该方法标准由商务部流通产业促进中心起草编写。

经过中国科学院微生物研究所、中国农业科学院饲料研究所、中国农业大学食品科学与营养工程学院三家单位进行了方法的复核验证实验，并提交了具体的复核验证报告。

根据国家有关标准制定和修订工作的要求，商务部流通产业促进中心在《肉及肉制品中猪、牛、羊、马、驴、鸡、鸭、鹅、兔源性成分的快速鉴定实时PCR法》的起草编制过程中，主要工作包括以下几个方面：1、详细查阅了国内、国外有关标准和相关专业期刊上发表过的参考文献等技术资料，如食品、化妆品和饲料中牛、羊、猪源性成分检测方法及动物源性饲料中哺乳动物源性成分定性检测方法等国内已申请的相关检验报告，并对这些资料进行了详细的对比，从方法的先进性、可靠性和实用性等几个方面考虑，选取了几个代表性的参考资料作为标准起草中的主要技术参考文本。