HCMV感染小鼠脑组织的蛋白质组学研究

HCMV感染小鼠脑组织的蛋白质组学研究

谢妮;蔡茵莎;吴瑾滨;刘建军

【摘要】目的建立人类巨细胞病毒(HCMV)感染小鼠脑组织前后的比较蛋白质组学双向电泳技术研究体系.方法昆明系小鼠40只,随机分为两组:实验对照组(20只)和病毒感染组(20只),在接种HCMVAD_(169)株30d后,取小鼠脑组织,研磨、超声裂解、抽提蛋白,采用双向凝胶电泳分离,进行染色,Image Master 2D Platinum软件分析、识别差异表达蛋白质,应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱得到相应肽质量指纹图谱,搜索数据库鉴定部分差异蛋白质点,并对其中部分蛋白质的表达进行免疫印迹的验证.结果从双向电泳图谱上获得蛋白质斑点:实验对照组(1096±82)个,感染HCMV组(1210±101)个,发现显著差异点36个,对其中6个点进行了筛选鉴定;免疫印迹实验结果也较为吻合.结论利用蛋白质组学技术,检测正常小鼠脑组织及HCMV感染的小鼠脑组织的差异蛋白质,为疾病的早期诊断、致病机制及有效药物靶点的发现提供实验和理论依据.

【期刊名称】《南方医科大学学报》

【年(卷),期】2010(030)002

【总页数】4页(P341-344)

【关键词】人类巨细胞病毒;病毒感染;蛋白质组学;差异表达

【作者】谢妮;蔡茵莎;吴瑾滨;刘建军

【作者单位】深圳大学附属第一医院,广东,深圳,518035;深圳大学附属第一医院,广东,深圳,518035;深圳大学附属第一医院,广东,深圳,518035;深圳市疾病预防控制中心,广东,深圳,518020

【正文语种】中文

【中图分类】R373;R34

先天畸形一般包括人类出生时各种解剖结构畸形、功能缺陷及代谢异常。据世界卫生组织（WHO）1996年的一项研究，中枢神经系统（CNS）畸形约占全部先天

畸形的17%。而在众多引起CNS发育异常的原因之中，人类巨细胞病毒(HCMV)先天性感染是重要原因之一［1］。目前，国内外在HCMV致神经系统疾病、畸

形的分子机理方面，主要从基因和转录水平来进行研究。然而基因的功能活性主要靠蛋白质来实现，若能直接从蛋白质整体水平入手来研究HCMV致病、致畸的机制，将能更加全面、真实地揭示HCMV的致病过程［2］。本研究通过优化双向

电泳技术体系，成功分离、检测到HCMV感染前后小鼠脑组织的差异表达蛋白质，是寻找疾病相关蛋白质、有效地发现疾病标志分子，对探讨HCMV致病机制、早期诊断防治和找出抗HCMV的新药靶点提供重要的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物昆明小鼠（乳鼠）40只，3 d龄，健康，由中山大学实验动物中

心提供。感染病毒的小鼠只限在实验室专用的感染动物间喂养。

1.1.2 试剂丙烯酰胺(Acr)、N，N一甲叉双丙烯酰胺(Bis)、十二烷基磺酸钠(SDS)、过硫酸铵(APS)、四甲基乙二胺(TEMED)、尿素、CHAPS、二硫苏糖醇(DTT)、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、甘氨酸(Gly)、琼脂糖、牛血清白蛋白(BSA)、硫代硫酸钠、碳酸氢铵、乙腈、胰蛋白酶(Trypsin)均购自上海生工生物工程有限公司；溴酚蓝、碘乙酰胺 (IAA)购自广州化学试剂公司；Molecular Grinding Kit、两性电解质、

低分子量标准蛋白、IPG 胶条、IPG Buffer 系 Amersham Pharrnacia Biotech

公司产，其余试剂采用国产分析纯。

1.1.3 主要仪器 Ettan IPGphor等电聚焦仪、EttanDALTsix垂直电泳仪及Image Master 2D图像分析软件购自英国Amersham Pharmacia Biotech公司；U-2000紫外可见分光光度仪系13本H1TACHI公司产；MIK-RO 22R台式冷冻离

心机系德国MIKRO公司产；质谱VoyagerDE-STR mass spectrometer由Applied Biosys-terns公司提供。

1.2 方法

1.2.1 样品制备将实验小鼠随机分为实验对照组（20只）和病毒感染组(20只)，

对照组脑内注射生理盐水0.02 ml，病毒组脑内注射HCMVAD169毒液0.02

ml(TCID50=10-4,HEL增殖原液)。在攻毒后的30 d，取小鼠脑组织提取蛋白。1.2.2 蛋白提取冰冻组织剪碎，加人裂解液(0.3 g组织／m1)(7 mol／L 尿素、2 mol／L 硫脲、40 mmol／L rifs、4%CHAPS、1%PMSF)中使用分子研磨试剂盒

研磨，5 min后加入1%DTY。室温下静置20 min，在冰上使用超声波细胞粉碎

机完全破碎细胞 (工作时间10 s，间隔15 s，共l0个循环，功率100 W)。静置1 h后，4℃，离心力40 000×g，离心60 min。取上清，以牛血清白蛋白(BSA)为

标准蛋白，使用Bradford法测定样品蛋白浓度。

1.2.3 固相pH值梯度双向凝胶电泳 (1)取蛋白质80(银染)或500 g(考马斯亮蓝染色)置入再水化液(8 mol／L 尿素、2%CHAPS、1%IYIT、0.5%IPGBufer,0.002%溴酚兰)中，使用18 am IPG胶条(pH3-10，NL)，在IPGphor上等电聚焦。设置参数：rehydration step-n-hold 30 V 6 h、60 V 6 h、200 V 1 h、1 000 V lh、5 000 V 1 h、Gradient8 000 V 1 h，step-n-hold 8000 V 60 000 Vh，20℃，50μA／strip。达到 60 000 Vh结束聚焦；(2)在平衡液(50 mmol／L Tris-HCl、

6 mol／L 尿素、30%甘油、2%SDS、0.002%溴酚兰)中分两步各l5 min对胶条

进行平衡，第一步加入1%DIT，第二步2.5%IAA；(3)SDS-PAGE：将胶条移至