无菌试验方法验证--王彦忠2011.8

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培养基：
质量控制试验
如果培养基的制备过程未经验证，那么每一批培养基均 要进行适用性检查试验，试验菌种除根据培养基的用途 从相关附录中进行选择，也须增加从环境及产品中分离 的常见污染菌株。
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菌种：
• 实验室应建立文件化的程序管理菌种（从标准菌株到工作 菌株）。 通常该程序包括： 标准菌种的申购记录； 从标准菌株到工作菌株操作及记录； 菌种必须定期转种传代，并作纯度、特性等检查项目； 每支菌种都应注明其名称、标准号、接种日期、传代数 菌种生长的培养基和培养条件； 菌种保藏的位置和条件。
• 用于环境监控的培养基须特别防护，用于关键区域监 控的培养基宜双层包装和终端灭菌，以防出现假阳性。
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我们将按照以下几部分对微生物实验室进行介绍：
人员
培养基
菌种
容器和盖子不得破裂； 装量应相同； 尽量避免形成气泡； 固体培养基表面不得产生裂缝或涟漪； 在冷藏温度下不得形成结晶； 不得污染微生物。
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培养基：
培养基的灭菌
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培养基：
培养基的制备 • 应按处方配制培养基，也可使用市售的脱水培养基。 脱水培养基应附有处方和使用说明，按照使用说明配 置培养基，不得使用结块或变色的脱水培养基。 脱水培养基或单独配方组分应在适当的条件下储存， 所有的容器应密封。 商品化的成品培养基除了应附有处方和使用说明外， 还应注明有效期、储存条件、适用性检查试验的菌和 用途。
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培养基：
培养基的制备
• 应对分装后的培养基进行质量检查，并记录批数量、 有效期及无菌情况等信息。 通常需要对制成平板或分装于试管的培养基进行下列检 查：
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菌种：
• 使用标准储备菌株制备工作菌株。 • 冷冻菌株一旦解冻转种制备工作菌株后，不得重新冷冻和 再次使用。 • 工作菌株的传代次数不得超过5代。 从菌种保藏机构获得的标准菌株为第0代，以防止过度的传 代增加菌种变异的风险。 • 代的定义：活的培养物接种到微生物生长的新鲜培养基中 培养，任何亚培养的形式均被认为是转种或传代一次。
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我们将按照以下几部分对微生物实验室进行介绍：
人员
培养基
菌种
实验室的布 设备 局和运行
文件
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培养基：
质量控制试验
• 实验室应制订培养基质量控制程序。
• 所有配制好的培养基均应进行质量控制试验。 • 培养基质量控制的项目有：pH值、适用性检查和定期 的稳定性检查以确定有效期。 • 当培养基的配制和灭菌程序等均已验证，则同一批次 的脱水培养基的适用性检查试验可只进行一次。
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培养基：
培养基的制备
• 配制培养基的水应该是纯化水，并且需要记录所用纯 化水的制备日期。 脱水培养基应完全溶解于水中，再行分装与灭菌。配 置时如需要加热助溶，须注意不能加热过度，否则颜 色会变深。
培养基：
培养基的贮藏 •固体培养基灭菌后只允许再融化一次，以避免培养基 过度受热造成培养基质量下降或微生物污染。一般采用 水浴加热或流通蒸汽的方式再融化培养基，如使用微波 炉，应避免过度加热和水分流失。融化后的培养基应置 45～50℃的水浴中保温，时间不得超过8小时。 倾注培养基时，应擦干培养基容器外表面的水分，避免 容器外壁的水滴进入培养基中造成污染。 使用过的培养基应按照国家污染废物处理相关规定进行
• 培养基灭菌一般采用湿热灭菌技术，特殊培养基可采 用薄膜过滤除菌。 通常按照生产商提供或使用经过验证的参数进行培养 基的灭菌。商品化的培养基必须附有灭菌方法。 对于一些热敏感的培养基不能使用湿热灭菌技术。
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a.湿热高压蒸汽灭菌法：依115 ℃ 121℃或132℃， 应用于培养基灭菌、试验器械、工作服、橡胶物 品灭菌和实验室废弃物，也可用于玻璃器皿的灭 菌。一般121℃30min 因为湿热中菌体吸水，蛋白质容易凝固，因蛋白 质含水量增加，所需凝固温度降低；湿热的蒸气 有潜热存在。所以效果比同温度下干热好。 b.干热法：利用物理学，171℃-1小時、160℃-2小時 、121-3小時 : 玻璃器皿
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培养基：
培养基的贮藏
• 自配培养基应标记名称、批号、配制日期等信息，商 品化的成品培养基应标记名称、批号、生产日期和失效 期等信息。 自制的培养基应再验证的条件下贮藏； 商品化的成品培养基应按照说明书上的要求进行贮藏， 以最大限度的减少水份的流失。
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人员：
• 应通过内部质量控制、能力验证或使用标准菌株 等方法评估检验人员的能力。 如有必要（如一段时间内由于人员的原因偏差重 复出现或显示某种不良趋势），需要对其进行再 培训并重新评估。当使用一种非经常使用的方法 或技术时，有必要再检测前确定微生物检测人员 的操作技能（并不意味着熟练的人员就不需要进 行再培训或者能力再评估）。 所有人员的培训、考核内容和结果均应记录归档 。
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人员：
• 人员的专业背景；
从事药品微生物试验工作的人员应具备微生物学 或相近专业只是的教育背景。
• 人员培训应覆盖仪器设备操作、微生物检验技术 和实验室生物安全等； 实验人员应依据所在岗位和职责接受相应的岗前 培训，包括：仪器设备操作、微生物检验技术和 实验室生物安全等方面的培训，检验人员必须熟 悉相关检测方法、程序、检测目的和结果评价， 经考核后方可上岗。
培养基：
培养基的制备 • 培养基应采用验证合格的灭菌程序灭菌。应对高压灭 菌器的蒸汽循环系统进行验证，确保在一定装载方式下 的正常热分布。 如培养基使用不适当的加热和灭菌条件，可能会引起颜 色变化、透明度降低、琼脂凝固力或pH的变化。 温度缓慢上升的高压灭菌器可能导致培养基过热，过度 灭菌可能会破坏绝大多数的细菌和真菌培养基的促生长 能力。 • 应确定每批培养基灭菌后的pH值（25℃下测定）。 如无特殊规定，通常pH的范围不能超过规定值的＋0.2 • 应对分装后的培养基进行质量检查，并记录批数量、 有效期及无菌情况等信息
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一、微生物实验室的要求
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我们将按照以下几部分对微生物实验室进行介绍：
人员
培养基
菌种
实验室的布 设备 局和运行
文件
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内容介绍：
1. 微生物实验室的要求； 2. 2010版药典无菌检查法的主要增修订情况；
3. 无菌分析方法的验证；
4. 无菌检查的检验数量和检验量； 5. 无菌检查的注意事项和GMP检查的重点；
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质量控制试验如果培养基的制备过程未经验证那么每一批培养基均要进行适用性检查试验试验菌种除根据培养基的用途从相关附录中进行选择也须增加从环境及产品中分离的常见污染菌株
无菌实验方法验证
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实验室的布局和运行：
毒剂的种类应定期更换，使用的消毒剂应无菌。 •实验室的操作应避免交叉污染。 如需对培养物进一步分析，如再培养、染色、微生物 签定或其他确定试验应在实验室的活菌操作区进行。 任何出现微生物生长的培养物不得在实验室无菌区域 内打开。不能再实验室的活菌操作区域或邻近区域进 行抽样，以防止在取样过程中使样品受到微生物的污 染，以减少假阳性的结果出现。 • 应建立实验室生物安全的应急控制预案。 • 应建立微生物实验废弃物的处理规程。
实验室的布 设备 局和运行
文件
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菌种：
由于菌种可能是微生物试验中最敏感的影响因素之一，因 此实验室应该详细规定菌种的处理和保藏方法，以尽可能 的减少菌种污染和生长特性的改变。 • 菌种的来源：已认可的国内或国外菌种保藏机构的标准菌 株，或与标准菌株所有相关特性等效的商业派生菌株。 标准菌株的复活或培养物的制备应按供应商提供的说明或 按已验证的方法进行。 • 由标准菌株复活得到的为标准储备菌株；应对标准储备菌 株进行纯度和特性确认；建议采用冻干、液氮或超低温（ 小于-30 ℃ ）保存的方法。
• 灭菌后的培养基应尽快从灭菌器内取出，琼脂培养基 应防止冷冻，因为冷冻可能破坏凝胶特性。容器应密闭 ，防止水分流失；琼脂平板宜临用新配，如置冰箱保存 ，一般不超过一周，如需延长，则应对保存期进行验证
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我们将按照以下几部分对微生物实验室进行介绍：
人员
培养基
菌种
实验室的布 设备 局和运行
文件
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实验室的布局和运行：
• 实验室布局的原则：最大程度防止微生物的污染， 防止检验过程对环境和人员造成危害。 • 实验室应具备：满足无菌检查、微生物限度检查和 无菌采样等活动的独立设置的洁净室（区）或隔离系 统；配套的细菌（真菌）实验室、培养室、准备区、 样品接受和贮藏区、标准菌株贮藏区、污染物处理区 和文档处理区等辅助实验室；上述区域应明确标识。 • 应建立洁净区的使用、维护、验证等活动的标准操 作规程。操作规程中应详细描述对进出洁净区域的人 和物的要求、洁净度检测的频率、消毒和清洁维护的 方法、尘埃粒子的标准、浮游菌和沉降菌的标准、消