CFSE标记细胞及测定细胞增殖

CFSE染色方法CFSE（Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester）染色方法是一种常用的荧光染色技术，通过这种方法可以追踪和分析细胞的增殖、分裂和活性等生理过程。

该方法利用CFSE荧光染料的特点，通过与细胞内的酯酶作用而形成的CFSE标记，来实现细胞的可见光荧光示踪。

1.准备CFSE染料溶液。

通常使用的浓度为5-10μM的CFSE染料溶液。

可以将CFSE染料溶于合适的溶剂中，如无菌PBS（磷酸盐缓冲盐水）或DMSO（二甲基亚砜）等。

2.处理待染细胞。

将需要染色的细胞分离出来，通常采用离心法获取细胞沉淀物。

接下来，将细胞悬浮液转移到培养基中。

3.CFSE染料标记。

将CFSE染料溶液与待染细胞混合，使其浓度达到适当的标记浓度。

染色时间一般为10-30分钟，但是时间过长或过短都有可能影响染料的有效标记。

染色完毕后，可以通过加入等体积的培养基来停止反应。

4.清洗和处理标记细胞。

将染色细胞通过离心去除无效的染料溶液，然后用新鲜的培养基洗涤细胞，去除未结合的染料。

5.扩增和培养标记细胞。

将清洗干净的细胞转移到含有适当培养基、生长因子和补充物的培养皿中，进行培养和扩增。

6.荧光显微观察。

通过荧光显微镜观察染色细胞，使用合适的荧光滤镜来观察CFSE荧光的发射。

CFSE染色方法的优势是可以追踪不同细胞的活动和增殖过程，如细胞分裂、生长速度等。

此外，该方法简单、可靠、重复性好，并适用于各种类型的细胞。

通过CFSE染色可以实现对细胞的定量和定性分析，对研究细胞增殖、分化、迁移等生命过程有重要意义。

总之，CFSE染色方法可以通过荧光示踪技术追踪和分析细胞的增殖和分裂过程。

通过上述实验步骤，可以成功地进行CFSE染色实验，并通过荧光显微镜观察和分析染色细胞的活动状态。

这项技术在生物学、生物医学和药物研发等领域有着广泛的应用前景。

本文受国家973计划(2005CB523202)资助作者简介:赵和平(1983年-),男,硕士,主要从事动物病毒疫苗效力评价研究;通讯作者及指导教师:仇华吉(1967年-),男,博士,研究员,主要从事分子病毒学与免疫学研究,E mail:huajiqiu@ 。

免疫学技术与方法基于CFSE 染色的猪淋巴细胞增殖试验方法的建立赵和平 孙 元 袁 远 仇华吉(中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室猪传染病研究室,哈尔滨150001)中国图书分类号 S852 文献标识码 A 文章编号 1000 484X(2009)02 0159 05[摘 要] 目的:建立一种方便可靠的评价猪只细胞免疫水平的试验方法。

方法:用终浓度分别为3、6、9和12 g/ml 的刀豆素A(Con A)刺激经羧基荧光素乙酰乙酸琥珀酰亚胺酯(C FSE)染色的猪外周血单个核细胞(PBMC)3、5和7天,然后用荧光标记的单克隆抗体对CD4+和CD8+细胞进行标记,最后利用流式细胞术分析。

结果:不同浓度ConA 刺激后,猪PB MC 增殖能力不同,Con A 浓度为6 g/ml 时CD4+和CD8+细胞的细胞分裂指数最大,用MTT 试验也获得相似结果。

对PB MC 刺激5天后进行分析相对较好。

结论:建立了一种基于活细胞染料C FSE 染色的猪淋巴细胞增殖试验方法,该方法可以在单个细胞水平上有效地分析刺激后CD4+和CD8+细胞亚群的增殖水平,进而评价细胞免疫水平。

[关键词] 猪淋巴细胞;细胞免疫;C FSE 染色;淋巴细胞增殖试验A method for detecting porcine lymphocyte proliferation based on CFSE stainingZ HAO He Ping ,SU N Yuan ,YU AN Yuan,QIUHua Ji.Division o f Swine Infectious Diseases,Harbin Veterinary Research Institute,The Chinese Academy o f Agricultural Sciences,Harbin 150001,China[Abstract] Objective:To develop a method to assess porci ne cell mediated immunity (CMI).Methods:PBMCs from pigs were stained wi th intracellular fluorescen t dye,CFSE,and stimulated wi th varied amounts of ConA (0,3,6,9,and 12 g/mL),and plated in 3replicate cul tures for 3,5,or 7days.Then CD4+cell and CD8+cells were labeled with fluorescent antibodies.Data were acquired using flow cytometry (FC M )and analyzed using CellQuest software.Results:Cell division indices of porci ne CD4+and CD8+cells were different when porcine PB MCs were sti mulated with different doses of ConA.The results were similar to those obtained by MTT method.Op timal results were obtained when porcine lymphocytes were s timulated for 5days.C onclusion:The CFSE based method developed in this study can be used to analyze the proliferation of di fferent cell subsets si multaneonsly.[Key w ords] Porcine lymphocytes;Cell mediated immunity;CFSE staining;Lymphocyte proliferation目前对我国养猪业危害最大的主要是一些病毒性疾病,这些疫病主要通过疫苗接种手段来控制。

注册 |登录构建全球华人科学博客圈返回首页 RSS 订阅 帮助 FlowJo 分析细胞增殖已有 521 次阅读 2012-8-21 14:20 |个人分类:FlowJo 使用|系统分类:科研笔记|关键词:细胞增殖，数据分析，FlowJo ，CFSE ，博文FlowJo 分析细胞增殖CFSE 法检测细胞增殖的原理：CFSE(CFDA-SE)是一种可对活细胞进行荧光标记的细胞染色试剂，CFSE 进入细胞后可以不可逆地与细胞内的氨基结合偶联到细胞蛋白质上。

在细胞分裂增殖过程中，CFSE 标记荧光可平均分配至两个子代细胞中,因此其荧光强度是亲代细胞的一半。

演示数据：Proliferation tutorial ：实验中所用的荧光染料为eFluor ® 670 Proliferation Tutorial Data.rarFlowJo 分析细胞增殖的步骤：1. 确定要分析的目标细胞群（下图为演示数据中的样本Sample 1）2. 打开增殖分析平台：到“工具”菜单栏中选择“细胞增殖”，打开增殖分析平台，将参数轴中的参数更换为本实验中所采用的APC_A::670Dye ，如下图所示：张千君加为好友 给我留言 打个招呼发送消息FlowJo 中文技术博客分享/u/FlowJo流式细胞技术相关资源分享，流式细胞数据分析，流式技术支持及培训博客首页动态记录博文相册主题分享好友留言板个人资料左边为拟合结果图，右边为各个统计数据，其中：RMS: root mean square error的缩写，反映的是拟合结果与实际数据的吻合程度，RMS数值越小，说明拟合结果越好。

3.打开增殖分析平台左下角的“Options”选项选项中各个参数的介绍：#Peaks：增殖峰的数目，默认的最大数目为8个。

随着细胞的分裂，子代细胞所含的CFSE荧光染料的量以2倍的比例递减，分裂到第七代的时候，第七代细胞的CFSE荧光强度只有原代细胞的1/128，可能低于细胞的自发荧光。

cfse计算公式CFSE（Compound Fluorescence Spectral Energy）是一种用于测量细胞活性的技术，它可以用来评估细胞的增殖状态。

CFSE是一种染料，它可以结合到细胞膜上，并且可以被细胞内的酶分解，从而产生荧光信号。

CFSE的计算公式是：CFSE = (F1-F2)/F1，其中F1是细胞分裂前的荧光强度，F2是细胞分裂后的荧光强度。

CFSE技术可以用来评估细胞的增殖状态，因为它可以检测细胞分裂前后的荧光强度变化。

CFSE技术的优点是它可以检测细胞的增殖状态，而不会影响细胞的生长和发育。

此外，CFSE技术可以用来检测细胞的活性，从而更好地了解细胞的增殖状态。

CFSE技术可以用来评估细胞的增殖状态，它可以检测细胞分裂前后的荧光强度变化，从而更好地了解细胞的增殖状态。

CFSE技术的优点是它可以检测细胞的增殖状态，而不会影响细胞的生长和发育。

CFSE技术的计算公式是：CFSE = (F1-F2)/F1，其中F1是细胞分裂前的荧光强度，F2是细胞分裂后的荧光强度。

CFSE技术是一种有效的细胞活性检测技术，它可以用来评估细胞的增殖状态，从而更好地了解细胞的增殖状态。

CFSE技术的计算公式是：CFSE = (F1-F2)/F1，其中F1是细胞分裂前的荧光强度，F2是细胞分裂后的荧光强度。

CFSE技术的优点是它可以检测细胞的增殖状态，而不会影响细胞的生长和发育。

总之，CFSE技术是一种有效的细胞活性检测技术，它可以用来评估细胞的增殖状态，从而更好地了解细胞的增殖状态。

CFSE技术的计算公式是：CFSE = (F1-F2)/F1，其中F1是细胞分裂前的荧光强度，F2是细胞分裂后的荧光强度。

CFSE技术的优点是它可以检测细胞的增殖状态，而不会影响细胞的生长和发育。

因此，CFSE技术是一种有效的细胞活性检测技术，可以用来评估细胞的增殖状态。

在组织中检测细胞增殖、分化和凋亡的方法一、检测细胞增殖的方法（1）直接方法：通过直接测定进行分裂的细胞来评价细胞的增殖能力1、胸腺嘧啶核苷（3H-TdR）渗入法胸腺嘧啶核苷（TdR）是DNA特有的碱基，也是DNA合成的必需物质。

用同位素3H标记TdR即3H-TdR作为DNA合成的前体能掺入DAN合成代谢过程，通过测定细胞的放射性强度，可以反映细胞DAN的代谢及细胞增殖情况。

但是具有放射性。

2、羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂（CFSE）检测法羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂（CFSE）是一种可穿透细胞膜的荧光染料，具有与细胞特异性结合的琥珀酰亚胺脂基团和具有非酶促水解作用的羟基荧光素二醋酸盐基团，使CFSE成为一种良好的细胞标记物。

CFSE进入细胞后可以不可逆地与细胞内的氨基结合偶联到细胞蛋白质上。

当细胞分裂时，CFsE标记荧光可平均分配至两个子代细胞中，因此其荧光强度是亲代细胞的一半。

这样，在一个增殖的细胞群中，各连续代细胞的荧光强度呈对递减，利用流式细胞仪在488nm激发光和荧光检测通道可对其进行分析。

3、Brdu检测法Brdu中文全名5-溴脱氧尿嘧啶核苷，为胸腺嘧啶的衍生物，可代替胸腺嘧啶在DNA合成期（S期），活体注射或细胞培养加入，而后利用抗Brdu 单克隆抗体，ICC染色，显示增殖细胞。

同时结合其它细胞标记物，双重染色，可判断增殖细胞的种类，增殖速度，对研究细胞动力学有重要意义4、增殖标志检测有些抗原只存在于增殖细胞中，而非增值细胞缺乏这些抗原，您也可以通过特异性的单抗来对细胞增殖进行检测。

例如，在人体细胞中，Ki-67抗体识别同名蛋白，在细胞周期S期、G2期和M期表达，而在G0期和G1 期(非增殖期)不表达。

用针对Ki-67蛋白的单抗就可以检测细胞的增值情况。

由于需要组织切片，这种方法无法进行高通量分析。

不过这一方法颇受癌症研究者们的青睐，因为它能够用来检测体内肿瘤细胞的增殖。

其他普遍使用的细胞增殖或细胞周期调控标志还包括，增殖细胞核抗原PCNA、拓扑异构酶IIB和磷酸化组蛋白H3。

・论著・文章编号:1007-8738(2004)02-0140-02荧光染料CFSE 作为细胞标记的特性研究陈蕾蕾,陈军浩,孙雪梅3,施广飞(南京大学医学院附属南京鼓楼医院医学检验中心,江苏南京210008)收稿日期:2003-07-11;　修回日期:2003-09-22基金项目:国家人事部留学回国人员科研基金资助(N o.2001233)江苏省卫生厅重点项目基金资助(N o.H200220)作者简介:陈蕾蕾(1979-),女,江苏盐城人,医学学士.T el :(025)3304616210370;Email :leileichen79@3C orresponding author摘要目的:探讨荧光染料CFSE 在作为细胞标记时的特性。

方法:应用激光共聚焦扫描显微术,观察CFSE 在细胞中的准确定位。

利用MTT 比色法测定CFSE 标记的细胞及未标记细胞的增殖情况;通过细胞计数和流式细胞仪(FC M ),测定细胞在不加任何刺激及诱导的情况下细胞数及平均荧光强度的变化趋势。

结果:在共聚焦显微镜下,可见CFSE 标记的细胞的细胞膜、细胞核及细胞质中都带有绿色荧光,以胞核荧光最强。

利用MTT 比色法测定标记及未标记细胞的A 值无显著差异。

连续6d 记录的细胞数与FC M 测定的平均荧光强度呈负相关。

结论:CFSE 可作为细胞的标记物,用于细胞移植的体内检测、细胞增殖试验及细胞分裂周期的估算等研究。

关键词:荧光染料;CFSE;细胞标记中图分类号:R392.11 文献标识码:B 荧光染料2羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯(5,62car 2boxy fluorescein diacetate succinimidyl ester ,CFSE )是一种可穿过细胞膜的荧光染料,具有与细胞结合特异性的琥珀酰亚胺酯基团与具有非酶促水解作用的羧基荧光素二醋酸盐基团结合在一起可使CFSE 成为一种良好的细胞标记物[1]。

流式细胞仪检测细胞增殖方法有哪些？在生物学和医学研究中，细胞增殖是一个关键过程，对于理解生命活动的基本规律以及疾病的发病机理具有重要意义。

随着科技的发展，流式细胞仪作为一种高效、灵敏的分析工具，广泛应用于细胞增殖的检测。

流式细胞仪通过快速分析单个细胞，可以对细胞周期、细胞增殖活性、细胞凋亡等多个方面进行研究。

本文将探讨流式细胞仪在检测细胞增殖方面的主要方法，包括但不限于溴脱氧尿苷（BrdU）掺入法、细胞周期蛋白检测法以及细胞大小分析法等，为读者提供全面的技术应用概览。

流式细胞仪检测细胞增殖方法：1、3H（氚离子）掺入法原理：是在细胞DNA合成时，用3H脱氧胸腺嘧啶核苷代替普通的脱氧胸腺嘧啶核苷掺入新合成的DNA中，增殖的细胞因为掺入3H而具有放射性，通过定量检测样品细胞的放射性大小而反映细胞的增值活性缺点：1）使用的是具有放射性的同位素，操作较为复杂，同时需要采取放射性保护措施2）低比例高活跃增殖和高比例低活跃增殖可能得到的是相同的结果，用此方法无法进行鉴别3）此方法无法进一步得到具有活性的增值细胞用于下一步的研究4）此方法时间较短，无法检测加入前细胞的增殖情况，而且检测到放射性只能说明细胞DNA合成，而不能提供合成DNA的细胞是否进入增殖阶段的信息2、相对计数法原理：将对照组和各实验组控制在相同条件下直接计数然后比较计数结果得到增殖结论注意点：对照组与实验组每种细胞所加浓度必须相同，每组至少设置3个复孔，这样每个孔可以得到1个细胞数，将3个复孔取平均值后就是这个组的结果。

如果同时需要得到每孔目标细胞增殖后的绝对参数，在每孔细胞中加入1*105PE标记的人工微球作为内参收集各组的细胞于EP管中，注意必须尽量将各组的所有细胞都收集起来。

标记需要计数细胞的标志表型的荧光素偶联抗体，4℃静置30minPBS洗涤一次，洗去游离的抗体3、示踪染料标记法示踪染料与细胞结合的方式：1）能够与细胞内的蛋白质上的氨基发生非特异性的共价结合2）能够非特异性地嵌入细胞膜的脂质双分子层中与细胞发生非共价性结合原理：示踪染料的荧光信号都很强，当细胞分裂时，母细胞内的染料会被平均分配到子细胞中，细胞荧光信号会被减弱一半，所以通过检测减弱的、发射示踪染料荧光信号的细胞比例就可以判断细胞增殖的强弱。

CFSE法检测刺激剂对淋巴细胞增殖与活化薛妮娜;董凯;来芳芳;黄蕊;陈晓光【摘要】研究不同刺激剂对人外周血淋巴细胞增殖与活化的影响.采用密度离心法分离人外周血淋巴细胞,并采用1μmol/L 的CFSE进行标记,通过流式细胞术技术检测刺激剂抗CD3/28抗体、植物血凝素(PHA)和佛波酯(PMA)培养72 h对淋巴细胞分裂与增殖的影响.并采用ELISA法检测不同刺激剂对淋巴细胞上清IFNγ质量浓度的影响.0.125 μg/mL的抗CD3/28抗体和5或10 μg/mL的PHA可以显著诱导CFSE绿色荧光逐渐递,形成类似"五指峰"样图谱,说明这两者具有很强的诱导淋巴细胞分裂与增殖的作用.相比之下,单用PMA促进淋巴细胞分裂与增殖的作用较弱.此外,抗CD3/28抗体、PHA和PMA均可增加淋巴细胞IFNγ的分泌,但其作用强度如下:抗CD3/28抗体>PHA>PMA.采用CFSE标记法检测淋巴细胞增殖的实验,得出抗CD3/28抗体和PHA是高效的淋巴细胞活化刺激剂,而且最佳质量浓度分别为0.125 μg/mL和10 μg/mL.%The aim of this pa per is to investigate the effect of different stimulants on the proliferation and activation of human peripheral blood lymphocytes. Human peripheral blood lymphocytes were isolated by density centrifugation and labeled with CFSE with the final concentratio n of 1μmol/L. Flow cytometry analysis was used to detect the division and proliferation of lymphocytes after administration of anti-CD3/28 antibody, phytohemagglutinin (PHA) and phorbol ester (PMA) for 72 h. In addition, IFNγ content that reflects the acti vation of T lymphocytes was detected by ELISA method.And found that 0.125μg/mL of anti-CD3/28 antibody and 5 or 10μg/mL of PHA could induce the gradual reduction of green fluorescence, with a "Multi-peak" pattern inflow cytometry analysis, the results indicated that both anti-CD3/28 antibody and PHA are potential had strong stimulants for lymphocyte division and proliferation. In comparison, the role of PMA alone in promoting lymphocyte division and proliferation was weak. Furthermore, anti-CD3/28 antibody, PHA and PMA almost could increase the IFNγ secretion from lymphocytes. However, anti-CD3/28 antibody was the most stimulator,PHA, and PMA was the weakest agent for stimulating the production of IFNγ in lymphocytes. In the CFSE-based proliferative assays for assessment of T cell function, this paper concluded that both anti-CD3/28 antibody and PHA were effective stimulants for the proliferation and activation of lymphocytes, with the optimal concentrations of 0.125 μg/mL and 10 μg/mL, respectively.【期刊名称】《哈尔滨商业大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2017(033)002【总页数】6页(P129-134)【关键词】淋巴细胞增殖;CFSE;干扰素γ;流式细胞术【作者】薛妮娜;董凯;来芳芳;黄蕊;陈晓光【作者单位】中国医学科学院药物研究所,天然药物活性物质与功能国家重点实验室/创新药物非临床药物代谢及PK/PD研究北京市重点实验室,北京 100050;中国医学科学院药物研究所,天然药物活性物质与功能国家重点实验室/创新药物非临床药物代谢及PK/PD研究北京市重点实验室,北京 100050;中国医学科学院药物研究所,天然药物活性物质与功能国家重点实验室/创新药物非临床药物代谢及PK/PD研究北京市重点实验室,北京 100050;中国医学科学院药物研究所,天然药物活性物质与功能国家重点实验室/创新药物非临床药物代谢及PK/PD研究北京市重点实验室,北京 100050;中国医学科学院药物研究所,天然药物活性物质与功能国家重点实验室/创新药物非临床药物代谢及PK/PD研究北京市重点实验室,北京 100050【正文语种】中文【中图分类】R446肿瘤免疫治疗己成为继手术、化疗和放疗之后的第四种常用的肿瘤治疗方法.肿瘤免疫治疗是通过激发或调动机体的免疫系统，增强肿瘤微环境的抗肿瘤免疫能力，从而控制和杀灭肿瘤细胞.而效应T淋巴细胞是诱发有效的抗肿瘤免疫反应的主要执行者，行使对肿瘤细胞的识别和消灭作用[1].在肿瘤进展过程中，肿瘤细胞通过上调一些免疫检查点分子的配体，与T淋巴细胞表面这些共抑制性受体(PD1、CTLA4、LAG3等)相互作用，从而抑制T细胞的增殖与活化，形成肿瘤免疫逃逸微环境[2-3].目前，绝大多数上市或处于临床研究阶段的抗肿瘤免疫药物都是通过抑制T细胞的负性调控信号，通过激活T淋巴细胞的增殖和活性，强化T细胞的免疫应答，最终达到抵御肿瘤细胞增长的目的.因此，T淋巴细胞的增殖与活性水平的检测是细胞免疫功能研究的常用方法，也是目前抗肿瘤免疫药物研发中一个重要的考察指标[4].氚标记胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)掺入法被广泛用于淋巴细胞增殖的检测.但是其需要使用放射性同位素标记，具有潜在的污染，并且不容易大批量操作.其次，还有一些研究者采用MTT或MTS的方法检测淋巴细胞增殖.虽然MTT或MTS的操作方法相对简单，但灵敏性不高，且此方法不适合检测一些具有氧化还原性作用的药物，这类药物可直接与MTT反应，造成假阳性.此外，3H-TdR掺入法和MTT/MTS法均是以细胞的数量来反应增殖的变化，不能反应细胞的分裂情况，且无法测定不同亚群淋巴细胞的增殖情况[5-6].羧基荧光素乙酰乙酸(Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester, CFSE)染色是一种有效的检测淋巴细胞分裂与增殖的方法.CFSE可穿过细胞膜，不可逆地与细胞内的氨基共价结合偶联到细胞内蛋白.在细胞分裂增殖过程中，CFSE标记的荧光可平均分配到两个子代细胞中，出现连续的荧光强度递减现象，在流式细胞术检测过程中出现类似“五指峰”的特征[7-8].抗CD3/28抗体、刀豆蛋白A(ConA)、植物血凝素(PHA)佛波酯(PMA)可刺激小鼠脾或人外周血T淋巴细胞增殖.目前，文献中尚未对这些刺激剂促进T淋巴细胞增殖的强度进行比较.而且报道的这些刺激剂的最佳有效剂量也不尽相同.因此，本文采用CFSE标记法检测不同刺激剂诱导人外周血淋巴细胞分裂与增殖的活性，为验证肿瘤免疫药物的活性提供有效的评价方法.1.1 全血健康志愿者的抗凝血购自中国食品药品检定研究院.1.2 主要试剂人外周血淋巴细胞提取分离液购自达科为生物技术有限公司.CFSE、PMA、和PHA购自Sigma公司，人源抗CD3、CD28抗体购自美国Miltenyi?Biotec公司.人源IFN γ 的ELISA检测试剂盒购自cloud-clone公司.RPMI1640培养基和胎牛血清购自美国GIBCO公司.1.3 主要仪器FACSVerse流式细胞仪为美国BD公司产品，Synergy H1多功能酶标仪为美国Bio-Tek公司产品，CO2培养箱为日本三洋公司产品，冷冻离心机为美国Sigma 公司产品.2.1 淋巴细胞的制备将健康志愿者的抗凝血与PBS混合，再缓慢加至淋巴细胞分离液中(这三者的终体积比例为1∶1∶1)，室温，800 r/min离心30 min.小心吸取中间的一层薄而致密的白膜(淋巴细胞层)至另一层离心管中，用PBS重悬洗涤2次，计数，调整细胞浓度为1×107/mL.2.2 CFSE标记淋巴细胞在上述淋巴细胞悬液中加入CFSE染液(CFSE，终浓度为1 μmol/L)，37 ℃避光孵育10 min，每5 min混匀细胞.加入预冷的2 mL灭活牛血清冰上终止2 min，1 500 r/min离心5 min，用预冷的含10%灭活胎牛血清的PBS洗涤2次.离心，用含10%胎牛血清的RPMI1640培养基重悬，计数，将细胞调整为3×106/mL，加入96孔圆底板，每孔100 μL，洗涤及离心过程中注意避光.2.3 流式细胞术检测淋巴细胞增殖活性向上述接种至96孔圆底板的淋巴细胞中分别加入100 μL含不同剂量的刺激剂的RPMI1640完全培养基：抗CD3/28抗体(终质量浓度：0.125、0.5、1、1.5μg/mL)、PHA(终质量浓度：1、5、10 μg/mL)和PMA(终质量浓度：1、5、10 ng/mL).每组实验做三个平行孔，置于37℃，5%CO2细胞培养箱中继续孵育72h.离心，收集细胞上清，冻于-80 ℃冰箱保存.将细胞用预冷PBS洗涤2次，并用200 μL PBS重悬，采用流式细胞检测仪(BD FACS Verse)检测淋巴细胞的分裂和增殖情况，并采用Flowjo 7.6软件计算淋巴细胞增殖情况(CFSE荧光强度减低的细胞百分比)和分裂指数(CFSE荧光强度减低的细胞百分比与CFSE荧光强度不变的细胞百分比的比值).2.4 ELISA法检测淋巴细胞上清IFNγ质量浓度取上述条件下淋巴细胞上清液，采用ELISA法检测IFNγ的质量浓度.操作步骤参照试剂盒说明书.简要步骤如下：1)加入100 μL倍比稀释的人源IFNγ标准品及淋巴细胞上清原液，室温静置1 h；2)充分弃上清，分别加入1∶100稀释的IFNγ的一抗，室温静置1 h；3)弃上清，洗涤三次后，加入1∶100稀释后的IFNγ的二抗，室温静置30 min；4)弃上清，洗涤5次后，加90 μL底物(TMB)显色，室温避光放置15 min；5)加50 μL的硫酸终止反应；6)酶标仪450 nmol/L下检测淋巴细胞培养上清液中IFNγ的含量.2.5 统计分析数据采用Mean±SD表示，用SPSS17.0软件对实验数据进行显著性分析，P≤0.05具有统计学意义.3.1 CFSE法淋巴细胞增殖实验中细胞门的确定采用Flowjo 7.6软件对淋巴细胞分裂与增殖进行分析.根据前向散射角(FSC)和侧向角散射(SSC)显示图，发现排除了细胞碎片群外，在正常条件下，淋巴细胞主要分布为左下群，均一度较好的一簇细胞群.在接受不同刺激剂活化后，左下的淋巴细胞群开始往右上方移动，且出现比较散在的细胞群.根据流式细胞术的原理，我们认为在刺激剂活化淋巴细胞后，淋巴细胞出现不同程度的分裂和增殖，其细胞大小和均一度都发生改变，从而显示在右上方散在的细胞群.我们把原始淋巴细胞命名为R1门，刺激剂活化后的淋巴细胞命名为R2门(如图1(A)～(B)所示).且在正常条件下，R1门的细胞具有强的CFSE染色荧光(单峰)；在刺激剂作用下，R2门内增殖的淋巴细胞出现逐渐递减的CFSE染色荧光(多峰)(如图1(C)～(D)所示).3.2 抗CD3/28抗体对淋巴细胞分裂与增殖活性的影响抗CD3和CD28抗体分别在体外模拟特异性T淋巴细胞活化的第一信号和第二信号，是T淋巴细胞活化常用的刺激剂.我们采用CFSE染色，通过流式细胞术检测抗CD3和CD28抗体对淋巴细胞增殖的影响.如图2(A)～(B)所示，抗CD3/28抗体可以强效地诱导绿色荧光强度逐渐递减，形成类似“五指峰”样图谱，说明抗CD3/28抗体可以显著促进淋巴细胞分裂和增殖.且在0.125～1.5 μg/mL剂量范围内，抗CD3/28抗体诱导的“五指峰”图几乎重叠.对其增殖指数和分裂指数进行统计，如图2(C)～(D)所示，0.125～1.5 μg/mL 的抗CD3/28抗体诱导淋巴细胞增殖百分比基本可达到75%(P≤0.001)，其诱导淋巴细胞分裂指数可达3倍(P≤0.001).但随着抗CD3/28抗体质量浓度的增加，1.5 μg/mL的抗CD3/28抗体诱导淋巴细胞分裂指数反而有所下降.因此，在诱导淋巴细胞增殖实验中，选用终质量浓度为0.125 μg/mL的抗CD3/28抗体即可.3.3 PHA对淋巴细胞分裂与增殖活性的影响PHA是一种有丝分裂原，主要用于激活淋巴细胞.对PHA的不同质量浓度进行分析表明，PHA可以剂量依赖性地促进淋巴细胞分裂与增殖.1 μg/mL的PHA促进淋巴细胞增殖和分裂指数分别为40.9%和0.69倍.当质量浓度为10 μg/mL 时，PHA促进淋巴细胞增殖的效果最为明显，淋巴细胞增殖和分裂指数为85.7%和4.7倍(如图3所示).3.4 PMA对淋巴细胞分裂与增殖活性的影响PMA是PKC信号的激活物，PKC信号在T淋巴细胞活化中占据重要地位.所以PMA也是T淋巴细胞活化常用刺激剂之一.对PMA的不同质量浓度进行分析表明，虽然PHA也可剂量依赖性地促进淋巴细胞分裂与增殖，但其诱导淋巴细胞增殖能力较弱，5 ng/mL和10 ng/mL的PMA诱导淋巴细胞增殖指数才到达20%，此剂量下的分裂指数才达到0.2倍(如图4所示).3.5 不同刺激剂对淋巴细胞IFNγ分泌的影响收集不同刺激剂培养淋巴细胞72h后的上清液，采用ELISA法检测IFNγ的质量浓度.如图5所示，0.125 μg/mL抗CD3/28抗体、10 μg/mL PHA和10 ng/mL PMA均可显著增加淋巴细胞IFNγ的分泌(P≤0.001).但其增加淋巴细胞IFNγ分泌量的顺序是抗CD3/28抗体>PHA>PMA.淋巴细胞增殖实验是评价机体免疫功能的常用方法.CFSE染色法是近年来广泛代替3H-TdR掺入法和MTT显色法的一种快速、无污染的检测淋巴细胞增殖的方法.CFSE染色结合流式细胞术技术能在不同淋巴细胞亚群及单个细胞水平上动态的分析淋巴细胞增殖情况[9-11].小分子药物单独作用在体外几乎不刺激淋巴细胞增殖，需要在淋巴细胞活化的基础上，进一步评价小分子药物调节淋巴细胞增殖的作用.因此，采用CFSE法，寻找不同刺激剂活化淋巴细胞的最佳剂量，是评价调节淋巴细胞增殖的小分子药物的必要前提.本实验采用人外周血提取获得淋巴细胞，在不同剂量的抗CD3/28抗体、PHA和PMA作用下，观察淋巴细胞的增殖和分裂指数.实验中发现，比以往报道用量更低的抗CD3/28抗体(0.12 5μg/mL)即可高效的刺激T淋巴细胞的分裂与增殖[12].5 μg/mL的PHA促进淋巴细胞增殖和分裂指数分别为75%和3倍，这与Fulcher D等研究者的报道一致[7].由于PHA可以剂量依赖性地增加淋巴细胞增殖与分裂，可根据需要活化的淋巴细胞的强弱选择合适的PHA的剂量，同时，PHA 又便宜.因此，PHA可用于调节淋巴细胞增殖的化合物的大量筛选.相比之下，PKC 信号的激动剂PMA促进淋巴细胞增殖的能力较弱.可能是因为T淋巴细胞的活化需要PKC信号和Ca2+信号共同参与，因此单一的PMA对淋巴细胞的活化作用较弱，需要与离子霉素联用(Ca2+激动剂)可能对显示出更强的促进淋巴细胞增殖的活性.这与Castagna M等人的研究相一致[13].IFNγ是T淋巴细胞活化的重要指标[14-15].实验发现抗CD3/28抗体、PHA和PMA都能显著增加淋巴细胞IFNγ的分泌，也证明了这三类刺激剂对T淋巴细胞的活化作用.并且这三种刺激剂增加IFNγ的分泌的程度与其诱导淋巴细胞分裂与增殖的程度相对应.后续将进一步研究这些刺激剂对不同亚群T淋巴细胞的促增殖作用.【相关文献】[1] LANITIS E, POUSSIN M, KLATTENHOFF A W, et al. Chimeric antigen receptor T Cells with dissociated signaling domains exhibit focused antitumor activity with reduced potential for toxicity in vivo [J]. Cancer immunology research, 2013, 1(1): 43-53.[2] YAO S, ZHU Y, CHEN L. Advances in targeting cell surface signalling molecules for immune modulation [J]. Nature reviews Drug discovery, 2013, 12(2): 130-146.[3] NIRSCHL C J, DRAKE C G. Molecular pathways: coexpression of immune checkpoint molecules: signaling pathways and implications for cancer immunotherapy [J]. Clinical cancer research: an official journal of the American Association for Cancer Research, 2013, 19(18): 4917-4924.[4] BOCHAROV G, LUZYANINA T, CUPOVIC J, et al. Asymmetry of Cell Division in CFSE-Based Lymphocyte Proliferation Analysis [J]. Front Immunol, 2013, 4(264): 1-7.[5] 王玲, 王宏, 刘越坚, 等. 利用CFSE标记检测CD8+淋巴细胞增殖[J]. 大连医科大学学报, 2004, 26(4): 262-264.[6] 季宇彬, 冯小燕, 高世勇, 等. 甜菜碱对小鼠脾淋巴细胞的增殖作用[J].哈尔滨商业大学学报:自然科学版, 2008, 24(4): 385-388.[7] FULCHER D, WONG S. Carboxyfluorescein succinimidyl ester-based proliferative assays for assessment of T cell function in the diagnostic laboratory[J]. Immunol Cell Biol, 1999, 77(6): 559-564.[8] POPMA S H, KRASINSKAS A M, MCLEAN A D, et al. Immune monitoring in xenotransplantation: the multiparameter flow cytometric mixed lymphocyte culture assay [J]. Cytometry, 2000, 42(5): 277-283.[9] VENKEN K, THEWISSEN M, HELLINGS N, et al. A CFSE based assay for measuringCD4+CD25+ regulatory T cell mediated suppression of auto-antigen specific and polyclonal T cell responses [J]. J Immunol Methods, 2007, 322(1-2): 1-11.[10] GANUSOV V V, MILUTINOVIC D, DE BOER R J. IL-2 regulates expansion of CD4+ T cell populations by affecting cell death: insights from modeling CFSE data[J]. J Immunol, 2007,179(2): 950-957.[11] 包晶晶, 林海霞, 马璟, 等. CFSE示踪与流式细胞仪检测法研究环磷酰胺对T淋巴细胞增殖的影响[J]. 中国药理学通报, 2010, 26(6): 828-831.[12] THOMAS A K, MAUS M V, SHALABY W S, et al. A cell-based artificial antigen-presenting cell coated with anti-CD3 and CD28 antibodies enables rapid expansion and long-term growth of CD4 T lymphocytes [J]. Clin Immunol, 2002, 105(3): 259-272. [13] CASTAGNA M, TAKAI Y, KAIBUCHI K, et al. Direct activation of calcium-activated, phospholipid-dependent protein kinase by tumor-promoting phorbol esters [J]. J Biol Chem, 1982, 257(13): 7847-7851.[14] 严俊, 姚堃, 周瑶玺. T细胞活化、活化信号和IFN-γ诱生的关系研究[J].免疫学杂志, 1992,8(2): 95-98.[15] MCNANARA M J, HILGART-MARTISZUS I, BARRAGAN E D M, et al. Interferon-gamma production by peripheral lymphocytes predicts survival of tumor-bearing mice receiving dual PD-1/CTLA-4 blockade [J]. Cancer Immunol Res, 2016, 4(8): 650-657.。

cfse法检测细胞增殖的原理嗨，宝子！今天咱们来唠唠CFSE法检测细胞增殖这个超有趣的事儿。

CFSE呢，它的全名有点长，不过咱不用纠结那个。

这CFSE就像是一个超级小的彩色标签，专门给细胞准备的。

细胞啊，就像一个个小小的生命精灵，在我们身体里或者在实验室的培养皿里忙活着它们自己的事儿。

CFSE这个小标签是怎么和细胞增殖联系起来的呢？你想啊，细胞要增殖的时候，那就是一个变两个，两个变四个这样的过程。

CFSE这个聪明的小标签呢，它可以很轻松地进入细胞内部。

一旦进入细胞，它就像是和细胞签订了一个特殊的契约。

当细胞还没有开始增殖的时候，每个细胞都带着自己的CFSE小标签，这个小标签会发出一种特定的荧光信号。

就像每个细胞都戴着一个独特的会发光的小帽子一样，特别酷。

然后呢，细胞开始增殖啦。

这时候可就好玩儿了。

在细胞分裂的过程中，这个CFSE小标签可不是一成不变的哦。

它会像分蛋糕一样，平均地分配到新产生的细胞里面。

比如说，原来一个细胞里有一份CFSE，那分裂成两个细胞的时候呢，这两个新细胞就各自带着半份CFSE。

随着细胞不断地增殖，每分裂一次，细胞里面的CFSE就会被再分一次。

这样一来，经过几次分裂之后，细胞里面的CFSE就越来越少啦。

那这个和检测细胞增殖有啥关系呢？关系可大了去了。

因为CFSE的量和它发出的荧光强度是有关系的。

一开始，细胞带着满满的CFSE，荧光就很强。

随着细胞增殖，CFSE被不断地分来分去，荧光就会越来越弱。

我们通过专门的仪器去检测这些细胞的荧光强度，就能够知道细胞增殖了多少次啦。

这就好比是在数一群小动物的繁殖情况。

每只小动物出生的时候都戴着一个特殊的铃铛，随着它们不断繁殖后代，铃铛就会被分成更小的部分给新出生的小动物。

我们只要看看铃铛的大小或者铃铛发出声音的大小（就像CFSE的荧光强度），就能知道小动物繁殖了多少代了。

而且呢，CFSE法特别的精准。

它就像一个超级细心的小侦探，不会放过任何一个细胞增殖的小细节。

在组织中检测细胞增殖、分化和凋亡的方法一、检测细胞增殖的方法（1）直接方法：通过直接测定进行分裂的细胞来评价细胞的增殖能力1、胸腺嘧啶核苷（3H-TdR）渗入法胸腺嘧啶核苷（TdR）是DNA特有的碱基，也是DNA合成的必需物质。

用同位素3H 标记TdR即3H-TdR作为DNA合成的前体能掺入DAN合成代谢过程，通过测定细胞的放射性强度，可以反映细胞DAN的代谢及细胞增殖情况。

但是具有放射性。

2、羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂（CFSE）检测法羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂（CFSE）是一种可穿透细胞膜的荧光染料，具有与细胞特异性结合的琥珀酰亚胺脂基团和具有非酶促水解作用的羟基荧光素二醋酸盐基团，使CFSE成为一种良好的细胞标记物。

CFSE进入细胞后可以不可逆地与细胞内的氨基结合偶联到细胞蛋白质上。

当细胞分裂时，CFsE标记荧光可平均分配至两个子代细胞中，因此其荧光强度是亲代细胞的一半。

这样，在一个增殖的细胞群中，各连续代细胞的荧光强度呈对递减，利用流式细胞仪在488nm激发光和荧光检测通道可对其进行分析。

3、Brdu检测法Brdu中文全名5-溴脱氧尿嘧啶核苷，为胸腺嘧啶的衍生物，可代替胸腺嘧啶在DNA 合成期（S期），活体注射或细胞培养加入，而后利用抗Brdu单克隆抗体，ICC染色，显示增殖细胞。

同时结合其它细胞标记物，双重染色，可判断增殖细胞的种类，增殖速度，对研究细胞动力学有重要意义4、增殖标志检测有些抗原只存在于增殖细胞中，而非增值细胞缺乏这些抗原，您也可以通过特异性的单抗来对细胞增殖进行检测。

例如，在人体细胞中，Ki-67抗体识别同名蛋白，在细胞周期S期、G2期和M期表达，而在G0期和G1 期(非增殖期)不表达。

用针对Ki-67蛋白的单抗就可以检测细胞的增值情况。

由于需要组织切片，这种方法无法进行高通量分析。

不过这一方法颇受癌症研究者们的青睐，因为它能够用来检测体内肿瘤细胞的增殖。

其他普遍使用的细胞增殖或细胞周期调控标志还包括，增殖细胞核抗原PCNA、拓扑异构酶IIB和磷酸化组蛋白H3。

在组织中检测细胞增殖、分化和凋亡的方法一、宇文皓月二、检测细胞增殖的方法（1）直接方法：通过直接测定进行分裂的细胞来评价细胞的增殖能力1、胸腺嘧啶核苷（3H-TdR）渗入法胸腺嘧啶核苷（TdR）是DNA特有的碱基，也是DNA合成的必须物质。

用同位素3H标识表记标帜TdR即3H-TdR作为DNA合成的前体能掺入DAN合成代谢过程，通过测定细胞的放射性强度，可以反映细胞DAN的代谢及细胞增殖情况。

但是具有放射性。

2、羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂（CFSE）检测法羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂（CFSE）是一种可穿透细胞膜的荧光染料，具有与细胞特异性结合的琥珀酰亚胺脂基团和具有非酶促水解作用的羟基荧光素二醋酸盐基团，使CFSE成为一种良好的细胞标识表记标帜物。

CFSE进入细胞后可以不成逆地与细胞内的氨基结合偶联到细胞蛋白质上。

当细胞分裂时，CFsE标识表记标帜荧光可平均分配至两个子代细胞中，因此其荧光强度是亲代细胞的一半。

这样，在一个增殖的细胞群中，各连续代细胞的荧光强度呈对递减，利用流式细胞仪在488nm激发光和荧光检测通道可对其进行分析。

3、Brdu检测法Brdu中文全名5-溴脱氧尿嘧啶核苷，为胸腺嘧啶的衍生物，可代替胸腺嘧啶在DNA合成期（S期），活体注射或细胞培养加入，而后利用抗Brdu单克隆抗体，ICC染色，显示增殖细胞。

同时结合其它细胞标识表记标帜物，双重染色，可判断增殖细胞的种类，增殖速度，对研究细胞动力学有重要意义4、增殖标记检测有些抗原只存在于增殖细胞中，而非增值细胞缺乏这些抗原，您也可以通过特异性的单抗来对细胞增殖进行检测。

例如，在人体细胞中，Ki-67抗体识别同名蛋白，在细胞周期S期、G2期和M期表达，而在G0期和G1 期(非增殖期)不表达。

用针对Ki-67蛋白的单抗就可以检测细胞的增值情况。

由于需要组织切片，这种方法无法进行高通量分析。

不过这一方法颇受癌症研究者们的青睐，因为它能够用来检测体内肿瘤细胞的增殖。

在组织中检测细胞增殖、分化和凋亡的方法之邯郸勺丸创作二、检测细胞增殖的方法（1）直接方法：通过直接测定进行分裂的细胞来评价细胞的增殖能力1、胸腺嘧啶核苷（3H-TdR）渗入法胸腺嘧啶核苷（TdR）是DNA特有的碱基, 也是DNA合成的必需物质.用同位素3H标识表记标帜TdR即3H-TdR作为DNA合成的前体能掺入DAN合成代谢过程, 通过测定细胞的放射性强度, 可以反映细胞DAN的代谢及细胞增殖情况.可是具有放射性.2、羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂（CFSE）检测法羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂（CFSE）是一种可穿透细胞膜的荧光染料, 具有与细胞特异性结合的琥珀酰亚胺脂基团和具有非酶促水解作用的羟基荧光素二醋酸盐基团, 使CFSE成为一种良好的细胞标识表记标帜物.CFSE进入细胞后可以不成逆地与细胞内的氨基结合偶联到细胞卵白质上.当细胞分裂时, CFsE标识表记标帜荧光可平均分配至两个子代细胞中, 因此其荧光强度是亲代细胞的一半.这样, 在一个增殖的细胞群中, 各连续代细胞的荧光强度呈对递加, 利用流式细胞仪在488nm激发光和荧光检测通道可对其进行分析.3、Brdu检测法Brdu中文全名5-溴脱氧尿嘧啶核苷, 为胸腺嘧啶的衍生物, 可取代胸腺嘧啶在DNA合成期（S期）, 活体注射或细胞培养加入, 而后利用抗Brdu单克隆抗体, ICC染色, 显示增殖细胞.同时结合其它细胞标识表记标帜物, 双重染色, 可判断增殖细胞的种类, 增殖速度, 对研究细胞动力学有重要意义4、增殖标识表记标帜检测有些抗原只存在于增殖细胞中, 而非增值细胞缺乏这些抗原, 您也可以通过特异性的单抗来对细胞增殖进行检测.例如, 在人体细胞中, Ki-67抗体识别同名卵白, 在细胞周期S期、G2期和M 期表达, 而在G0期和G1 期(非增殖期)不表达.用针对Ki-67卵白的单抗就可以检测细胞的增值情况.由于需要组织切片, 这种方法无法进行高通量分析.不外这一方法颇受癌症研究者们的青睐, 因为它能够用来检测体内肿瘤细胞的增殖.其他普遍使用的细胞增殖或细胞周期调控标识表记标帜还包括, 增殖细胞核抗原PCNA、拓扑异构酶IIB和磷酸化组卵白H3.（2）间接方法：通过检测样品中健康细胞的数目来评价细胞的增殖能力1、MTT检测法MTT检测法主要反映细胞的能量代谢, 是检测细胞增殖活力的一种简便准确的方法, 其原理是在活细胞生长和增殖过程中, 线粒体内的脱氢酶可将黄色的MTT分解成兰紫色的甲（Formazan）, 生成的甲量的几多与细胞的数量和细胞的活力成正比.2、ATP检测细胞内的ATP含量受到了严格调控, 检测ATP也可以获得细胞增殖的信息.死亡细胞或即将死亡的细胞几乎不含ATP, 在细胞溶解物或提取物中测得的ATP浓度与细胞数之间存在严格的线性关系.利用荧光素酶luciferase及其底物荧光素luciferin的ATP检测以生物发光为基础, 能够为您提供非常灵敏的结果.如果有ATP存在荧光素酶就会发光, 而且其发光强度与ATP浓度成正比, 用能读取发光信号的光度计和酶标仪都可以方便的进行检测.这种方法非常适用于高通量细胞增殖检测和筛选.三、检测细胞分化的方法1、流式鉴定细胞概况标识表记标帜, 以判断细胞是否分化2、观察细胞形态, 与已分化的细胞进行比较3、分化诱导评估其分化能力四、检测细胞凋亡的方法（1）形态学检测1、光学显微镜和颠倒显微镜染色细胞：凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化, 核膜裂解、染色质分割成块状和凋亡小体等典范的凋亡形态.经常使用染色方法：①苏木精=伊红染色②甲基绿-派诺宁染色：与坏死相比, 细胞凋亡的细胞内常有RNA表达的增强, 用甲基绿特异性染色DNA, 派诺宁对RNA亲和力强, 若胞质呈派诺宁阳性为凋亡, 阴性为坏死.（前提是已经判断细胞处于死亡形态, 通过形态学判断）③吖啶橙染色法：.它与细胞中DNA和RNA结合量存在分歧, 可发出分歧颜色的荧光, 与DNA结合量少发绿色荧光, 与RNA结合量多发桔黄色或桔红色荧光.该染料具有膜通透性, 能透过细胞膜, 使核DNA和RNA染色.因此, 在荧光显微镜下观察, 吖啶橙可透过正常细胞膜, 使细胞核呈绿色或黄绿色均匀荧光；在凋亡细胞中, 因染色质固缩或断裂为年夜小不等的片断, 形成凋亡小体.吖啶橙使其染上致密浓染的黄绿色荧光, 或黄绿色碎片颗粒；而坏死细胞黄荧光减弱甚至消失.吖啶橙染液有毒, 把持时要戴手套, 需避光.（凋亡小体）2、荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜一般以细胞核染色质的形态学改酿成指标来评判细胞凋亡的进展情况.经常使用的DNA特异性染料有：HO 33342 (Hoechst 33342), HO 33258 (Hoechst 33258), DAPI.三种染料与 DNA的结合是非嵌入式的, 主要结合在DNA的A-T碱基区.紫外光激发时发射明亮的蓝色荧光.Hoechst是与DNA特异结合的活性染料, 贮存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度, 使用时用PBS稀释成终浓度为2~5mg/ml.DAPI 为半通透性, 用于惯例固定细胞的染色.贮存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度, 使用终浓度一般为0.5 ~1mg/ml.结果评判：细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期：Ⅰ期的细胞核呈波纹状(rippled)或呈折缝样(creased), 部份染色质呈现浓缩状态;Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化;Ⅱb期的细胞核裂解为碎块, 发生凋亡小体（如图）.3、透射电子显微镜观察凋亡细胞体积变小, 细胞质浓缩.凋亡Ⅰ期（pro-apoptosis nuclei）的细胞核内染色质高度盘绕, 呈现许多称为气穴现象（cavitations）的空泡结构(如图)；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；细胞凋亡的晚期, 细胞核裂解为碎块, 发生凋亡小体.（2）检测凋亡标识表记标帜物质1、磷脂酰丝氨酸外翻分析(Annexin V法)磷脂酰丝氨酸(Phosphatidylserine, PS)正常位于细胞膜的内侧, 但在细胞凋亡的早期, PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的概况, 流露在细胞外环境中(图3).Annexin-V是一种分子量为35~36KD的Ca2+依赖性磷脂结合卵白, 能与PS高亲和力特异性结合.将Annexin-V进行荧光素(FITC、PE)或biotin标识表记标帜, 以标识表记标帜了的Annexin-V作为荧光探针, 利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生.碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一种核酸染料, 它不能透过完整的细胞膜, 但在凋亡中晚期的细胞和死细胞, PI能够透过细胞膜而使细胞核红染.因此将Annexin-V与PI匹配使用, 就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来.2、线粒体膜势能的检测线粒体在细胞凋亡的过程中起着枢纽作用, 多种细胞凋亡安慰因子均可诱导分歧的细胞发生凋亡, 而线粒体跨膜电位的下降, 被认为是细胞凋亡级联反应过程中最早发生的事件, 它发生在细胞核凋亡特征(染色质浓缩、DNA断裂)呈现之前, 一旦线粒体DYmt解体, 则细胞凋亡不成逆转.线粒体跨膜电位的存在, 使一些亲脂性阳离子荧光染料如Rhodamine 123、3, 3-Dihexyloxacarbocyanine iodide[DiOC6(3)]、Tetrechloro-tetraethylbenzimidazol carbocyanine iodide[JC-1]、Tetramethyl rhodamine methyl ester(TMRM)等可结合到线粒体基质, 其荧光的增强或减弱说明线粒体内膜电负性的增高或降低.将正常培养的细胞和诱导凋亡的细胞加入使用终浓度为Rhodamine 123(1mM)或终浓度为DiOC6(25nM), JC-1(1mM), TMRM(100nM), 37°C平衡30min, 流式细胞计检测细胞的荧光强度.3、TUNEL法细胞凋亡中, 染色体DNA双链断裂或单链断裂而发生年夜量的粘性3'-OH末端, 可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT)的作用下, 将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸酶或生物素形成的衍生物标识表记标帜到DNA的3'-末端, 从而可进行凋亡细胞的检测, 这类方法（称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标识表记标帜法(terminal -deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL).由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂, 因而没有3'-OH形成, 很少能够被染色.TUNEL实际上是分子生物学与形态学相结合的研究方法, 对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色, 能准确地反应细胞凋亡典范的生物化学和形态特征, 可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、培养的细胞和从组织中分离的细胞的细胞形态测定, 并可检测出极少量的凋亡细胞, 因而在细胞凋亡的研究中被广泛采纳.（3）DNA片断化检测1、年夜分子染色体DNA片段的测定细胞凋亡的早期,染色体断裂成为50~300 kbp长的DNA年夜片段.所有超越一定分子量年夜小的双链DNA分子在琼脂糖凝胶中的迁移速度相同.线性DNA的双螺旋半径超越凝胶半径时, 即到达分辨力的极限.此时凝胶不再按分子量的年夜小来筛分DNA, DNA 像通过弯管一样, 以其一端指向电场一极而通过凝胶, 这种迁移模式称之为"爬行".因此, 细胞凋亡早期发生的50~300 kbp长的DNA年夜片段不能用普通的琼脂糖凝胶电泳来分离.通常采纳脉冲电泳技术可圆满地解决这一问题.这个方法是在凝胶上外加正交的交变脉冲电场.每当电场方向改变后, 年夜的DNA分子便滞流在爬行管中, 直至新的电场轴向重新定向后, 才华继续向前移动.DNA 分子量越年夜, 这种重排所需要的时间就越长.当DNA分子变换方向的时间小于电脉冲周期时, DNA就可以按其分子量年夜小分开.2、DNA Ladder 测定细胞凋亡时主要的生化特征是其染色质发生浓缩, 染色质DNA在核小体单元之间的连接处断裂, 形成50~300 kbp长的DNA 年夜片段, 或180~200 bp整数倍的寡核苷酸片段, 在凝胶电泳上暗示为梯形电泳图谱(DNA ladder).细胞经处置后, 采纳惯例方法分离提纯DNA, 进行琼脂糖凝胶和溴化乙啶染色, 在凋亡细胞群中可观察到典范的DNA ladder.如果细胞量很少, 还可在分离提纯DNA后, 用32P-ATP和脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT)使DNA 标识表记标帜, 然后进行电泳和放射自显影, 观察凋亡细胞中DNA ladder的形成.3、凋亡细胞DNA含量的流式细胞计分析（4）Caspase-3活性的检测Caspase家族在介导细胞凋亡的过程中起着非常重要的作用, 其中caspase-3为关键的执行分子, 它在凋亡信号传导的许多途径中发挥功能.Caspase-3正常以酶原(32KD)的形式存在于胞浆中, 在凋亡的早期阶段, 它被激活, 活化的Caspase-3由两个年夜亚基(17KD)和两个小亚基(12KD)组成, 裂解相应的胞浆胞核底物, 最终招致细胞凋亡.但在细胞凋亡的晚期和死亡细胞, caspase-3的活性明显下降.1、westernblot2. 荧光分光光度计分析活化的Caspase-3能够特异切割D1E2V3D4-X底物, 水解D4-X肽键.根据这一特点, 设计出荧光物质偶联的短肽Ac-DEVD-AMC.在共价偶联时, AMC不能被激发荧光, 短肽被水解后释放出AMC, 自由的AMC才华被激发发射荧光.根据释放的AMC荧光强度的年夜小, 可以测定caspase-3的活性, 从而反映Caspase-3被活化的水平.（5）凋亡相关卵白TFAR19卵白的表达和细胞定位分析TFAR19(PDCD5)是增进细胞凋亡的增强剂.利用荧光素(FITC)标识表记标帜的TFAR19单克隆抗体为探针, 对细胞凋亡过程中TFAR19卵白的表达水平及定位研究发现, 凋亡早期TFAR19表达水平增高并呈现快速核转位现象, 陪伴着细胞核形态学的变动, 继续较长时间, 在凋亡小体中仍然可见.同时我们发现, 凋亡早期TFAR19卵白的核转位早于磷脂酰丝氨酸(PS)外翻和细胞核DNA的片段化, 提示TFAR19卵白的核转位是细胞凋亡更早期发生的事件之一.进一步的研究证明, 凋亡早期TFAR19的核转位具有普遍意义, 分歧细胞凋亡早期均呈现TFAR19高表达和核转位.这为研究细胞凋亡早期所发生的事件, 提供了一种新的技术和指标.创作时间：二零二一年六月三十日创作时间：二零二一年六月三十日。