生物技术通报ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹＢＵＬＬＥＴＩＮ・技术与方法・２００７年第５期收稿日期：２００７－０４－１１作者简介：邓文星，山西农业大学聚合酶链反应（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ，ＰＣＲ）技术是１９８５年开始出现的一项基因检测技术。
由于ＰＣＲ技术简便易行、灵敏度高等优点，该技术被广泛应用于基础研究，成为分子生物学必不可少的研究工具。
由于传统的ＰＣＲ技术存在，不能准确定量，且操作过程中易污染而使得假阳性率高等缺点，使其应用受到局限。
对ＰＣＲ产物进行准确定量成为ＰＣＲ技术发展的重要方向［１￣３］。
定量ＰＣＲ（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＰＣＲ，Ｑ－ＰＣＲ）先后出现了多种方法，目前为止，其中结果最为可靠的就是实时荧光定量ＰＣＲ（Ｒｅａ１ｔｉｍｅｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＰＣＲ，Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅＱ－ＰＣＲ）。
１９９６年，实时荧光定量ＰＣＲ技术由美国ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ公司首先推出。
这项技术是指在ＰＣＲ反应体系中加入荧光染料或荧光基团，利用荧光信号来实时监测整个ＰＣＲ进程，最后通过标准曲线对未知模板浓度进行定量分析。
其特点有：（１）用产生荧光信号的指示剂显示扩增产物的量，进行实时动态连续的荧光监测，避免终点定量的不准确，并且消除了标本和产物的污染，且无复杂的产物后续处理过程。
（２）荧光信号通过荧光染料嵌入双链ＤＮＡ，或荧光探针特异结合目的检测物等方法获得，大大提高了检测的灵敏度、特异性和精确性［４，５］。
Ｒｅａｌ－ｔｉｍＱ－ＰＣＲ可以应用于ｍＲＮＡ表达的研究、ＤＮＡ拷贝数的检测、单核苷酸多态性的测定、细胞因子的表达分析、肿瘤耐药基因表达的研究以及病毒感染的定量监测。
１实时荧光定量ＰＣＲ技术的基本原理在ＰＣＲ反应体系中加入荧光染料或荧光基团，这些荧光物质有其特定的波长。
仪器可以自动检出，利用荧光信号积累，实时监测整个ＰＣＲ进程，在ＰＣＲ循环中，测量的信号将作为荧光阈值的坐标。
并且引入一个———Ｃｔ值（Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄｃｙｃｌｅ）概念，Ｃｔ值是指产生可被检测到的荧光信号所需的最小循环数，是在ＰＣＲ循环过程中荧光信号由本底开始进入指数增长阶段的拐点所对应的循环次数。
荧光阈值相当于基线荧光信号的平均信号标准偏差的１０倍。
一般认为在荧光阈值以上所测出的荧光信号是一个可信的信号，可以用于定义一个样本的Ｃｔ值。
通常用不同浓度的标准样品的Ｃｔ值来产实时荧光定量ＰＣＲ技术综述邓文星张映（山西农业大学动物科技学院，太谷０３０８０１）摘要：实时荧光定量ＰＣＲ技术是在ＰＣＲ技术基础上发展起来的一种高度灵敏的核酸定量技术。
与传统ＰＣＲ相比，实时定量ＰＣＲ能够更加快速、灵敏，并有效地对核酸进行定量检测。
关键词：实时荧光定量ＰＣＲ标准曲线ＡＲｅｖｉｅｗｏｎＲｅａｌ－ｔｉｍｅＱ－ＰＣＲＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＤｅｎｇＷｅｎｘｉｎｇＺｈａｎｇＹｉｎｇ（ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＡｎｉｍａｌＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＳｈａｎｘｉＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｔａｉｇｕ０３０８０１）Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＴｈｅＲｅａｌ－ｔｉｍｅＱ－ＰＣＲｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｉｓｏｎｅｋｉｎｄｏｆｈｉｇｈｌｙｓｅｎｓｉｔｉｖｅｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｔｅｃｈｎｉｑｕｅａｂｏｕｔｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄ，ｗｈｉｃｈｄｅｖｅｌｏｐｓｉｎｔｈｅＰＣＲｔｅｃｈｎｉｑｕｅｂａｓｅ．ＣｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌＰＣＲ，Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅＱ－ＰＣＲｃａｎｂｅｆａｓｔｅｒｌｙ，ｓｅｎｓｉｔｉｖｅｌｙ，ａｎｄｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙｃａｎｂｅａｐｐｌｉｅｄｉｎｔｈｅｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅＱ－ＰＣＲＳｔａｎｄａｒｄｃｕｒｖｅ生物技术通报ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＢｕｌｌｅｔｉｎ２００７年第５期生标准曲线，然后计算相对方程式。
方程式的斜度可以用来检查ＰＣＲ的效率，所有标准曲线的线性回归分析需要存在一个高相关系数（Ｒ２＞０．９９），这样才能认为实验的过程和数据是可信的，使用这个方程式计算出未知样本的初始模板量［５，６］。
实时荧光定量ＰＣＲ仪都有软件，可以从标准曲线中自动地计算出未知样本的初始模板量。
２实时荧光定量ＰＣＲ技术中荧光标记方法的分类目前ｒｅａｌ－ｔｉｍｅＱ－ＰＣＲ所使用的荧光化学方法主要有四种，分别是ＤＮＡ结合染料法，水解探针法，杂交探针法，荧光引物法。
它们又可分为扩增序列非特异和扩增序列特异两类检测。
扩增序列非特异性检测方法的基础是ＤＮＡ结合的荧光分子，如ＳＹＢＲｇｒｅｅｎＩ。
Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅＱ－ＰＣＲ发展早期就是运用这种最简单的方法，在ＰＣＲ反应体系中，加入过量ＳＹＢＲｇｒｅｅｎＩ荧光染料，ＳＹＢＲｇｒｅｅｎＩ荧光染料特异性地掺入ＤＮＡ双链后，发射荧光信号。
荧光染料的优势在于它能监测任何ｄｓＤＮＡ序列的扩增，不需要探针的设计，使检测方法变得简便，同时也降低了检测的成本。
然而正是由于荧光染料能和任何ｄｓＤＮＡ结合，因此它也能与非特异的ｄｓＤＮＡ（如引物二聚体）结合，使实验容易产生假阳性信号。
引物二聚体的问题目前可以用带有熔解曲线（ｍｅｌｔｉｎｇｃｕｒｖｅ）分析的软件加以解决。
由于ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩ对ＰＣＲ有一定的抑制性，并且荧光强度较低，稳定性差［７，８］。
近来试剂公司针对ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩ存在的缺点开发了一些性能改进的染料，如ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩ、ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＥＲ、ＰｏｗｅｒＳＹＢＲ、ＥｖａＧｒｅｅｎＴＭ等。
扩增序列特异性检测方法是在ＰＣＲ反应中利用标记荧光基因的特异寡核苷酸探针来检测产物，包括水解探针法，杂交探针法，荧光引物法。
２．１水解探针法２．１．１目前在ｒｅａｌ－ｔｉｍｅＱ－ＰＣＲ中最广泛使用的ＴａｇＭａｎ系统就是运用了这个原理。
ＰＣＲ扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团，探针完整时，５′端荧光基团吸收能量后将能量转移给临近的３′端荧光淬灭基团（发生荧光共振能量转移，ＦＲＥＴ），检测不到该探针５′端荧光基团发出的荧光［９］。
在ＰＣＲ扩增中，溶液中的模板变性后低温退火时，引物与探针同时与模板结合。
在引物的介导下，沿模板向前延伸至探针结合处，发生链的置换，Ｔａｑ酶的５′￣３′外切酶活性（此活性是双链特异性的，游离的单链探针不受影响）将探针５′端连接的荧光基团从探针上切割下来，游离于反应体系中，从而脱离３′端荧光淬灭基团的屏蔽，接受光刺激发出荧光信号，即每扩增一条ＤＮＡ链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与ＰＣＲ产物形成完全同步。
直接的方法指的是标记荧光的探针与扩增产物结合后即直接产生荧光。
２．１．２针对Ｔａｑｍａｎ探针荧光淬灭不彻底的问题，２０００年美国ＡＢＩ公司推出了一种新ＴａｑＭａｎ探针－ＭＧＢ探针［１０］。
探针３′端采用了非荧光性的淬灭基因，吸收报告基团的能量后并不发光，大大降低了本底信号的干扰。
此外，ＭＧＢ探针的３′端还连接了一个二氢环化吲哚卟啉－三肽，可以大大稳定探针与模板的杂交，升高探针Ｔｍ值，使较短的探针同样能达到较高的Ｔｍ值并且短探针的荧光报告基团和淬灭基团的距离更近，淬灭效果更好，荧光背景更低，使得信噪比更高。
２．１．３ｃｙｃｌｉｎｇｐｒｏｂｅ法，一种ＤＮＡ，ＲＮＡ构成的杂合探针，与ＲＮａｓｅＨ组合使用，内部含有ＲＮＡ碱基，５′端标记荧光物质，３′端标记淬灭物质。
探针完整时，荧光淬灭作用抑制荧光物质发出荧光。
当探针与扩增产物中的互补序列杂交，ＲＮａｓｅＨ切断探针的ＲＮＡ部分，淬灭作用解除，荧光物质发出荧光。
２．２杂交探针法２．２．１罗氏专利的ＦＲＥＴ探针又称为双杂交探针，或者ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅ探针。
ＦＲＥＴ探针由两条和模版互补、且相邻的特异探针组成（距离１￣５ｂｐ），上游探针的３′端标记供体荧光基团，相邻下游探针的５′端标记Ｒｅｄ６４０受体荧光基团。
当复性时，两探针同时结合在模板上，供体基团和Ｒｅｄ６４０受体基团紧密相邻（距离１￣５ｂｐ），激发供体产生的荧光能量被Ｒｅｄ６４０基团吸收，使得检测探头可以检测到Ｒｅｄ６４０发出波长为６４０的荧光。
当变性时，两探针游离，两基团距离远，不能检测到６４０波长的荧光。
９４２００７年第５期检测的信号是退火时的实时信号，每次检测信号始终严格对应模版的数量，非累积信号，可以用于做Ｔｍ曲线和ＳＮＰ检测。
２．２．２分子信标（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｂｅａｃｏｎ）是一种呈发夹结构的茎环双标记寡核苷酸探针，两端的核酸序列互补配对，因此标记在一端的荧光基团与标记在另一端的淬灭基团紧紧靠近。
荧光基团被激发后产生的光子被淬灭剂淬灭，由荧光基团产生的能量以红外光而不是可见光形式释放出来［１１］。
在复性温度下，因为模板不存在时形成茎环结构。
当加热变性会互补配对的茎环双链解开，如果有模板存在环序列将与模板配对。
与模板配对后，分子信标将成链状而非发夹状，使得荧光基团与淬灭剂分开。
当荧光基团被激发时，淬灭作用被解除，发出激发光子。
２．３荧光引物法荧光引物法从分子信标的概念变化而产生的一种联合分子探针系统，它把荧光基团标记的发夹结构的序列直接与ＰＣＲ引物相结合，从而使荧光标记基团直接掺入ＰＣＲ扩增产物中［１２］。
目前主要有：日出引物（ｓｕｎｒｉｓｅｐｒｉｍｅｒｓ）、蝎子引物（ｓｃｏｒｐｉｏｎｐｒｉｍｅｒｓ）、Ａｍｐｌｉｓｅｎｓｏｒ引物、Ａｍｐｌｉｆｌｕｏｒ引物、ＬＵＸ（ｌｉｇｈｔｕｐｏｎｅｘｔｅｎｔｉｏｎ）引物。
３实时荧光定量ＰＣＲ技术的实验方法３．１ＲＴ－ＰＣＲ以ＲＮＡ为起始实验材料。
分为两种：（１）ｏｎｅｓｔｅｐ法，反转录反应和ＰＣＲ反应在同一反应管中进行。
操作简单、反应连续、污染几率低，适合于病原体的检测。
（２）ｔｗｏｓｔｅｐ法，反转录反应和ＰＣＲ反应分两步进行，反转录反应液（ｃＤＮＡ）作为ＰＣＲ反应的模板，适合于ｍＲＮＡ表达量的解析。
３．２ＰＣＲ以ＤＮＡ为起始实验材料。
４实时荧光定量ＰＣＲ技术的定量方法４．１标准曲线法的相对定量法此方法中定量的表达是相对于某个参照物的量而言的，因此相对定量的标准曲线就比较容易制备，对于所用的标准品只要知道其相对稀释度即可。
在整个实验中样本的靶序列的量来自于标准曲线，最终必须除以参照物的量，即参照物是１，的样本，其它的样本为参照物量的的ｎ倍。
在实验中为了标准化加入反应体系的ＲＮＡ或ＤＮＡ的量，往往在反应中同时扩增一内源控制物，如在基因表达研究中，内源控制物常为一些管家基因。
４．２比较ＣＴ法的相对定量法比较ＣＴ法与标准曲线法的相对定量法的不同之处在于其运用了数学公式来计算相对量，前提是假设每个循环增加一倍的产物数，在ＰＣＲ反应的指数期得到ＣＴ值来反应起始模板的量。
