应用与环境生物学报 2009，15 ( 6 ): 814~818Chin J Appl Environ Biol=ISSN 1006-687X2009-12-25DOI: 10.3724/SP.J.1145.2009.00814热休克蛋白（Heat shock protein ，HSP ）是一类存在于机体内的热应激蛋白质，由一个庞大的蛋白家族组成，包括HSP100、HSP90、HSP70、HSP60和小分子量HSP 等. 热休克蛋白对维持细胞生存和内环境的稳定起着十分重要的作用[1]. 葡萄糖调节蛋白78（Glucose regulated protein ，GRP78），又名免疫球蛋白重链结合蛋白（Immunoglobulin heavy chain binding protein ，Bip ），是HSP70家族重要的一员，具有HSP70家族典型的结构. 即N 端（1~386位氨基酸）为ATPase 结合结构域，具有结合和水解ATP 的活性，其序列高度保守；C 端（542~646位氨基酸）是活性调节区域，同源性及功能在各家族成员间差异较大；N 、C 端之间为相对保守的多肽结合部位[2]. 已有的研究表明，GRP78是一种非常典型的应急蛋白，并可能具有较为广泛的生物学功能[3]. Liu 等（2006）发现，GRP78在低糖、低氧、低钙等应激状态下能够大量表达，起到维持内质网的稳定，保护细胞内环境稳定的功能[4]. 除了对细胞内在因子的胁迫产生应答外，GRP78也能够对细胞外环境因子，如温度、氧水平的变化和病害感染等的胁迫产生强烈应答[5~7].目前，对鱼类G R P 78的研究还不多，仅在虹鳟（Oncorhynchus mykiss ）[8]、斑马鱼（Danio rerio ，BC63946）及牙鲆（Paralichthys olivaceus ，DQ662232）中报道和鉴定了GRP78. 鱼类是水生脊椎动物，对水温变化、病害特别是病毒的侵袭非常敏感. 当受到上述环境胁迫因子胁迫时，GRP78有什么功能还不清楚. 因此，本研究在克隆草鱼（Ctenopharyngodon idellus ）GRP78基因（FJ436356）全长序热休克、Poly I: C 上调草鱼GRP78基因表达*吴初新1 刘 毅2 马梅生1 王丽坤1 胡成钰1**(1南昌大学生命科学与食品工程学院 南昌 330031)（2江西师范大学生命科学学院 南昌 330022）Up-regulation of Grass Carp GRP78 Gene Expression under Heat Shockand Poly I:C Stress*WU Chuxin 1, LIU Yi 2, MA Meisheng 1, WANG Likun 1 & HU Chengyu 1**(1College of Life Sciences and Food Engineering, Nanchang University , Nanchang 330031, China)(2College of Life Sciences, Jiangxi Normal University , Nanchang 330022, China)Abstract Glucose regulated protein 78 (GRP78), as a cellular stress-related protein, could regulate endoplasmic reticulum (ER) homeostasis by strongly responding to intracellular or extracellular stressors. The grass carp (Ctenopharyngodon idellus ) GRP78 gene was cloned from mixed liver and kidney cDNA library. The full length sequence of 2 490 bp contained a 5’untranslated region of 155 bp with seven heat shock elements and a 3’untranslated region of 373 bp. The open reading frame was 1 962 bp which could code a 653 amino acid peptide. The deduced amino acid sequence of grass carp GRP78 contained three signature sequences of HSP70s in the N-terminus ，and an endoplasmic reticulum retention sequence of KDEL in its C-terminus. The grass carp GRP78 shared the high homology with that of human and other animals. The analysis of adaptive evolution demonstrated that GRP78 was highly conservative and undergoing strong functional constraint, which illustrated it was very important in the course of evolution. The RT-PCR analysis showed that the expression of grass carp GRP78 was signi fi cantly enhanced in liver, kidney and other tissues after heat shock at 34 ℃ and challenged by Poly I:C compared with the normal level. Fig 4, Tab 1, Ref 16Keywords heat shock; Poly I:C; expression; GRP78; grass carp; stress CLC Q51 : Q78摘 要 葡萄糖调节蛋白78（GRP78）是细胞内一种应急蛋白，它通过对细胞内、外胁迫因子产生强烈的应答而调节内质网稳态. 草鱼（Ctenopharyngodon idellus ）GRP78克隆于草鱼肝肾cDNA 文库，全长2 490 bp. 其中，5’非编码区为155 bp ，含有7个热休克元件，3’非编码区为373 bp ，最大开放阅读框为1 962 bp ，编码653个氨基酸. 序列分析表明，草鱼GRP78的N 端包含3个HSP70家族的签名序列，C 末端为内质网蛋白滞留信号KDEL ，草鱼GRP78与人及其它动物的同源性很高. 适应性进化分析也显示GRP78非常保守，受到强烈的功能约束，说明该蛋白质在进化中非常重要. RT-PCR 分析表明，相对于本底水平，34 ℃热激和Poly I:C 诱导后，草鱼GRP78在肝、肾等组织中的表达明显上调. 图4 表1 参16关键词 热休克；Poly I:C ；表达；GRP78；草鱼；胁迫CLC Q51 : Q78收稿日期：2008-11-24 接受日期：2009-03-04*江西省重点科技攻关项目（No. 20061B0260301），江西省教育厅项目（No.GJJ09057）和江西省研究生创新专项资金项目（No.YC08A018）资助 Supported by the Key Sci & Tech Program of Jiangxi (No. 20061B0260301), the Program of the Education Department of Jiangxi, China (No.GJJ09057), and the Special Fundation for Graduate Innovation Program of Jiangxi, China (No.YC08A018)**通讯作者 Corresponding author (E-mail: hucy2008@)815 6 期吴初新等：热休克、Poly I:C上调草鱼GRP78基因表达列、了解其分子特征和适应性进化的基础上，对在热激和Poly I:C胁迫下的基因组织表达特征进行了分析. 该结果可能为进一步认识GRP78在鱼类抗逆和抗病功能中的作用提供重要的理论依据.1 材料与方法1.1 材 料草鱼肝肾cDNA文库（载体为pBluescriptⅡSK，宿主菌为DH5α）由本实验室保存. 草鱼由江西省水产科学研究所提供，体重约20 g；于流水实验槽中暂养1 wk后进行分组，分别为对照组、34 ℃热休克刺激（4 h）组和Poly I:C诱导（72 h）组，诱导剂量为每尾注射1 mg/ml Poly I:C 500 μL.SV total R NA isolation system总R NA抽提试剂盒（Promega）. Reverse transcriptase M-MLV反转录、酶Taq酶（宝生物工程有限公司）. 引物、测序（上海生工）.1.2 草鱼GRP78基因的克隆采用pBluescriptⅡSK载体上的通用引物：M13u (5’-GTA AAA CGA CGG CCA GT-3’)和T3 (5’-ATT AAC CCT CAC TAA AGG GAA-3’)，筛选草鱼肝肾cDNA文库. 反应体系为25 μL：水18.75 μL，10×PCR反应缓冲液2.5 μL，2.5 mmol/L dNTP 1 μL，10 μmol/mL引物各0.5 μL，菌液1.5 μL，Taq酶1.25 U. PCR反应条件：预变性94 ℃ 5 min；变性94 ℃ 30 s，退火59 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 90 s，30个循环；延伸72 ℃ 10 min.筛库获得一个约2 500 bp的条带，测序确定为草鱼GRP78全长cDNA.1.3 草鱼GRP78的分子特征使用ORF finder、Signal P、PROSITE等在线软件对草鱼GRP78全长cDNA的开放阅读框、信号肽、特征序列等进行推译和预测，初步确定其性质和相关信息.1.4 GRP78适应性进化GenBank数据库检索GRP78序列8个和HSP70序列6个，Clustal W同源性比对，PHYLIP 3.67（http://evolution.genetics. /phylip.html）构建进化树. 根据序列对位排列和系统树结果，运行PAML3.15（/ software/paml.html）软件包中的CODEML程序，检测GRP78正选择作用位点.1.5 草鱼GRP78基因的组织表达用SV total RNA isolation system总RNA抽提试剂盒分别提取对照组、热休克刺激组和Poly I:C诱导组的草鱼肝、肾、肌肉、脾、心、脑、鳃、肠8种组织的总RNA. Reverse transcriptase M-MLV反转录酶反转录得到cDNA.根据草鱼GRP78基因序列设计特异性引物（GRP78-F和GRP78-R）. 其中GRP78-F (5’-CGC TGC CAT TGC TTA CGG TC-3’)，GRP78-R (5’-GCA CGG CAC GGT TAT CCT TG-3’)，扩增目的片段长度为245 bp. 以β-actin为内参，β-actin-F (5’-CAC TGT GCC CAT CTA CGA G-3’)，β-actin-R (5’-CCA TCT CCT GCT CGA AGT C-3’).RT-PCR反应体系为25 μL：10×PCR反应缓冲液2.5 μL，2.5 mmol/L dNTP 2 μL，10 μmol/mL引物各0.5 μL，Taq酶1.25 U，根据β-actin调整cDNA模板量. PCR反应条件：预变性94 ℃ 5 min；变性94 ℃ 30 s，退火57 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 1 min，28个循环；延伸72 ℃ 10 min.2 结 果2.1 草鱼GRP78的克隆采用pBluescriptⅡSK载体上的通用引物筛选草鱼肝肾cDNA文库，PCR得到1条大于2 500 bp的条带（图1），测序鉴定为草鱼GRP78全长cDNA.2.2 草鱼GRP78的分子特征草鱼GRP78全长为2 490 bp，GC含量为52%，ORF位于156~2 117 bp，共1 962 bp，编码653个氨基酸. 5’UTR为155 bp，其中，14~45和121~132 bp处含有7个热休克元件（Heat shock element, HSE）GAA. 3’UTR为373 bp，2 457 bp处为加尾信号（AATAAA），末端有18 bp的Poly(A)尾（图2）.草鱼GRP78分子量计算值为72 220，理论等电点为4.71. 序列分析表明，N端有一由16个氨基酸残基组成的信号肽. 第31~38个氨基酸、第220~233个氨基酸及第357~371个氨基酸为3个HSP70家族的签名序列（Signature sequence），分别为IDLGTTYS、VFDLGGGTFDVSLL和IVLVGGSTRIPEIQQ. 位于C末端（第650~653位氨基酸）为内质网蛋白滞留信号KDEL.2.3 草鱼GRP78分子适应性的进化分析2.3.1 GRP78的系统发生通过PHYLIPY构建的GRP78系统发生树（图3），明显地分为两大簇. 草鱼GRP78位于与其他物种GRP78相同的进化枝上，与斑马鱼的关系最近.2.3.2 GRP78的适应性分析适应性进化分析的结果（表1）显示，虽然M3&M0的χ2检验极显著 (1%, df=5-1=4, 283.3807>13.276)，但M8&M7的χ2检验非常不明显，且在M3、M8模型中都没有找到ω>1的位点. 这表明GRP78没有受到正选择作用，而是处于中性进化或负进化状态. 模型M8的参数p=1.000，表示受到选择约束的位点的比例，从另一方面说明GRP78受到功能或结构上的选择约束，在进化上的高度保守. 2.4 草鱼GRP78的组织表达RT-PCR获得GRP78的目的条带约为250 bp（图4-A、B、C），与预期结果一致. 图4-A显示，草鱼GRP78在肝、肌肉和鳃中可见有痕量的本底表达，在肾、脾、心、脑和肠中没有表达. 34 ℃热休克刺激后（图4-B），GRP78表达量在肝、肾、脾、脑、鳃、肠中有很大的上调，其中，脾、脑、鳃3种组织最为明显，其次是肝、肠、肾等. Poly I:C诱导后（图4-C），GRP78的表达量在肝、肾、脾、心、肠中有一定的上调，在肝、脾中上调显著，然后为心、肠、肾. 但在所有检测的组织中，Poly I:C诱导后GRP78的上调表达不如34 ℃热休克的强.图1 草鱼GRP78的克隆Fig. 1 Clone of grass carp GRP78 geneM：1 kb DNA ladder；GRP78：草鱼GRP78基因M: 1 kb DNA ladder; GRP78: Grass carp GRP78 gene81615 卷应 用 与 环 境 生 物 学 报 Chin J Appl Environ Biol图2 草鱼GRP78基因及推导的氨基酸序列Fig. 2 cDNA sequence of grass carp GRP78 and the deduced amino acid sequence双下划线显示为HSE；星号表示起始和终止密码子；单下划线代表信号肽；阴影部分为3个签名序列；方框代表内质网蛋白滞留信号；粗斜体代表加尾信号Double-underline shows the HSE. Asterisk represents iniation codon and termination codon. Underline denotes signal peptide. Shadow denotes the three signature sequences of HSP70. Pane indicates the endoplasmic reticulum retention sequence. Bold italic indicates the tailing signal817 6 期吴初新等：热休克、Poly I:C上调草鱼GRP78基因表达3 讨 论通过比对17个物种的34个HSP70家族序列，Nicholson等（1990）发现GRP78位于单独的进化枝上，并具有共同的祖先序列[9]. 运用Clustal W比对草鱼与其他7个物种的GRP78序列（结果未给出），显示它们具有95.11%的同源性. 同样，小鼠与大鼠间该蛋白质有98%的同一性[10]，其在草鱼与斑马鱼间也有96.45%的一致性. 同时，在GRP78中没有检测到正选择位点，表明该蛋白质在进化过程中受到较强的功能约束，看来该基因没有对自然选择产生应答. GRP78在结构和功能上的高度保守性反映它可能具有非常重要的生物学功能.作为一种免疫球蛋白重链结合蛋白，GRP78在功能上可以归为免疫相关蛋白质，因此，GRP78的组织表达符合免疫及其相关基因的表达特征，即本底表达较微弱，而诱导后表达急剧上调[11]. GRP78表达的上调与细胞内外环境的变化密切相关. Mote等（1998）发现细胞内葡萄糖缺乏、蛋白错误折叠、钙代谢紊乱、蛋白糖基化异常等都可以激活GRP78基因转录，诱导GRP78大量产生[12]. 由于在蛋白质的C端具有KDEL回收信号序列，因此GRP78为非常典型的内质网滞留蛋白，并可能对内质网的胁迫产生强烈的应答. 热休克是内质网的主要胁迫之一，能引起新生肽的错误折叠，并较高水平上调GRP78的表达[13]. 虽然GRP78的诱导表达途径仍未完全证实，但有证据表明5’UTR中nGAAn热休克元件（HSE）对GRP78表达上调可能非常重要. Sun等（1996）认为热休克诱导GRP78的表达上调是因为热休克调节因子（HSF）能够以图 3 GRP78和HSP70系统发生树Fig. 3 Phylogenetic tree of GRP78 and HSP70O. mykiss (虹鳟), P. olivaceus (牙鲆), D. rerio (斑马鱼), G. gallus (鸡), C. griseus (仓鼠), B. taurus (牛), H. sapiens (人), C. auratus (鲫鱼), O. tshawytscha (大麻哈鱼), A. schlegelii (黑鲷), O. latipes (青鳉).括号中为GenBank的序列号；方框为草鱼(C. idella) GRP78；枝上的数字为自展1 000次的支持率 The GenBank accession numbers are shown in brackets. The pane indicates GRP78 of C. idella. The numers on branches are the support rate of bootstrap 1000表1 GRP78正选择的似然比检验Table 1 Likelihood ratio test of positive selection for GRP78模型Mode 似然值In L参数估计Estimation of parametersLRT2△In L正选择位点Positively selected siteM0－11480.2801ω= 0.0273M0 vs. M3283.3807**无 NoneM3－11338.5898p=0.5601, p1=0.3786, p2=0.0614;ω=0.0032, ω1=0.0435, ω2=0.1915无 NoneM7－11340.8968p =0.3895, q=11.7328M7 vs. M8－0.0012无 NoneM8－11340.8974p=1.0000, p=0.3895, q=11.7328(p1= 0.0000); ω=7.5092无 Noneln L是最大似然值的对数；2△In L是 M3&M0、M8&M7间ln L之差的两倍；**表示似然比检验显著ln L: The log-likelihood. 2△In L: Twice of the log-likelihood difference. **: Signifi cant at 0.01 level图4 草鱼GRP78的组织表达Fig. 4 Tissue-specifi c expression of grass carp GRP78M：DNA Marker. 1~8泳道分别为肝、肾、肌肉、脾、心、脑、鳃和肠. A：为本底表达组；B：34 ℃ 热休克刺激组；C：Poly I:C 诱导组；D：β-actin内对照M: DNA marker. Lanes 1~8: Liver, kidney, muscle, spleen, heart, brain, gilland intestine, respectively. GRP78 gene was constitutively expressed at lowlevels (A). GRP78 expression induced by 34 ℃ heat shock (B) and Poly I:C(C). Samples were normalized on the basis of β-actin expressions (D)81815 卷应 用 与 环 境 生 物 学 报 Chin J Appl Environ Biol磷酸化形式结合HSE，促使HSP70的高水平表达[14]. 同样，酵母GRP78中有2个HSE，从28 ℃转至42 ℃培养后，表达量能上调5~10倍[9]. 在本研究中也获得了相同的结果. 草鱼GRP78的5’UTR中发现有7个HSE，热刺激能够极大地上调其表达（图4B）. 相反，人乳腺癌细胞GRP78由于缺乏HSE而对热休克无反应[2]. 奇怪的是，中国对虾GRP78虽然没有HSE，35 ℃热休克却能明显上调其表达[15]. 看来，GRP78表达的上调有时受到其他一些因素的影响.病毒等侵害诱导细胞内GRP78表达的上调显然不需要“HSE”的参与. 中国对虾感染白斑病毒（WSSV）后，GRP78在肝胰腺和脾中明显上调，在血细胞中则下调[15]. 同样，Poly I:C也会上调GRP78在草鱼肝、肾、脾、心、肠等组织中的表达，但在肌肉和鳃中GRP78的表达有所下降（图4-C）. 是什么原因造成GRP78组织表达的不同？抑或是由于不同组织细胞的GRP78对于同一胁迫反应不一样[16]？这有待进一步研究. 由于GRP78能够特异性结合免疫球蛋白的重链，因此推测病毒、Poly I:C引发的GRP78表达上调可能与机体特异性免疫系统激活、特别是与免疫球蛋白的大量生成相关. 本研究结果也支持该推测，本文中Poly I:C诱导为3 d，没有达到免疫球蛋白最大产生时期（7 d），因此，与热激的相比，Poly I:C上调GRP78表达的能力相对较弱. 当然这种推测还需要更多实验结果的支持.References1 Iwama GK, Thomas PT, Forsyth RB, Vijayan MM. Heat shock proteinexpression in fi sh. Rev Fish Biol & Fisheries, 1998, 8 (1):35~562 Kiang JG, Tsokos GC. 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![草鱼生长速度相关的SNP标记及其应用[发明专利]](https://img.taocdn.com/s1/m/82e4f7f010a6f524ccbf85f2.png)
