甘蔗线条花叶病毒RNA沉默抑制子的寄主互作蛋白鉴定

甘蔗线条花叶病毒RNA沉默抑制子的寄主互作蛋白鉴定
作者：冯小艳王俊刚王文治沈林波赵婷婷冯翠莲张树珍
来源：《热带作物学报》2022年第06期
摘要：甘蔗线条花叶病毒（Sugarcane streak mosaic virus， SCSMV）是引起甘蔗花叶病的一种主要病原。

SCSMV編码的P1蛋白是RNA沉默抑制子，在SCSMV抑制寄主的RNA沉默防御中发挥关键作用，但其作用机制尚未清楚。

与寄主蛋白互作是RNA沉默抑制子发挥其抑制作用的主要途径之一，因此鉴定与病毒RNA沉默抑制子互作的寄主蛋白是研究抑制子作用机制的一个重要方法。

为探究SCSMV P1抑制寄主RNA沉默的机制，本研究首先将SCSMV P1基因连接到质粒pGBKT7上构建诱饵质粒pGBKT7-P1，然后对pGBKT7-P1进行毒性和自激活检测，最后以pGBKT7-P1为诱饵，采用酵母双杂交技术从甘蔗cDNA文库中筛选与P1互作的寄主蛋白。

结果显示，成功构建pGBKT7-P1诱饵质粒。

将pGBKT7-P1诱饵质粒转入Y2H Gold酵母菌株后，酵母菌株在SD/-Trp平板及液体培养基中生长良好，表明pGBKT7-P1诱饵质粒对Y2H Gold酵母菌株无毒性。

含pGBKT7-P1诱饵质粒的酵母菌株在
SD/-Trp/X-α-Gal平板上长出白色菌落未变蓝，在SD/-Trp/X-α-Gal/AbA和SD/-Trp/-Leu/X-α-Gal/AbA平板上无菌落生长，表明pGBKT7-P1诱饵质粒无自激活活性。

用pGBKT7-P1诱饵质粒对甘蔗cDNA文库进行筛选，经SD/-Trp/-Leu/X-α-Gal/AbA平板筛选1次及SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade/X-α-Gal/AbA平板筛选3次后，获得42个阳性酵母克隆，提取阳性酵母质粒并导入大肠杆菌中扩大培养，经测序及blastx比对分析，获得13个可能与SCSMV P1互作的寄主甘蔗蛋白，分别是生长素应答蛋白IAA1、IAA15，转录因子NAC、GATA4、OFP4，真核翻译起始因子eIF5A，分子伴侣DnaJ，辅分子伴侣SBA1，重金属相关异戊二烯化植物蛋白
HIPP35，mec-8和unc-52蛋白同系物抑制子SMU2，外膜孔蛋白OEP24，及2个未表征蛋白。

基于这些蛋白的功能，推测P1可能通过与寄主蛋白互作来调控寄主防御反应相关基因的表达，和/或通过与寄主蛋白互作来影响寄主RNA沉默相关蛋白的合成、加工或转运，从而发挥其RNA沉默抑制子的功能。

研究结果为后续深入解析P1抑制RNA沉默的作用机制奠定了重要基础。

关键词：甘蔗线条花叶病毒;RNA沉默抑制子;P1蛋白;互作蛋白中图分类号：S435.661 文献标识码：A
Identification of Host Proteins Interacting with RNA Silencing Suppressor of Sugarcane Streak Mosaic Virus
FENG Xiaoyan， WANG Jungang， WANG Wenzhi， SHEN Linbo， ZHAO Tingting，FENG Cuilian，ZHANG Shuzhen*
Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Haikou， Hainan 571101， China
Abstract：Sugarcane streak mosaic virus（SCSMV） is a major pathogen of sugarcane mosaic disease. P1 protein encoded by SCSMV is an RNA silencing suppressor， which plays a key role in suppressing the host’s RNA silencing defense. However， its mechanism is not yet clear. Interaction with host proteins is one of the main pathways for RNA silencing suppressors to exert the suppression functions. Therefore， identifying host proteins that interact with viral RNA silencing suppressors is an important method to study the mechanism of suppressors. In order to explore the mechanism of SCSMV P1 suppressing the host RNA silencing， in this study， SCSMV P1 was ligated to the plasmid pGBKT7 to construct the bait plasmid pGBKT7-P1， then pGBKT7-P1 was tested for toxicity and self-activation， and finally pGBKT7- P1 was used as a bait to screen the host proteins that interact with P1 from the sugarcane cDNA library by yeast two-hybrid technology. The results showed that the bait plasmid pGBKT7-P1 was successfully constructed. After the pGBKT7-P1 bait plasmid was transferred into the Y2H Gold yeast strain， the yeast strain grew well in the SD/-Trp plate and liquid medium， indicating that the pGBKT7-P1 bait plasmid was non-toxic to the Y2H Gold yeast strain. The yeast strain containing the pGBKT7-P1 bait plasmid grew white rather than blue colonies on the SD/-Trp/X-α-Gal plate， and did not grow on the SD/-Trp/X-α-Gal/AbA and
SD/-Trp/-Leu/X-α-Gal/AbA plates， indicating that the pGBKT7-P1 bait plasmid had no self-activation activity. The sugarcane cDNA library was screened with pGBKT7-P1 bait plasmid. After screening on SD/-Trp/-Leu/X-α-Gal/AbA plate once and SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade/X-α-Gal/AbA plate three times， 42 positive yeast clones were obtained. The positive yeast plasmids were extracted and introduced into Escherichia coli for amplification. After sequencing and blastx comparison analysis，a total of 13 host sugarcane proteins that may interact with SCSMV P1 were obtained， namely auxin-responsive proteins IAA1， IAA15， transcription factors NAC， GATA4， OFP4，eukaryotic translation initiation factor eIF5A， chaperone DnaJ， co-chaperone SBA1， heavy metal-associated isoprenylated plant protein HIPP35， suppressor of mec-8 and unc-52 protein homolog SMU2， outer envelope pore protein OEP24， and two uncharacterized proteins. Based on the functions of the proteins， it was speculated that P1 may interact with host proteins to regulate the expression of host defense response-related genes， and/or interact with host proteins to affect the synthesis， processing， or transport of host RNA silencing-related proteins， thereby exerting the RNA silencing suppressor function of P1. The research results would lay an important foundation for the subsequent in-depth analysis of the RNA silencing suppression mechanism of P1.
Keywords：Sugarcane streak mosaic virus; RNA silencing suppressor; P1 protein; interacting protein
DOI：10.3969/j.issn.1000-2561.2022.06.016
甘蔗线条花叶病毒（Sugarcane streak mosaic virus， SCSMV）隸属马铃薯Y病毒科（Potyviridae）禾本科病毒属（Poacevirus），是引起甘蔗花叶病的主要病原之一[1]。

SCSMV 侵染甘蔗除能引起典型的花叶症状外，还会导致甘蔗植株矮化，分蘖减少，汁液变少，口感变差，产量和品质严重下降[1]。

据统计，当SCSMV发生率超过50%时，可导致蔗茎和蔗糖产量分别显著下降16%～17%和19%～21%[2]。

自1978年首次报道以来，SCSMV在全球范围迅速传播，目前已在中国[3]、印度尼西亚[2]、泰国[4]、印度[5]等主要甘蔗种植国家广泛发生，严重制约甘蔗产业发展。

目前缺乏行之有效的针对SCSMV的科学防控方法。

RNA沉默是植物用以抵抗病毒侵染的重要天然防御机制[6-7]。

病毒为了对抗这一机制，在与植物长期共进化过程中，通过自身编码RNA沉默抑制子来干扰植物的RNA沉默通路从而建立有效侵染[8]。

RNA沉默抑制子通常是病毒成功侵染植物的必需因子，因此，阐明其作用机制可为病毒的科学防控提供理论指导[8-9]。

SCSMV编码的P1蛋白是RNA沉默抑制子，其在SCSMV抑制寄主的RNA沉默防御从而建立有效侵染中发挥关键作用，但目前尚未清楚其抑制RNA沉默的作用机制[10]。

解析SCSMV P1的作用机制对该病毒的科学防控具有重要意义。

RNA沉默抑制子不仅可以通过结合siRNA和dsRNA来发挥其抑制作用，还可通过与寄主蛋白互作来实现其抑制功能[8， 11-12]。

因此，鉴定与病毒RNA沉默抑制子互作的寄主蛋白是研究抑制子作用机制的一个重要途径[13]。

目前，已有多个病毒RNA沉默抑制子的寄主互作蛋白
被鉴定，这些互作蛋白种类多样、功能不一，按作用通路大致可归纳为2类，一类是RNA沉默通路蛋白，另一类是非RNA沉默通路蛋白。

RNA沉默通路蛋白：AGO、Dicer、DRB4、RDR6和SGS3是RNA沉默通路中的重要蛋白，有些病毒编码的抑制子与这些蛋白中的一个或几个互作，通过干扰它们的正常功能来抑制RNA沉默[14-19]。

非RNA沉默通路蛋白：马铃薯Y 病毒属（Potyvirus）病毒编码的HC-Pro抑制子与寄主转录因子RAV2互作，可能通过RAV2调控寄主防御反应相关基因的表达来抑制寄主的RNA沉默机制[20]。

黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）编码的2b抑制子与寄主核糖体蛋白亚基RPS11互作，下调寄主中RPS11的mRNA水平导致2b抑制子活性降低、病毒复制和积累减少，表明2b可能通过作用于寄主蛋白RPS11来发挥其抑制子功能[21]。

甜菜严重曲顶病毒（Beet severe curly top virus，BSCTV）、甜菜曲顶病毒（Beet curly top virus， BCTV）和番茄金色花叶病毒（Tomato golden mosaic virus， TGMV）编码的抑制子与寄主甲基化循环相关蛋白SAMDC1或ADK互作，通过抑制SAMDC1降解或者促使ADK失活，从而抑制寄主DNA甲基化介导的基因沉默[22-23]。

鉴定与病毒RNA沉默抑制子互作的寄主蛋白是研究抑制子作用机制的重要途径，目前已被应用于多个病毒RNA沉默抑制子作用机制的解析[13]，但未见SCSMV编码的RNA沉默抑制子P1与寄主蛋白互作研究的报道。

本研究利用酵母双杂交技术筛选与SCSMV P1蛋白互作的寄主（甘蔗）蛋白，以期为阐明SCSMV P1抑制RNA沉默的作用机制奠定基础，为SCSMV 的科学防控提供理论依据。

1.1材料
酵母双杂交所用质粒pGBKT7购自美国Clontech公司。

Y2H Gold菌株和DH5α感受态细胞购自上海唯地生物技术有限公司。

高保真酶Phanta HS Super-Fidelity DNA Polymerase购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司;快速限制性内切酶购自美国Thermo Scientific公司;T4 DNA连接酶购自美国Promega公司;X-α-gal和AbA溶液购自北京酷来搏科技有限公司。

琼脂糖凝胶回收试剂盒购自北京艾德莱生物科技有限公司;质粒小量提取试剂盒购自爱思进生物技术（杭州）有限公司;酵母质粒提取试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司。

引物合成由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.2 方法
1.2.1 SCSMV P1基因的克隆根据NCBI数据库中SCSMV的基因组序列（GenBank：
GQ246 187.1）及本实验室获得的SCSMV P1基因序列（待发表）设计P1基因扩增引物，并在正向引物引入酶切位点Eco R I，反向引物引入酶切位点Bam H I，引物序列具体如下：P1-Eco R I-F：TCCGA ATTCATGGCTACTATCACTAAG，P1-Bam H I-R：TCCGGATCCTCAGTAAAATACTAAATCTTC。

以实验室保存的含有P1基因的pMD-18T载体为模板，使用高保真酶Phanta HS Super-Fidelity DNA Polymerase PCR扩增P1基因。

扩增程序：95℃ 30s;95℃ 10 s，54℃ 10 s，72℃ 17 s（30个循环）;72℃ 10 min。

PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测，然后使用琼脂糖凝胶回收试剂盒进行回收。

Keywords：Sugarcane streak mosaic virus; RNA silencing suppressor; P1 protein; interacting protein
DOI：10.3969/j.issn.1000-2561.2022.06.016
甘蔗线条花叶病毒（Sugarcane streak mosaic virus， SCSMV）隶属马铃薯Y病毒科（Potyviridae）禾本科病毒属（Poacevirus），是引起甘蔗花叶病的主要病原之一[1]。

SCSMV 侵染甘蔗除能引起典型的花叶症状外，还会导致甘蔗植株矮化，分蘖减少，汁液变少，口感变差，产量和品质严重下降[1]。

据统计，当SCSMV发生率超过50%时，可导致蔗茎和蔗糖产量分别显著下降16%～17%和19%～21%[2]。

自1978年首次报道以来，SCSMV在全球范围迅速传播，目前已在中国[3]、印度尼西亚[2]、泰国[4]、印度[5]等主要甘蔗种植国家广泛发生，严重制约甘蔗产业发展。

目前缺乏行之有效的针对SCSMV的科学防控方法。

RNA沉默是植物用以抵抗病毒侵染的重要天然防御机制[6-7]。

病毒为了对抗这一机制，在与植物长期共进化过程中，通过自身编码RNA沉默抑制子来干扰植物的RNA沉默通路从而建立有效侵染[8]。

RNA沉默抑制子通常是病毒成功侵染植物的必需因子，因此，阐明其作用机制可为病毒的科学防控提供理论指导[8-9]。

SCSMV编码的P1蛋白是RNA沉默抑制子，其在SCSMV抑制寄主的RNA沉默防御从而建立有效侵染中发挥关键作用，但目前尚未清楚其抑制RNA沉默的作用机制[10]。

解析SCSMV P1的作用机制对该病毒的科学防控具有重要意义。

RNA沉默抑制子不仅可以通过结合siRNA和dsRNA来发挥其抑制作用，还可通过与寄主蛋白互作来实现其抑制功能[8， 11-12]。

因此，鉴定与病毒RNA沉默抑制子互作的寄主蛋白是研究抑制子作用机制的一个重要途径[13]。

目前，已有多个病毒RNA沉默抑制子的寄主互作蛋白被鉴定，这些互作蛋白种类多样、功能不一，按作用通路大致可归纳为2类，一类是RNA沉默通路蛋白，另一类是非RNA沉默通路蛋白。

RNA沉默通路蛋白：AGO、Dicer、DRB4、RDR6和SGS3是RNA沉默通路中的重要蛋白，有些病毒编码的抑制子与这些蛋白中的一个或几个互作，通过干扰它们的正常功能来抑制RNA沉默[14-19]。

非RNA沉默通路蛋白：马铃薯Y 病毒属（Potyvirus）病毒编码的HC-Pro抑制子与寄主转录因子RAV2互作，可能通过RAV2调控寄主防御反应相关基因的表达来抑制寄主的RNA沉默机制[20]。

黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）编码的2b抑制子与寄主核糖体蛋白亚基RPS11互作，下调寄主中RPS11的mRNA水平导致2b抑制子活性降低、病毒复制和积累减少，表明2b可能通過作用于寄主蛋白RPS11来发挥其抑制子功能[21]。

甜菜严重曲顶病毒（Beet severe curly top virus，BSCTV）、甜菜曲顶病毒（Beet curly top virus， BCTV）和番茄金色花叶病毒（Tomato golden mosaic virus， TGMV）编码的抑制子与寄主甲基化循环相关蛋白SAMDC1或ADK互作，通过抑制SAMDC1降解或者促使ADK失活，从而抑制寄主DNA甲基化介导的基因沉默[22-23]。

鉴定与病毒RNA沉默抑制子互作的寄主蛋白是研究抑制子作用机制的重要途径，目前已被应用于多个病毒RNA沉默抑制子作用机制的解析[13]，但未见SCSMV编码的RNA沉默抑制子P1与寄主蛋白互作研究的报道。

本研究利用酵母双杂交技术筛选与SCSMV P1蛋白互作的
寄主（甘蔗）蛋白，以期为阐明SCSMV P1抑制RNA沉默的作用机制奠定基础，为SCSMV 的科学防控提供理论依据。

1.1材料
酵母双杂交所用质粒pGBKT7购自美国Clontech公司。

Y2H Gold菌株和DH5α感受态细胞购自上海唯地生物技术有限公司。

高保真酶Phanta HS Super-Fidelity DNA Polymerase购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司;快速限制性内切酶购自美国Thermo Scientific公司;T4 DNA连接酶购自美国Promega公司;X-α-gal和AbA溶液购自北京酷来搏科技有限公司。

琼脂糖凝胶回收试剂盒购自北京艾德莱生物科技有限公司;质粒小量提取试剂盒购自爱思进生物技术（杭州）有限公司;酵母质粒提取试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司。

引物合成由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.2 方法
1.2.1 SCSMV P1基因的克隆根据NCBI数据库中SCSMV的基因组序列（GenBank：
GQ246 187.1）及本实验室获得的SCSMV P1基因序列（待发表）设计P1基因扩增引物，并在正向引物引入酶切位点Eco R I，反向引物引入酶切位点Bam H I，引物序列具体如下：P1-Eco R I-F：TCCGA ATTCATGGCTACTATCACTAAG，P1-Bam H I-R：TCCGGATCCTCAGTAAAATACTAAATCTTC。

以实验室保存的含有P1基因的pMD-18T载体为模板，使用高保真酶Phanta HS Super-Fidelity DNA Polymerase PCR扩增P1基因。

扩增程序：95℃ 30s;95℃ 10 s，54℃ 10 s，72℃ 17 s（30个循环）;72℃ 10 min。

PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测，然后使用琼脂糖凝胶回收试剂盒进行回收。

Keywords：Sugarcane streak mosaic virus; RNA silencing suppressor; P1 protein; interacting protein
DOI：10.3969/j.issn.1000-2561.2022.06.016
甘蔗线条花叶病毒（Sugarcane streak mosaic virus， SCSMV）隶属马铃薯Y病毒科（Potyviridae）禾本科病毒属（Poacevirus），是引起甘蔗花叶病的主要病原之一[1]。

SCSMV 侵染甘蔗除能引起典型的花叶症状外，还会导致甘蔗植株矮化，分蘖减少，汁液变少，口感变差，产量和品质严重下降[1]。

据统计，当SCSMV发生率超过50%时，可导致蔗茎和蔗糖产量分别显著下降16%～17%和19%～21%[2]。

自1978年首次报道以来，SCSMV在全球范围迅速传播，目前已在中国[3]、印度尼西亚[2]、泰国[4]、印度[5]等主要甘蔗种植国家广泛发生，严重制约甘蔗产业发展。

目前缺乏行之有效的针对SCSMV的科学防控方法。

RNA沉默是植物用以抵抗病毒侵染的重要天然防御机制[6-7]。

病毒为了对抗这一机制，在与植物长期共进化过程中，通过自身编码RNA沉默抑制子来干扰植物的RNA沉默通路从而建
立有效侵染[8]。

RNA沉默抑制子通常是病毒成功侵染植物的必需因子，因此，阐明其作用机制可为病毒的科学防控提供理论指导[8-9]。

SCSMV编码的P1蛋白是RNA沉默抑制子，其在SCSMV抑制寄主的RNA沉默防御从而建立有效侵染中发挥关键作用，但目前尚未清楚其抑制RNA沉默的作用机制[10]。

解析SCSMV P1的作用机制对该病毒的科学防控具有重要意义。

RNA沉默抑制子不仅可以通过结合siRNA和dsRNA来发挥其抑制作用，还可通过与寄主蛋白互作来实现其抑制功能[8， 11-12]。

因此，鉴定与病毒RNA沉默抑制子互作的寄主蛋白是研究抑制子作用机制的一个重要途径[13]。

目前，已有多个病毒RNA沉默抑制子的寄主互作蛋白被鉴定，这些互作蛋白种类多样、功能不一，按作用通路大致可归纳为2类，一类是RNA沉默通路蛋白，另一类是非RNA沉默通路蛋白。

RNA沉默通路蛋白：AGO、Dicer、DRB4、RDR6和SGS3是RNA沉默通路中的重要蛋白，有些病毒编码的抑制子与这些蛋白中的一个或几个互作，通过干扰它们的正常功能来抑制RNA沉默[14-19]。

非RNA沉默通路蛋白：马铃薯Y 病毒属（Potyvirus）病毒编码的HC-Pro抑制子与寄主转录因子RAV2互作，可能通过RAV2调控寄主防御反应相关基因的表达来抑制寄主的RNA沉默机制[20]。

黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）编码的2b抑制子与寄主核糖体蛋白亚基RPS11互作，下调寄主中RPS11的mRNA水平导致2b抑制子活性降低、病毒复制和积累减少，表明2b可能通过作用于寄主蛋白RPS11来发挥其抑制子功能[21]。

甜菜严重曲顶病毒（Beet severe curly top virus，BSCTV）、甜菜曲顶病毒（Beet curly top virus， BCTV）和番茄金色花叶病毒（Tomato golden mosaic virus， TGMV）编码的抑制子与寄主甲基化循环相关蛋白SAMDC1或ADK互作，通过抑制SAMDC1降解或者促使ADK失活，从而抑制寄主DNA甲基化介导的基因沉默[22-23]。

鉴定与病毒RNA沉默抑制子互作的寄主蛋白是研究抑制子作用机制的重要途径，目前已被应用于多个病毒RNA沉默抑制子作用机制的解析[13]，但未见SCSMV编码的RNA沉默抑制子P1与寄主蛋白互作研究的报道。

本研究利用酵母双杂交技术筛选与SCSMV P1蛋白互作的寄主（甘蔗）蛋白，以期为阐明SCSMV P1抑制RNA沉默的作用机制奠定基础，为SCSMV 的科学防控提供理论依据。

1.1材料
酵母双杂交所用质粒pGBKT7购自美国Clontech公司。

Y2H Gold菌株和DH5α感受态细胞购自上海唯地生物技术有限公司。

高保真酶Phanta HS Super-Fidelity DNA Polymerase购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司;快速限制性内切酶购自美国Thermo Scientific公司;T4 DNA連接酶购自美国Promega公司;X-α-gal和AbA溶液购自北京酷来搏科技有限公司。

琼脂糖凝胶回收试剂盒购自北京艾德莱生物科技有限公司;质粒小量提取试剂盒购自爱思进生物技术（杭州）有限公司;酵母质粒提取试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司。

引物合成由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.2 方法
1.2.1 SCSMV P1基因的克隆根据NCBI数据库中SCSMV的基因组序列（GenBank：
GQ246 187.1）及本实验室获得的SCSMV P1基因序列（待发表）设计P1基因扩增引物，并在正向引物引入酶切位点Eco R I，反向引物引入酶切位点Bam H I，引物序列具体如下：P1-Eco R I-F：TCCGA ATTCATGGCTACTATCACTAAG，P1-Bam H I-R：TCCGGATCCTCAGTAAAATACTAAATCTTC。

以实验室保存的含有P1基因的pMD-18T载体为模板，使用高保真酶Phanta HS Super-Fidelity DNA Polymerase PCR扩增P1基因。

扩增程序：95℃ 30s;95℃ 10 s，54℃ 10 s，72℃ 17 s（30个循环）;72℃ 10 min。

PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测，然后使用琼脂糖凝胶回收试剂盒进行回收。

Keywords：Sugarcane streak mosaic virus; RNA silencing suppressor; P1 protein; interacting protein
DOI：10.3969/j.issn.1000-2561.2022.06.016
甘蔗线条花叶病毒（Sugarcane streak mosaic virus， SCSMV）隶属马铃薯Y病毒科（Potyviridae）禾本科病毒属（Poacevirus），是引起甘蔗花叶病的主要病原之一[1]。

SCSMV 侵染甘蔗除能引起典型的花叶症状外，还会导致甘蔗植株矮化，分蘖减少，汁液变少，口感变差，产量和品质严重下降[1]。

据统计，当SCSMV发生率超过50%时，可导致蔗茎和蔗糖产量分别显著下降16%～17%和19%～21%[2]。

自1978年首次报道以来，SCSMV在全球范围迅速传播，目前已在中国[3]、印度尼西亚[2]、泰国[4]、印度[5]等主要甘蔗种植国家广泛发生，严重制约甘蔗产业发展。

目前缺乏行之有效的针对SCSMV的科学防控方法。

RNA沉默是植物用以抵抗病毒侵染的重要天然防御机制[6-7]。

病毒为了对抗这一机制，在与植物长期共进化过程中，通过自身编码RNA沉默抑制子来干扰植物的RNA沉默通路从而建立有效侵染[8]。

RNA沉默抑制子通常是病毒成功侵染植物的必需因子，因此，阐明其作用机制可为病毒的科学防控提供理论指导[8-9]。

SCSMV编码的P1蛋白是RNA沉默抑制子，其在SCSMV抑制寄主的RNA沉默防御从而建立有效侵染中发挥关键作用，但目前尚未清楚其抑制RNA沉默的作用机制[10]。

解析SCSMV P1的作用机制对该病毒的科学防控具有重要意义。

RNA沉默抑制子不仅可以通过结合siRNA和dsRNA来发挥其抑制作用，还可通过与寄主蛋白互作来实现其抑制功能[8， 11-12]。

因此，鉴定与病毒RNA沉默抑制子互作的寄主蛋白是研究抑制子作用机制的一个重要途径[13]。

目前，已有多个病毒RNA沉默抑制子的寄主互作蛋白被鑒定，这些互作蛋白种类多样、功能不一，按作用通路大致可归纳为2类，一类是RNA沉默通路蛋白，另一类是非RNA沉默通路蛋白。

RNA沉默通路蛋白：AGO、Dicer、DRB4、RDR6和SGS3是RNA沉默通路中的重要蛋白，有些病毒编码的抑制子与这些蛋白中的一个或几个互作，通过干扰它们的正常功能来抑制RNA沉默[14-19]。

非RNA沉默通路蛋白：马铃薯Y 病毒属（Potyvirus）病毒编码的HC-Pro抑制子与寄主转录因子RAV2互作，可能通过RAV2调控寄主防御反应相关基因的表达来抑制寄主的RNA沉默机制[20]。

黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）编码的2b抑制子与寄主核糖体蛋白亚基RPS11互作，下调寄主中RPS11
的mRNA水平导致2b抑制子活性降低、病毒复制和积累减少，表明2b可能通过作用于寄主蛋白RPS11来发挥其抑制子功能[21]。

甜菜严重曲顶病毒（Beet severe curly top virus，BSCTV）、甜菜曲顶病毒（Beet curly top virus， BCTV）和番茄金色花叶病毒（Tomato golden mosaic virus， TGMV）编码的抑制子与寄主甲基化循环相关蛋白SAMDC1或ADK互作，通过抑制SAMDC1降解或者促使ADK失活，从而抑制寄主DNA甲基化介导的基因沉默[22-23]。

鉴定与病毒RNA沉默抑制子互作的寄主蛋白是研究抑制子作用机制的重要途径，目前已被应用于多个病毒RNA沉默抑制子作用机制的解析[13]，但未见SCSMV编码的RNA沉默抑制子P1与寄主蛋白互作研究的报道。

本研究利用酵母双杂交技术筛选与SCSMV P1蛋白互作的寄主（甘蔗）蛋白，以期为阐明SCSMV P1抑制RNA沉默的作用机制奠定基础，为SCSMV 的科学防控提供理论依据。

1.1材料
酵母双杂交所用质粒pGBKT7购自美国Clontech公司。

Y2H Gold菌株和DH5α感受态细胞购自上海唯地生物技术有限公司。

高保真酶Phanta HS Super-Fidelity DNA Polymerase购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司;快速限制性内切酶购自美国Thermo Scientific公司;T4 DNA连接酶购自美国Promega公司;X-α-gal和AbA溶液购自北京酷来搏科技有限公司。

琼脂糖凝胶回收试剂盒购自北京艾德莱生物科技有限公司;质粒小量提取试剂盒购自爱思进生物技术（杭州）有限公司;酵母质粒提取试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司。

引物合成由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.2 方法
1.2.1 SCSMV P1基因的克隆根据NCBI数据库中SCSMV的基因组序列（GenBank：
GQ246 187.1）及本实验室获得的SCSMV P1基因序列（待发表）设计P1基因扩增引物，并在正向引物引入酶切位点Eco R I，反向引物引入酶切位点Bam H I，引物序列具体如下：P1-Eco R I-F：TCCGA ATTCATGGCTACTATCACTAAG，P1-Bam H I-R：TCCGGATCCTCAGTAAAATACTAAATCTTC。

以实验室保存的含有P1基因的pMD-18T载体为模板，使用高保真酶Phanta HS Super-Fidelity DNA Polymerase PCR扩增P1基因。

扩增程序：95℃ 30s;95℃ 10 s，54℃ 10 s，72℃ 17 s（30个循环）;72℃ 10 min。

PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测，然后使用琼脂糖凝胶回收试剂盒进行回收。