血浆总蛋白测定

血清总蛋白降低： （1）血液稀释，导致总蛋白浓度相对降低：如静脉注射过 多低渗溶液或因各种原因引起的钠、水潴留。 （2）摄人不足和消耗增加：食物中长期缺乏蛋白质或慢性 胃肠道疾病所引起的消化吸收不良，因患消耗性疾病，如 严重结核病，甲状腺功能亢进，恶性肿瘤等，均可造成血 清蛋白浓度降低。 （3）蛋白质丢失：严重烧伤时大量血浆渗出，大量失血， 肾病综合征时大量蛋白尿，溃疡性结肠炎时肠道长期丢失 一定量的蛋白质，这些病理改变均可使血清总蛋白浓度降 低。 （4）合成障碍：肝脏疾病。
用于层析柱流出液的 检测；核酸的吸 收可以校正
Folin－酚试剂法 （Lowry法）
灵敏度高 ≈5g
慢速 40～60 分钟
双缩脲反应；磷钼 酸－磷钨酸试 剂被Tyr和Phe 还原
硫酸铵； Tris缓冲液； 甘氨酸； 各种硫醇
耗费时间长；操作要 严格计时； 颜色深浅随不同蛋白 质变化
考马斯亮蓝法 (Bradford法)
在一定浓度范围内，反应后颜色与被测样 品蛋白质含量呈线性关系，即蛋白质浓度 越高，体系的颜色越深。反应产物在540nm 处有最大吸收峰（吸光度）。 将未知浓度的样品溶液与一系列已知浓度 的标准蛋白质溶液同时与双缩脲试剂反应， 并在540nm处比色，可通过标准浓度蛋白质 绘制的标准曲线，求得未知样品中的蛋白 质含量（浓度）。
A测定管 A 标准管
标准蛋白液浓度（g / L）
注意事项
1.血清蛋白浓度用g/L表示，因为血清中各种蛋白质 的相对分子质量不同，所以不能用mol/L表示。 2.双缩脲试剂中酒石酸钾钠的作用是络合铜离子， 以维持铜离子在碱性溶液中的溶解性；碘化钾能 防止二价铜离子还原。 3.高脂，黄疸和溶血的标本应做空白对照来校正误 差。含脂类极多的血清加入双缩脲试剂后会出现 浑浊，可用乙醚3ml抽提后再进行比色。
4.血浆蛋白浓度大于100g/L时，需做稀释处理， 结果乘以稀释倍数。 5.双缩脲反应并非蛋白质的颜色反应。凡分子 内含有两个或两个以上氨基甲酰基，不论 是直接相连还是通过一个氮原子或碳原子 间接连接，均可呈现双缩脲反应，如缩二 脲，草酰二胺２，丙二酰胺等。
临床意义
血清总蛋白生理性波动。直立体位由于体液分布原因，血 液相对浓缩，而长久卧床者血液较直立体位稀。因此长久 卧床者血清总蛋白比直立活动时约低3～5g／L.新生儿血 清总蛋白可比成人低5～8g／L.60岁以上的老年人约比成 人低2g／L. 血清总蛋白增高： （1）血液浓缩，导致总蛋白浓度相对增高：严重腹泻、 呕吐、高热时急剧失水，血清总蛋白浓度可明显升高。休 克时，由于毛细血管通透性增加，血液中水分渗出血管。 血液可发生浓缩，慢性肾上腺皮质功能减退的患者，由于 丢失钠的同时伴随水的丢失，血浆也可出现浓缩现象。 （2）血浆蛋白质合成增加：主要见于球蛋白合成增加， 多发性骨髓瘤患者。
试剂
1、 6.0mol/LNaOH溶液 称取NaOH240g，溶于新鲜制备的 蒸馏水或刚煮沸冷却的去离子水800ml中，冷却后加蒸 馏水至1000ml，贮存于有盖塑料瓶中。 2、双缩脲试剂 称取硫酸铜（CUSO4· 5H2O）3.0g，溶于 500 ml新鲜制备的蒸馏水或刚煮沸冷却的去离子水中， 加酒石酸钾钠9.0g和碘化钾5.0g，待完全溶解后，加入 6.0mol/LNaOH溶液100ml，最后加蒸馏水至1000ml。 3、双缩脲空白试剂 除不含硫酸铜外，其余成分与双缩脲 试剂相同。 4、60～70g/L蛋白质溶液 常用牛血清清蛋白或收集正常人 的混合血清（无黄疸、 无溶血、 乙肝表面抗原阴性、 肝肾功能正常人血清)。
灵敏度最高 1～5g
快速 5～15分 钟
强碱性缓冲液； 最好的方法； 考马斯亮蓝染料与 干扰物质少； 蛋白质结合时， TritonX-100; SDS 其max由 颜色稳定； 465nm变为 颜色深浅随不同蛋Hale Waihona Puke 595nm 质变化实验目的
熟悉血清蛋白的测定方法（双缩脲法）。 掌握血清总蛋白测定的临床意义。 进一步巩固掌握721E型分光光度计的使用。
原理
双缩脲（ NH3CONHCONH3 ）是两分子尿素经180℃ 左右加热,放出一分子氨( NH3)后得到的产物。在强碱溶液 中，双缩脲与CUSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。 凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过1个中 间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。 蛋白质含有多个肽键，在碱性溶液中能与CU2+络合 成紫红色的络合物。其颜色的深浅与被测样品中蛋白质浓 度呈正比，而与蛋白质分子量和氨基酸成分无关，故可用 来测定蛋白质含量。该法对样品中蛋白质含量要求相对较 高，一般在1～10mg/L蛋白质。tris（三甲羟基氨基甲烷）、 一些氨基酸、EDTA（乙二胺四乙酸）、草二酰胺、多肽 等会于扰该测定。
血浆总蛋白测定
蛋白质含量测定法，是生物化学研究中最 常用、最基本的分析方法之一。目前常用 的有四种古老的经典方法，即定氮法，双 缩脲法（Biuret法）、Folin－酚试剂法 （Lowry法）和紫外吸收法。另外还有一种 近十年才普遍使用起来的新的测定法，即 考马斯亮蓝法（Bradford法） 。染料主要 是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨 酸）和芳香族氨基酸残基相结合。
方法 凯氏定氮法 （Kjedahl法）
灵敏度 灵敏度低，适 用于0.2~ 1.0mg氮， 误差为 2 ％
时间 费时 8～10小 时
原理
干扰物质
说明 用于标准蛋白质含量 的准确测定；干 扰少；费时太长
将蛋白氮转化为氨， 非蛋白氮（可 用酸吸收后滴 用三氯乙 定 酸沉淀蛋 白质而分 离）
双缩脲法（Biuret法）
方法与步骤
加入物
蒸馏水 蛋白标准液 质控血清 待测血清 0.1
试剂空 白管 0.1
标本空 标准 质控 测定管 白管 管 管
0.1 0.1 0.1
双缩脲空白 试剂 双缩脲试剂 5.0
5.0
5.0 5.0 5.0
混匀，37℃10分钟，以空白管调零，在540nm 比色读取吸光度值（A值）计算。
计算
血清TP（g / L）
灵敏度低 1～20mg
中速 20~30分 钟
多肽键＋碱性Cu2＋ 紫色络合物
硫酸铵； Tris缓冲液； 某些氨基酸
用于快速测定，但不 太灵敏；不同蛋 白质显色相似
紫外吸收法
较为灵敏 50～100g
快速 5～10分 钟
蛋白质中的酪氨酸 和色氨酸残基 在280nm处的 光吸收
各种嘌吟和嘧 啶； 各种核苷酸
此法的优点是操作简便、迅速、蛋白质浓 度与光密度的线性关系好，不同的蛋白质 产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。 主要缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用 于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白 质测定。
仪器与器材
可见光分光光度计、水浴箱（37℃）、分析 天平、振荡机（器）、漏斗、试管架、具 塞三角瓶（100ml） 、容量瓶、刻度吸管、 试管