GSH含量的测定.doc

主要目的：

——测定物质还原性谷胱甘肽（GSH）的含量。

主要原理：

参照 GSH检测分析试剂盒说明书， 5,5 ’–二硫代–双–（2–硝基苯甲酸）能和

谷胱甘肽（GSH）反应产生 2–硝基– 5–巯基苯甲酸和谷胱甘肽二硫化物（ GSSG），

由于 2–硝基– 5–巯基苯甲酸是一黄色产物，通过测定其在412 nm处的最大吸

收可确定样品中谷胱甘肽的含量用纯化的谷胱甘肽（GSH）抗体包被微孔板，制

成固相抗体，往包被单抗的微孔中加入谷胱甘肽（GSH），再与HRP标记的谷胱甘

肽（ GSH）抗体结合，形成抗体 - 抗原 - 酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物

TMB显色。 TMB在 HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的谷胱甘肽（GSH）呈正相关。用酶标仪在412 nm波长下测定吸光度（ OD值），通过标准曲线计算样品中谷胱甘肽（GSH）的含量。

实验室签章

一、试剂

——谷还原性胱甘肽（ GSH）测定试剂盒（南京建成生物研究所）

二、仪器设备

—— 96 孔酶标板

—— UV-Vis 可见多功能酶标

仪——旋涡混匀器——离心机

——移液枪及其相应量程枪头

三、实验方法

根据试剂盒说明书具体操作步骤如下:

1.上清液的制备：取稀释后的血清或组织匀浆液 mL，加试剂一应用液 2 mL 混匀， 4000 rpm 离心 10 分钟，取上清液 1 mL 进行显色反应。

2.显色反应：空白管中加入 1 mL 试剂一，标准管加入 20μmol/LGSH标准

液 1 mL，测定管加入上步骤得到的上清液 1 mL，然后各管中分别加入mL 试剂

二、试剂三、 mL 试剂四。

3.混匀，室温静置 5 分钟后，在 412 nm处将酶标板空板进行扫描，准确吸

取 mL 各管反应液加入到新的 96 孔板中，酶标仪测定各孔吸光度（ OD值）。

4.血清中 GSH含量计算公式

GSH含量（ mg/L）

测定 OD值 -空白 OD

值

-3 mmol/L）

×标准品浓度（ 20×10

标准 OD值-空白 OD值

×GSH分子量（ 307）×样本测试前稀释倍数

组织中 GSH含量公式

测定OD值-空白OD值

-3 GSH含量（mg/gprot ）×标准品浓度（20×10 mmol/L）

×GSH分子量（ 307）×样本测试前稀释倍数÷待测组织匀浆液蛋白浓度

（gprot/L ）

参考文献

Lapshina E A, Sudnikovich E J, Maksimchik J Z, et al. Antioxidative enzyme and glutathione S-transferase activities in diabetic rats exposed to long-term ASA treatment [J]. Life sciences, 2006, 79(19): 1804-1811.