从环境中分离放线菌

• 土壤颗粒的分散程度对于分离放线菌也有影响。钱恒段等，用胆酸钠处理土 壤悬液后土壤分散效果较好，且优于纯蒸馏水。这可能是因为胆酸钠对土壤 腐殖质具有较强的结合能力从而有利于破坏土壤团聚结构。 • 据杨宇容等,重铬酸钾对土壤真菌、细菌的抑制作用较明显，然而对放线菌 并无抑制作用。而且其价格低廉，如安德荣等[其可作为理想的放线菌分离 抑制剂。徐成勇等实验证明酵母膏、SDS（十二烷基硫酸钠）也有抑菌的作 用。 • 本实验所用方法为综合徐成勇等及钱恒段等实验结果所得。
从环境中分离放线菌
组长：褚凤珅、组员：赵玉玺、、张治 、王霞、 张佳慧 、张欢欢
一、 实验目的
• 1.学习从土壤中分离放线菌的方法 • 2.练习、掌控微生物接种、移植和培养的基本技术。 • 3.掌握无菌操作技术。
二、实验原理
• 放线菌是原核生物，是重要的抗生素产生菌，在土壤中的数量仅次于细菌， 尤其在有机质丰富、透气性好的中性到微碱性土壤中的数量较多。
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五、实验预期结果
• 于时间有限，不能对土样进行风干，可能会影响分离得到的放线 菌的纯度。 • 而且可能实验进行不到纯化这一步，仅停留在分离就必须终止实 验。但是由于预先对土样进行的充分的处理，培养时也选用了针 对放线菌的培养基并且加入了有效的抑制剂，即使没有纯化，分 离后也可达到实验目的。
三、实验材料
• 1、样品 • 干燥的营养基质丰富的苗圃土 • 2、仪器 • 铲子、牛皮纸、搪瓷杯、锥形瓶、玻璃棒、烧杯、小试剂瓶、标 签纸、移液管、接种环、试管、记号笔、酒精灯、电子天平、电 炉、恒温培养箱、加压蒸汽灭菌锅、电热干燥烘箱
3、培养基及试剂配制
• 1）培养基（高氏一号琼脂+重酪酸钾培养基)配制: • 配方：可溶性淀粉20g、K2HPO4 0.5g、1mol/LNaOH、MgSO4•7H2O 0.5g、NaCl 0.5g、 FeSO4•7H2O 0.01g、琼脂20g、蒸馏水1000ml、250mg重酪酸钾、PH7.2~7.4。 • 步骤：用搪瓷杯先量取500ml自来水在电炉上加热。根据配方，依次称取各种药品加入搪瓷 杯中，搅拌均匀。可溶性淀粉称入烧杯中，加入50ml自来水调成糊状，待培养液煮沸时加 入淀粉糊，边加边搅拌，防止糊底。之后，加入琼脂煮沸至完全溶化，补足1000ml水量。 接着，缓慢加入NaOH液，边加入边搅匀培养液，然后用PH试纸测其酸碱值，调PH至7.2~7.4。 • 趁热分装于8个三角瓶中，塞好棉塞。用牛皮纸包扎好，贴好标签。最后，高压蒸汽灭菌， 121℃灭菌30min. • （2）试剂配制：
• 蒸汽灭菌制备无菌水。
• 干热灭菌9个锥形瓶、平皿10个、玻璃棒3个、移液管3个、10个试管
土壤的采集及处理过 程
• 3、分离 • （1）方法：将处理后的土壤悬浮液稀释100倍备用。加热已制备 并灭菌好的高氏合成1号琼脂+重酪酸钾培养基，在无菌条件下倒 10个平板然后，贴好标签，冷却。用平板稀释法[6]（稀释度从 10-3到10-5,浓度设置见）将菌种接种在高氏合成1号琼脂+重酪酸 钾的平板培养基上,28℃培养5~7d。 • （2）原理：见上文实验原理。 • （3）注意：稀释样品时要在无菌条件下进行；每个稀释度做2~3 个培养皿，并做好标记；实验中要留一个空白对照；注意划线时 的操作。
•
1mol/LNaOH、6%酵母膏和用5 mmol / L 磷酸缓冲液稀释的0.05% SDS
制作培养基的仪器准备
制作培养基的药品准 备
药品的称量 过程
培养基的制作过 程
四、实验方案
• 1、土样的采集及处理 • （1）方法：在苗圃，按对角交叉（五点法）取样。先出去表层约2cm的土壤，将铲子插入 土中数次，然后取2~10cm处的土壤于叠好的牛皮纸袋里。将土样放入三角瓶中，加入少量 胆酸钠，再加适量蒸馏水振荡溶解制成土壤悬浮液。调节稀释液的PH为7，略微加热后冷却 至40℃。之后，再加6%酵母膏和用5 mmol / L 磷酸缓冲液稀释的0.05% SDS震荡20min。 • （2）原理：放线菌在较干燥的，营养基质较丰富的中性或微碱性土壤中分布较多；胆酸钠 有利于分散土壤颗粒；一定浓度的酵母膏和SDS有抑制细菌、真菌的作用。 • （3）注意：所取的土样不可过湿，防止样品中杂菌过多；至土壤稀释液时要振荡充分，是 土样与水充分混合，将菌分散。 • 2、器材灭菌
加热已制备并灭菌好的高氏合成1号琼脂+重酪酸钾培养基，在无菌条件下倒10个平板贴好标 签，冷却。
用平板稀释法（稀释度从10-3到10-5浓度）将菌种接种在高氏合成1 号琼脂+重酪酸钾的平板培养基上
• 4、纯化 • （1）方法：5~7天后，加热培养基，倒斜面。选择挑取效果较好 的菌落用接种环接种于高氏1号斜面，28℃培养5~7d。 • （2）原理：放线菌的群体特征：小型、干燥、不透明、与培养 基连接紧密，难以挑取，表面呈致密的丝绒状，上有一薄层彩色 “干粉”，正反面颜色不一致，边缘琼脂平面有变形。 • （3）注意：实验过程要做好标记。