CC11 Rosetta(DE3)感受态细胞

Rosetta感受态细胞
Rosetta Competent Cell
规格
Rosetta ：10×100μl
pUC19（control vector）：0.1ng/μl, 5μl
保存条件：-80℃
基因型
F-ompT hsdSB(rB-mB-)gal dcm(DE3) pRARE(argU，argW，ileX，glyT，leuW，proL)(CamR)
说明：华越洋Rosetta 感受态细胞具有氯霉素抗性补充大肠杆菌缺乏的6种稀有密码子(AUA，AGG，AGA，CUA，CCC，GGA) 对应的tRNA，提高外源基因，尤其是真核基因在原核系统中的表达水平，经pUC19 质粒检测转化效率高达109cfu/μg。

操作方法
1. 取100 μl 冰上融化的Rosetta 感受态细胞，加入目DN（质粒或连接产物）并轻轻混匀，冰上静置25分钟。

2. 42℃水浴热激45 秒，迅速放回冰上，静置2 分钟，晃动会降低转化效率。

3. 向离心管中加入700μl 不含抗生素的无菌培养基（2YT 或LB），混匀后37℃，200 rpm 复苏60 分钟。

4. 5000rpm 离心1 分钟收菌，留取100μl 左右上清轻轻吹打重悬菌块并涂布到含相应抗生素的2YT或LB 培养基上。

5. 将平板倒置放于37℃培养箱，过夜培养。

注意事项
1. 感受态细胞最好在冰上融化。

2. 混入质粒或连接产物时应轻柔操作。

3. 转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。

重组质粒的诱导表达——表达宿主菌以及诱导表达
1.表达宿主菌的选择
大肠杆菌常用的表达宿主菌有E.Coli BL21(DE3), E.Coli Rossatta(DE3), E.Coli BL21(DE3)Condon Plus。

针对特殊的目标蛋白其所需要的宿主菌也不相同，每种宿主菌的基本特征可在本网站查询，福因德生物可提供表中所列菌种的感受态细胞，如需更多信息可联系福因德技术部门。

2．优化表达条件
表达条件(包括IPTG浓度、诱导温度和和诱导时间等)的优化（可参照以下的正交图设计实验），主要是为了提高蛋白产量/提高可溶性蛋白表达比例；选用不同诱导时长主要是为了选择最佳收获时间（时间短了，蛋白产量不够；时间长了，大量蛋白降解）；温度诱导主要是为了得到可溶性表达的蛋白，很多的蛋白即使低温诱导也不能实现可溶性表达，一定要实现可溶性表达尽可能选择促溶标签/调整IPTG浓度，使翻译速度放缓有充分时间折叠。

福因德生物技术团队研发的自诱导培养基（Frdbio T7表达自诱导培养基即用型，PER0011）就是充分利用此原理，对表达在包涵体状态的蛋白优化为上清可溶表达状态的成功率高达60%。

可溶性表达的策略在“蛋白可溶性表达的解决方案”中有详细的阐述。

各种感受态细胞的区别、用途和特征Xl1-Blue菌株基因型：endA1 gyrA96(nalR) thi-1 recA1 relA1 lac glnV44 F‘[Tn10 proAB+ lacIq Δ(lacZ)M15] hsdR17(rK- mK+)。

特点：具有卡那抗性、四环素抗性和氯霉素抗性。

用途：分子克隆和质粒提取。

BL21(DE3)菌株基因型：F–ompT gal dcm lon hsdSB(rB- mB-) λ(DE3 [lacI lacUV5-T7 gene 1 ind1 sam7 nin5])。

特点：该菌株用于以T7 RNA聚合酶为表达系统的高效外源基因的蛋白表达宿主。

T7噬菌体RNA聚合酶基因的表达受控于λ噬菌体DE3区的lacUV5启动子，该区整合于BL21的染色体上。

该菌适合于非毒性蛋白的表达。

用途：蛋白质表达。

[生物秀-专心做生物]BL21(DE3)ply菌株基因型：F- ompT gal dcm lon hsdSB(rB- mB-) λ(DE3) pLysS(cmR)。

特点：该菌株带有pLysS，具有氯霉素抗性。

此质粒还有表达T7溶菌酶的基因，T7溶菌酶能够降低目的基因的背景表达水平，但不干扰IPTG诱导的表达。

适合于毒性蛋白和非毒性蛋白的表达。

用途：蛋白质表达Competent E. coliFull Product Description BL21 Star™ E. coli strains are high-performance BL21 hosts designed for improving protein yield in a T7 promoter-based expression system. Because T7 RNA polymerase synthesizes mRNA more rapidly than E. coli RNA polymerases, transcription from the T7 promoter is uncoupled to translation in E. coli. This results in mRNA transcripts unprotected by ribosomes, which are then subject to enzymatic degradation by endogenous RNases (1). The reduced level of transcripts in the cell often leads to greatly reduced levels of protein yield (Figure1). The BL21 Star™ strains contain a mutation in the gene encoding RNaseE (rne131), which is one of the major s ources of this mRNA degradation (2). BL21 Star™ cells significantly improve the stability of mRNA transcripts and increase protein expression yield from T7promoter-based vectors (3) (Figure 2).BL21 Star™(DE3) is ideal for expressing proteins that are no n-toxic to E. coli.BL21 Star™(DE3)pLysS offers lower basal-level expression of heterologous genes than BL21 Star™(DE3). It is designed for expressing proteins that are slightly growth inhibitive to E. coli.DH5α菌株基因型：F- endA1 glnV44 thi-1 recA1 relA1 gyrA96 deoR nupG Φ80dlacZΔM15 Δ(lacZYA-argF)U169, hsdR17(rK-, λ–特点：一种常用于质粒克隆的菌株。

DE3 宿主菌株质粒在非表达宿主菌中构建完成后，通常转化到一个带有T7 RNA 聚合酶基因的宿主菌（λDE3溶原菌中表达目标蛋白。

在λ DE3 溶原菌中，T7 RNA 聚合酶基因由 lacUV5 启动子控制。

未诱导时便有一定程度转录，因此适合于表达其产物对宿主细胞生长无毒害作用的一些基因。

而宿主菌带有 pLysS 和 pLyE 时调控会更严紧。

pLys 质粒编码T7 溶菌酶，它是T7 RNA 聚合酶的天然抑制物，因此可降低其在未诱导细胞中转录目标基因的能力。

pLysS 宿主菌产生低量T7 溶菌酶，而pLysE 宿主菌产生更多酶，因此是最严紧控制的λ DE3 溶原菌。

使用最广泛的为 BL21 及其10种衍生菌株，它的优点在于缺失 lon 和 ompT 蛋白酶。

B834 菌株为甲硫氨酸营养缺陷型，因此可用 35 S- 甲硫氨酸和硒代甲硫氨酸对目标蛋白进行高特异活性标记。

BLR 为recA - 衍生菌株，改善了质粒单体产量，有助于稳定含有重复序列的目标质粒。

两个硫氧还蛋白还原酶(trxB)突变菌株 (AD494,BL21 trxB )，有利于大肠杆菌胞浆中二硫键形成。

Origami TM 和 OrigamiB 菌株为 trxB/gor 双突变，这两个酶是主要还原途径的关键酶。

Origami TM和Origami B 宿主菌的主要优点是能形成正确折迭的含有二硫键的蛋白。

新的 Rosetta TM 菌株补充了四种大肠杆菌稀有密码子的 tRNA ，改善了由于密码子使用频率不同而引起的一些真核蛋白低表达。

其它菌株背景包括K-12菌株 HMS174 和 NovaBlue,象BLR 一样为 recA 。

这些菌株可稳定表达其产物可能导致 DE3 噬菌体丢失的某些目标基因。

由于存在 F 附加体编码的高亲和力 lacIq 阻遏蛋白, NovaBlue 为一个有用的严紧型宿主菌。

（DE3）指宿主为λDE3 溶原菌，其染色体上带有一拷贝由 lacUV5启动子控制的T7 RNA聚合酶基因。

Rosetta(DE3)感受态细胞说明书货号：C1420规格：10×100ul/20×100ul保存：-70℃保存，运输为干冰包装。

-70℃保存至少6个月。

产品简介：Rosetta(DE3)感受态细胞是采用大肠杆菌Rosetta(DE3)菌株经特殊工艺处理得到的感受态细胞，可用于DNA的化学转化。

使用pUC19质粒检测，转化效率可达107cfu/µg，-70℃保存几个月转化效率不发生改变。

基因型:F-ompThsdSB(rB-mB-)galdcmlacY1(DE3)pRARE(argU,argW,ileX,glyT,leuW,proL)(Camr)特点:该菌株是携带氯霉素抗性质粒BL21的衍生菌，补充大肠杆菌缺乏的6种稀有密码子(AUA,AGG,AGA, CUA,CCC,GGA)对应的tRNA，提高外源基因，尤其是真核基因在原核系统中的表达水平。

操作方法：（以下操作均按无菌条件的标准进行）1、将感受态细胞置于冰上融化，以下实验以100ul感受态细胞为例。

2、向感受态细胞悬液中加入需转化的目的DNA，注意目的DNA的体积不要超过感受态细胞悬液体积的十分之一，轻轻旋转离心管以混匀内容物，冰浴放置30分钟。

3、将离心管置于42℃水浴中60-90秒，然后快速转移到冰浴中放置2-3分钟，注意不要摇动离心管。

4、向离心管中加入500ul无菌无抗的SOC或LB培养基，37℃180rpm振荡培养1小时。

目的是使质粒上相关的抗性标记基因表达，使菌体复苏。

5、取适量已转化的感受态细胞涂布含相应抗生素的SOC或LB平板，37℃倒置培养12-16小时。

涂布用量可根据具体实验来调整，如转化的DNA总量较多，可取100ul左右的转化产物涂板；反之，如转化的DNA总量较少，可取200-300ul的转化产物涂板。

过多菌液可以抑制细菌生长。

如果预计的克隆较少，可通过离心后吸除部分培养液，悬浮菌体后将其涂布于一个平板中。

H3N2亚型猪流感病毒 HA 和 HA1蛋白的原核表达纪方晓;陈济铛;石庆伟;王衡;张桂红【摘要】To express the HA and HA1 proteins of H3N2 swine influenza virus,the HA and HA1 genes were amplified by RT-PCR and cloned into prokaryotic expression vector pMAL-c5X.Recombinant plasmid pMAL-c5X-HA and pMAL-c5X-HA1 were transformed to E.coli Rosetta (DE3)and induced with IPTG. The HA and HA1 proteins were expressed successfullyin the forms of soluble proteins and inclusion bodies.What′s more,both of the HA and HA1 proteins could be recognized by HA antibody of H3N2 sub-type,it revealed that the HA and HA1 proteins have good antigenicity.%为原核表达 H3N2亚型猪流感病毒（SIV）的 HA 和 HA1蛋白，通过 RT-PCR 方法获得 SIV 的HA 和 HA1基因，克隆至原核表达载体 pMAL-c5X，并转化至原核表达菌 Rosetta（DE3）中，表达菌经 IPTG诱导表达后进行 SDS-PAGE 和Western blot 分析。

结果显示，成功表达了 H3亚型 SIV 的 HA 和 HA1蛋白，目的蛋白均以可溶性蛋白和包涵体两种形式存在，并与 H3N2亚型 SIV 的 HA 单克隆抗体反应，说明HA 和 HA1蛋白具有良好的反应原性。

感受态细胞制备制备感受态常用得方法就是电击法与CaCl2制备法,以下介绍CaCｌ2制备法:1、可以从－８0℃冰柜中,取出一支冻存菌株,于事先照过紫外得超净台中,用无菌得接种环轻轻蘸取菌种后,在无抗平板(由于Rocetta含有氯霉素抗性,需要涂布在氯霉素抗性得平板,后面得都就是如此)上划线,并将菌种迅速放回－80℃保存,在划线板上做好相应标记,于３7℃培养过夜。

2、从37℃培养过夜得新鲜平板上挑取一个单克隆,接种于2mlEP管中,3７℃,２20ｒｐm震荡培养约6个小时至对数生长中后期;将该菌悬液以1:1０0得比例接种于5０ml LB液体培养基(２瓶)中,3７℃振荡培养2、5小时至ＯD600＝0。

5。

注意:接种比例不得大于1:１0。

3、在无菌条件下将细菌转移到一个无菌、预冷得离心管(50ml)中,在冰上放置5~1０ｍin; 注意:划板、接种为了防止意外发生最好多划一块平板与多接一根试管,划板、接种、转接均要严格按照无菌操作。

4、4℃５000g离心５分钟。

用预冷得去离子水洗涤沉淀,4℃ 500０ｇ离心５分钟;Nｏte:此步主要就是为了洗去培养基中得盐等5、沉淀加入2ｍl预冷得0、05mol/L CaＣｌ2—１5％甘油混合溶液,轻吹散,冰浴5分钟,4℃5００0ｇ离心5分钟;6、沉淀加入2ｍl预冷得0.05ｍol/L CａCl２—15％甘油混合溶液,轻吹散,即成为感受态细胞悬液。

分装成50～1００μl得小份,贮存于－70℃可保存半年。

含15％甘油得0.０5mol/L CaCｌ2制备方法:称取0。

28g CaCl２(无水,分析纯),溶于５０ml重蒸水中,加入１5ｍl甘油,定容至100ｍl,高压灭菌。

感受态细胞得特征感受态:通过特殊处理使细胞处于能够吸收外源ＤＮA得状态。

感受态细胞得特征:(1)细胞表面暴露出一些可接受外来ＤNA得位点(以溶菌酶处理,可促使受体细胞得接受位点充分暴露)。

(2)细胞膜通透性增加(用钙离子处理,可使膜通透性增加,使DNＡ直接穿过质膜进入细胞)。

感受态细胞的原理有哪些
感受态细胞（Receptor cells）是一种特化的细胞，通过感受或检测外部刺激，将其转化成电信号或化学信号，随后传递给神经系统的其他部分进行处理和解读。

感受态细胞的原理包括以下几个方面：
1. 特定结构：感受态细胞通常具有特定的结构，如感受态毛细胞、感受态纤毛细胞、感受态视网膜细胞等。

这些结构使得感受态细胞能够特异地感受不同类型的刺激。

2. 受体蛋白：感受态细胞表面通常存在着特定的受体蛋白，用于与特定的刺激分子结合。

当刺激分子与受体蛋白结合时，会引发一系列的生化反应。

3. 转导信号：当刺激分子与受体蛋白结合时，感受态细胞会通过转导机制将这个刺激转化为电信号或化学信号。

具体的转导机制因细胞类型和感受类型不同而有所差异，包括离子通道通透性的改变、蛋白激酶级联反应等。

4. 信号传递：转化后的电信号或化学信号会传递给感受态细胞周围的神经系统的其他部分，通过神经递质的释放来传递信息。

直接给出感受态细胞：视网膜细胞是一种常见的感受态细胞。

它们包含感受光线的特殊受体蛋白，并能将光信号转化为神经信号，然后传递给大脑进行视觉处理。

畜牧兽医学报 2023,54(10):4320-4326A c t a V e t e r i n a r i a e t Z o o t e c h n i c a S i n i c ad o i :10.11843/j.i s s n .0366-6964.2023.10.028开放科学(资源服务)标识码(O S I D ):基于G N S 蛋白的牛流行热病毒感染与免疫鉴别诊断E L I S A 方法的建立何辰香1,高闪电1*,田占成1,独军政1,王锦明1,关贵全1,殷 宏1,2*(1.中国农业科学院兰州兽医研究所动物疫病防控全国重点实验室,兰州730046;2.江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心,扬州225009)摘 要:旨在建立牛流行热病毒(B E F V )感染与疫苗免疫的抗体E L I S A 诊断方法㊂在证实B E F V G N S 截短体与B E F V 感染血清特异性反应的基础上,利用原核表达系统表达纯化G N S 全长蛋白并以其作为包被抗原,优化反应条件,建立基于B E F V G N S 的鉴别病毒感染与疫苗免疫的B E F V 间接E L I S A 方法㊂结果显示:在大肠杆菌中成功表达G N S 蛋白,主要以包涵体的形式存在,纯化获得73k u 的重组蛋白㊂W e s t e r n b l o t 结果显示,纯化后的重组蛋白与B E F V 感染牛血清反应原性良好,且与B E F 疫苗免疫牛血清未见反应㊂G N S 抗原最佳包被浓度为0.50μg㊃m L -1,血清最佳稀释度为1ʒ20,酶标二抗最佳稀释度为1ʒ4000,阴阳性临界值为S /P 值0.2069㊂该方法与B V D V ㊁F M D V 以及I B R V 阳性血清无交叉反应,特异性良好;批内和批间变异系数均小于10%,重复性良好,可用于B E F V 感染与疫苗免疫牛的鉴别诊断㊂关键词:牛流行热;牛流行热病毒;牛流行热灭活疫苗;G N S 蛋白;鉴别诊断E L I S A中图分类号:S 852.659.5 文献标志码:A 文章编号:0366-6964(2023)10-4320-07收稿日期:2023-01-11基金项目:甘肃省重点研发计划(22Y F 7N A 030);甘肃省创新引导计划-科技特派团专项(22C X 8N A 011);兰州市科技计划项目(2021-1-12);国家重点研发计划项目(2021Y F D 1800500);甘肃省基础研究创新群体项目(22J R 5R A 024);国家肉牛牦牛产业技术体系(N B C I S,C A R S -37);农业科技创新工程(C A A S -A S T I P -2016-L V R I)㊂作者简介:何辰香(1997-),女,甘肃陇南人,硕士,主要从事家畜分子病毒学研究;高闪电(1980-),男,河北石家庄人,副研究员,主要从事家畜分子病毒学研究㊂何辰香和高闪电为同等贡献作者*通信作者:高闪电,E -m a i l :g a o s h a n d i a n @c a a s .c n ;殷 宏,主要从事兽医微生物及其分子生物学研究,E -m a i l :y i n h o n g@c a a s .c n D e v e l o p m e n t o f a D i f f e r e n t i a l D i a gn o s t i c E L I S A B a s e d o n G N S P r o t e i n t o D i s t i n gu i s h B E F V I n f e c t e d a n d V a c c i n a t e d C a t t l e H E C h e n x i a n g 1,G A O S h a n d i a n 1*,T I A N Z h a n c h e n g 1,D U J u n z h e n g 1,WA N G J i n m i n g 1,G U A N G u i q u a n 1,Y I N H o n g1,2*(1.S t a t e K e y L a b o r a t o r y f o r A n i m a l D i s e a s e C o n t r o l a n d P r e v e n t i o n ,L a n z h o u V e t e r i n a r y Re s e a r c h I n s t i t u t e ,C h i n e s e A c a d e m y of Ag r i c u l t u r a l S c i e n c e s ,L a n zh o u 730046,C hi n a ;2.J i a n gs u C o -i n n o v a t i o n C e n t e r f o r P r e v e n t i o n a n d C o n t r o l o f I m p o r t a n t A n i m a l I n fe c t i o u s D i s e a s e s a n d Z o o n o s e s ,Y a n gz h o u 225009,C h i n a )A b s t r a c t :T h i s s t u d y f o c u s e d o n d e v e l o p i n g a n a n t i b o d y -d e t e c t i n g E L I S A c a p a b l e o f d i s t i n gu i s -h i n g B E F V i n f e c t e d a n d v a c c i n a t e d a n i m a l s .B a s e d o n t h e i d e n t i f i e d s p e c i f i c r e a c t i v i t y be t w e e n t h e t r u n c a t e d B E F V G N S p r o t e i n a n d s e r af r o m B E F V i n f e c t e d c a t t l e ,t h e f u l l -l e n gt h G N S r e c o m b i n a n t p r o t e i n w a s e x p r e s s e d i n p r o k a r y o t i c s y s t e m ,p u r i f i e d a n d u s e d f o r d e v e l o p i n g a n a n t i b o d y-d e t e c -t i n g E L I S A t o d i s t i n g u i s h B E F V i n f e c t e d a n d v a c c i n a t e d a n i m a l s u n d e r t h e o pt i m i z e d r e a c t i o n10期何辰香等:基于G N S蛋白的牛流行热病毒感染与免疫鉴别诊断E L I S A方法的建立c o nd i t i o n s.T he G N S w a s e x p r e s s e d i n E s c h e r i c h i a c o l i a n d d e p o s i t e d m a i n l y i n i n c l u s i o n b o d i e s. T h e p u r if i e d r e c o m b i n a n t p r o t e i n h a d a m o l e c u l a r w e igh t o f73k u.W e s t e r n b l o t d e m o n s t r a t e d t h a t s e r a f r o m B E F Vi n f e c t e d c a t t l e b u t n o t s e r a f r o m B E F v a c c i n e i mm u n i z e d c a t t l e r e a c t e d s t r o n g l y w i t h t h e p u r i f i e d G N S p r o t e i n.T h e o p t i m a l c o n c e n t r a t i o n s o f p l a t e-c o a t i n g a n t i g e n s a n d t h e d i l u t i o n o f s e r a w e r e0.50μg㊃m L-1a n d1ʒ20,t h e H R P c o nj u g a t e d s e c o n d a r y a n t i b o d y w a s d e t e r m i n e d t o b e1ʒ4000,a n d t h e S/P r a t i o=0.2069w a s s e l e c t e d a s t h e n e g a t i v e/p o s i t i v e c u t-o f f v a l u e.A c c e p t a b l e s p e c i f i c i t y a n d r e p e a t a b i l i t y w e r e c o n f i r m e d b y n o c r o s s r e a c t i v i t y w i t h p o s i-t i v e s e r a o f B V D V,F M D V a n d I B R V a s w e l l a s c o e f f i c i e n t o f v a r i a t i o n l e s s t h a n10%i n i n t r a-b a t c h a n d i n t e r-b a t h.T h e D I V A(d i f f e r e n t i a t i o n o f i n f e c t e d f r o m v a c c i n a t e d a n i m a l s)E L I S A w a s d e v e l o p e d a n d c a n b e u s e d f o r d i s t i n g u i s h B E F V i n f e c t e d a n d v a c c i n a t e d c a t t l e.K e y w o r d s:b o v i n e e p h e m e r a l f e v e r;b o v i n e e p h e m e r a l f e v e r v i r u s;B E F i n a c t i v a t e d v a c c i n e;G N S p r o t e i n;d i f f e r e n t i a l d i a g n o s t i c E L I S A*C o r r e s p o n d i n g a u t h o r s:G A O S h a n d i a n,E-m a i l:g a o s h a n d i a n@c a a s.c n;Y I N H o n g,E-m a i l: y i n h o n g@c a a s.c n牛流行热病毒(b o v i n e e p h e m e r a l f e v e r v i r u s, B E F V)是弹状病毒科㊁暂时热病毒属的代表性物种,可引起牛高热㊁呼吸迫促㊁消化机能障㊂B E-F V目前分布在热带和亚热带地区的40多个国家,导致奶牛产奶产量严重减少㊁瘫痪或死亡,造成严重的经济影响[1]㊂病毒R N A编码10个基因,其中N㊁P㊁M㊁L和G基因编码病毒结构蛋白,G N S㊁α1㊁α2㊁α3㊁β和γ编码非结构蛋白[2-3]㊂G蛋白是病毒保护性抗原,α1可以结合i m p o r t i n β1和i m p o r t i n7来调节核内运输途径,α3可与核内不均一性核糖核蛋白K互作引起细胞凋亡并促进B E F V复制,但其它非结构蛋白的功能尚未完全阐明[4-5]㊂在血清学诊断方面,微量中和试验以及基于G 蛋白E L I S A检测可用于非疫苗免疫动物B E F V感染的诊断,但不能区分疫苗接种和自然感染动物[6-8]㊂作者前期全面筛选可用于疫苗免疫和自然感染甄别的病毒抗原,发现B E F V G N S蛋白N端截短体㊁G N S蛋白C端截短体㊁α2等蛋白可用于B E F V 感染牛和免疫牛血清抗体甄别,且G N S蛋白N端截短体与G N S蛋白C端截短体均具有较好的反应原性[9]㊂在实际应用中,作者以蛋白复合物为检测抗原以增加检测准确度[10]㊂为了避免制备蛋白复合物的繁琐流程,本研究利用大肠杆菌表达系统制备G N S全长蛋白,建立了一种与现有疫苗配套的鉴别诊断E L I S A方法,为B E F V血清流行病学监测和防控提供技术支撑㊂1材料与方法1.1试验材料B E F V H N1/2012株c D N A㊁p P R O E X H T b原核表达载体㊁B E F V临床血清样本㊁阴性血清㊁标准阳性血清㊁标准阴性血清㊁感染血清,F MD V O 型㊁A型标准免疫血清㊁T r a n s5α㊁R o s e t t a(D E3)感受态细胞,均保存于中国农业科学院兰州兽医研究所动物疫病防控全国重点实验室㊂B E F灭活疫苗㊁B V D-I B R二联灭活疫苗免疫牛血清,由宁夏农林科学院动物科学研究所王建东老师惠赠㊂1.2主要试剂D N A聚合酶㊁即用型无缝克隆试剂盒㊁N i-N T A琼脂糖纯化树脂以及化学发光试剂盒,为工生物工程(上海)股份有限公司产品㊂辣根过氧化物酶标记的兔抗牛I g G购自S i g m a公司㊂1.3原核表达载体构建以H N1/2012株c D N A为模板,利用G N S(n t31-666)上游引物:5'-T T T C A G G G C G C C A T G G G A T-C C G T A T A C T G T G T A A A A A C C T C-3'㊁G N S(n t673-1635)下游引物:5'-T C C A T G G G A T A T C G G G G A T-C C T G A T G A T T C C T C A T T C C A A T A-3'P C R扩增并进行胶回收,之后利用快速克隆试剂盒与B a m H Ⅰ㊁H i n dⅢ预先处理的p P R O E X H T b载体进行重组,经转化㊁菌落P C R筛选㊁测序验证获得重组表达载体p P R O-G N S㊂1234畜牧兽医学报54卷1.4重组蛋白H i s-G N S的表达纯化及鉴定将p P R O-G N S转化R o s e t t a(D E3)感受态细胞,在100m L L B液体培养基中37ħ培养,在O D值达到0.6~0.8时加入I P T G(终浓度为1.0m m o l㊃L-1)继续培养,6h后收集菌体进行S D S-P A G E确定目的蛋白H i s-G N S的表达㊂离心收集菌体重悬于10m L P B S中,超声波处理20m i n(功率40W,每破碎5s后间隔2s),然后10000g4ħ离心10m i n,进行可溶性分析确定目的蛋白的可溶性㊂参照N i-N T A琼脂糖纯化树脂操作说明,对沉淀中的目的蛋白进行纯化,利用透析液(10mm o l㊃L-1 T r i s,p H8.0,0.1%T r i t o n X-100)透析过夜,保存备用㊂分别利用1ʒ200倍稀释的B E F V感染牛血清㊁B E F疫苗免疫牛血清为一抗,H R P标记兔抗牛I g G(1ʒ8000)为二抗,进行W e s t e r n b l o t鉴定㊂经一抗㊁二抗分别孵育1h,用T B S T洗膜3次,利用超敏化学发光底物室温避光作用5m i n并拍照保存㊂1.5间接E L I S A方法的建立1.5.1抗原最佳包被浓度和血清稀释度的确定用碳酸盐包被液将不同浓度的H i s-G N S蛋白(4.0㊁2.0㊁1.0㊁0.5㊁0.25μg㊃m L-1)包被酶标板, 4ħ放置12h;经5%脱脂奶粉37ħ封闭1h,依次加入1ʒ10或1ʒ20稀释的B E F V阳性血清和阴性血清㊁辣根过氧化物酶标记的兔抗牛I g G(1ʒ4000)㊁T M B底物㊁终止液,之后测定O D450n m值㊂所用稀释抗原㊁待检血清以及辣根过氧化物酶标记的兔抗牛I g G的体积为100μL,在加入前均利用P B S T洗涤酶标板3次㊂待检血清和辣根过氧化物酶标记的兔抗牛I g G的孵育时间均为30m i n,TM B 作用时间为10m i n㊂最终根据阳性血清O D450n m与阴性血清O D450n m比值(P/N值)判定最佳反应条件㊂1.5.2辣根过氧化物酶标记的兔抗牛I g G最佳稀释倍数确定按照上述最佳抗原包被浓度和血清稀释度,利用1ʒ2000㊁1ʒ4000㊁1ʒ8000㊁1ʒ16000稀释辣根过氧化物酶标记的兔抗牛I g G,进行E L I S A,根据最大P/N值确定辣根过氧化物酶标记的兔抗牛I g G的最佳稀释度㊂1.5.3临界值确定选取前期利用标准G蛋白抗体E L I S A确定的28份阴性牛血清和32份自然感染B E F V的阳性牛血清进行检测,利用公式S/P=(样品O D450n m-平均阴性对照O D450n m)/ (平均阳性对照O D450n m-平均阴性对照O D450n m)计算S/P值,应用M e d C a l c v20.0.10进行交互式点图分析,确定c u t-o f f值㊂1.5.4敏感性试验利用建立的间接E L I S A,将阳性血清按照1ʒ5㊁1ʒ10㊁1ʒ20㊁1ʒ40㊁1ʒ80㊁1ʒ160㊁1ʒ320稀释,测定其O D450n m,同时设定阴性对照,计算不同稀释度血清的S/P值㊂1.5.5特异性试验利用建立的E L I S A方法,分别对B V D-I B R双价疫苗免疫牛血清㊁F M D V O 型㊁A型㊁B E F V感染牛血清进行检测,重复测定3次,确定方法的特异性㊂1.5.6重复性试验分别在同一批包被的酶标板进行5次检测(批内)和5个不同批次制备的酶标板对6份待检血清进行检测,计算变异系数评价E L I S A方法的批内㊁批间重复性㊂1.6临床样本检测利用建立的间接E L I S A方法检测来源于江苏某奶牛场B E F灭活疫苗免疫牛血清95份㊁云南某奶牛场B E F灭活疫苗免疫牛血清146份并统计检测结果㊂2结果2.1G N S表达载体的构建以H N1/2012株c D N A为模板进行P C R扩增,获得了1605b p的G N S目的基因片段(图1A),与B a m HⅠ㊁H i n dⅢ双酶切处理的p P R O E X H T b载体进行重组,菌落P C R鉴定结果表明10个克隆均为阳性(图1B),测序表明重组质粒p P R O-G N S具有正确的读码框㊂2.2重组蛋白的表达纯化与W e s t e r n b l o t鉴定将重组质粒p P R O-G N S转化至R o s e t t a(D E3)感受态细胞,利用终浓度1.0mm o l㊃L-1的I P T G诱导,S D S-P A G E显示目的蛋白相对分子质量约为73 k u,主要存在于超声沉淀中,纯化获得较为单一的H i s-G N S重组蛋白(图2)㊂W e s t e r n b l o t结果显示,重组蛋白H i s-G N S可与B E F V感染血清发生特异性反应(图3A),而不与B E F疫苗免疫血清反应(图3B)㊂2.3E L I S A方法的建立2.3.1抗原包被浓度和血清最佳稀释度的确定方阵滴定结果表明,在H i s-G N S蛋白包被浓度为0.5μg㊃m L-1,血清稀释度为1ʒ20条件下,P/ N值最大㊂因此,确定0.5μg㊃m L-1的抗原包被浓度和1ʒ20的血清稀释度为最佳反应条件㊂223410期何辰香等:基于G N S 蛋白的牛流行热病毒感染与免疫鉴别诊断E L I S A方法的建立M 1.D L 5000D N A 相对分子质量标准;M 2.D L 2000D N A 相对分子质量标准;1.G N S 扩增产物;2~11.菌落P C R 扩增产物M 1.D L 5000D N A m a r k e r ;M 2.D L 2000D N A m a r k e r ;1.A m pl i f i c a t i o n p r o d u c t o f G N S ;2-11.P C R p r o d u c t o f i n d i v i d u a l c o l o n y 图1 G N S 扩增(A )及重组原核表达质粒鉴定(B )F i g .1 T h e a m p l i f i c a t i o n o f G N S (A )a n d i d e n t i f i c a t i o n o f r e c o m b i n a n t p r o k a r y o t i c e x p r e s s i o n p l a s m i d s (B)M.蛋白相对分子质量标准;1.未诱导p P R O -G N S 重组菌;2~4.4~6h 诱导的p P R O -G N S 重组菌;5.诱导p P R O -G N S 重组菌裂解上清;6.诱导p P R O -G N S 重组菌裂解沉淀;7.纯化的H i s -G N S 蛋白M.P r o t e i n m o l e c u l a r w e i gh t m a r k e r ;1.U n i n d u c e d p P R O -G N S r e c o m b i n a n t b a c t e r i a ;2-4.4-6h i n d u c e d p P R O -G N S r e -c o m b i n a n t b a c t e r i a ;5.S u pe r n a t a n tf r a c t i o n o f i n d u c e d pP R O -G N S r e c o m b i n a n t b a c t e r i a ;6.S e d i m e n t f r a c t i o n o f i n -d u c e d p P R O -G N S r e c o m b i n a n t b a c t e r i a ;7.P u r i f i e d H i s -G N S p r o t e i n图2 H i s -G N S 重组蛋白的SD S -P A GE 分析F i g .2 S D S -P AG E a n a l y s i s o f r e c o m b i n a n tH i s -G N S pr o t e i n 2.3.2 辣根过氧化物酶标记的兔抗牛I g G 最佳稀释倍数确定 利用1ʒ2000㊁1ʒ4000㊁1ʒ8000㊁1ʒ16000稀释的辣根过氧化物酶标记的兔抗牛I g G 酶标二抗进行检测,结果在稀释度为1ʒ4000时,P /N 值最大,因此确定辣根过氧化物酶标记的兔抗牛I gG 的最佳稀释度为1ʒ4000㊂2.3.3 临界值的确定 检测背景清晰的28份阴性牛血清和32份阳性牛血清并根据O D 450n m 值计算S /P 值,结果表明,当敏感性为97%㊁特异性为100%时,其最优c u t -o f f 值为0.2069,因此确定E L I S A 的临界值为S /P 值0.2069(图4)㊂M.蛋白相对分子质量标准;1.纯化的H i s -G N S 蛋白与B E -F V 感染牛血清作用;2.未诱导p P R O -G N S 重组菌与B E F V感染牛血清作用;3.纯化的H i s -G N S 蛋白与免疫牛牛血清作用;4.未诱导p P R O -G N S 重组菌与免疫牛血清作用M.P r o t e i n m o l e c u l a r w e i gh t m a r k e r ;1.P u r i f i e d H i s -G N S pr o t e i n p r o b e d w i t h s e r u m f r o m B E F V i n f e c t e d c a t t l e ;2.U n i n d u c e d p P R O -G N S r e c o m b i n a n t b a c t e r i a p r o b e d w i t h s e r -u m f r o m B E F V i n f e c t e d c a t t l e ;3.P u r i f i e d H i s -G N S p r o t e i npr o b e d w i t h s e r u m f r o m v a c c i n a t e d c a t t l e ;4.U n i n d u c e d p P R O -G N S r e c o m b i n a n t b a c t e r i a p r o b e d w i t h s e r u m f r o m v a c c i n a t e d c a t t l e a n d B E F V i n f e c t e d c a t t l e 图3 W e s t e r n b l o t 分析H i s -G N S 组蛋白与B E F V 感染血清(A )以及免疫牛血清(B )的反应原性F i g .3 W e s t e r n b l o t a n a l y s i s t h e r e a c t i v i t y o f H i s -G N S re c o m -b i n a n t p r o t e i n w i t h s e r u mf r o m B E F V i n f e c t e d c a t t l e (A )a n d v a c c i n a t e d c a t t l e (B )2.3.4 敏感性试验 利用建立的间接E L I S A 对阳性感染血清进行1ʒ5㊁1ʒ10㊁1ʒ20㊁1ʒ40㊁1ʒ80㊁1ʒ160㊁1ʒ320倍比稀释测定,结果表明当血清稀释度为1ʒ160时,仍判为阳性(S /P >0.2069),表明建3234畜牧兽医学报54卷立的E L I S A具有较好的敏感性㊂2.3.5特异性试验利用建立的E L I S A方法,分别对B V D-I B R双价疫苗免疫牛血清㊁F M D V O 型㊁A型㊁B E F V感染血清进行检测,结果显示只有B E F V感染牛血清检测结果为阳性,其余全为阴性(图5),表明建立的E L I S A方法具有较好的特异性㊂图4临界值判定F i g.4D e t e r m i n a t i o n o f c u t-o f f v a l ue图5特异性试验结果F i g.5S p e c i f i c e x p e r i m e n t a l r e s u l t s2.3.6重复性试验统计结果显示,建立的E L I S A批内变异系数为6.59%~9.90%,批间变异系数为4.83%~9.93%,均小于10%,表明所建立的间接E L I S A方法具有较好的重复性㊂2.4临床样本检测利用建立的间接E L I S A方法检测来源于江苏某奶牛场B E F灭活疫苗免疫牛血清95份㊁云南某奶牛场B E F灭活疫苗免疫牛血清146份并统计检测结果(图6),从江苏奶牛场检出3份阳性血清,阳性率为3.15%;从云南奶牛场检出5份阳性血清,阳性率为3.42%㊂图6临床样本检测结果F i g.6T e s t r e s u l t s o f c l i n i c a l s a m p l e s3讨论牛流行热至今已有150余年的历史,该病主要感染奶牛和黄牛,其特点是发病率高死亡率低,但近年来在我国河南省和台湾省以及国外的土耳其等地均报道了该病在牛的较高病死率,引起较为广泛关注[11-14]㊂利用灭活疫苗免疫是牛流行热防控必不可少的重要措施,但现有抗体诊断方法无法区别牛自然感染B E F V或B E F疫苗免疫产生的抗体,因此感染与免疫鉴别诊断方法的建立成为牛流行热防控中亟待解决的问题㊂作者在前期证实G N S截短体的反应原性的基础上,进一步表达纯化获得了G N S全长蛋白并建立了E L I S A方法㊂作者发现G N S全长蛋白只与B E-F V感染牛血清反应而不与疫苗免疫牛血清反应,表明灭活疫苗中不含G N S蛋白或含量很低不足以在免疫牛产生抗体,且本研究进一步证实G N S与牛常见病毒F M D V㊁B V D V㊁I B R V抗体均不存在交叉反应,特异性良好,是一种理想的鉴别诊断靶标㊂与作者前期基于G N S截短重组蛋白建立的E L I S A方法[9]相比,本研究发现利用G N S全长重组蛋白建立E L I S A,其抗原最佳包被浓度(0.5μg㊃m L-1)和待检血清浓度(1ʒ20)低于G N S a a11-222截短重组蛋白包被浓度(1.0μg㊃m L-1)和待检血清浓度(1ʒ10),可能在于全长G N S重组蛋白较截短重组蛋白含有较多的抗原表位,更适用于抗体诊断试剂盒制备㊂通过阳性血清系列稀释,血清稀释度为1ʒ160仍可检出,本研究建立的E L I S A与作者前期建立的基于G 蛋白的E L I S A方法具有类似的敏感性[15],且批内423410期何辰香等:基于G N S蛋白的牛流行热病毒感染与免疫鉴别诊断E L I S A方法的建立和批间C V均小于10%,表明该D I V A E L I S A具有良好的敏感性和重复性㊂由于现有血清学诊断方法只能通过中和抗体判定牛的B E F疫苗接种史或自然感染史,但不能进行甄别㊂本研究在方法建立过程中,利用前期基于G蛋白抗体E L I S A方法筛选的健康牛血清和B E F V自然感染牛血清进行标定,确保了检测B E F V感染的准确率(结果 2.2.3 )㊂通过检测源于江苏某奶牛场B E F灭活疫苗免疫牛血清95份㊁云南某奶牛场B E F灭活疫苗免疫牛血清146份,结果从江苏和云南疫苗免疫群体检出B E F V感染率分别为3.15%和3.42%,与前期报道江苏省免疫牛的B E F发病率一致[16],但略低于云南省部分地区未免疫牛的B E F V感染率(4.93%~ 21.69%)[17],进一步表明疫苗免疫在阻断B E F V中起到至关重要的作用㊂4结论本研究利用原核表达系统成功表达纯化B E F V G N S全长蛋白,从包涵体中纯化复性获得只与B E-F V感染牛血清具有反应特异性的重组G N S蛋白,建立了B E F V感染与疫苗免疫鉴别诊断的间接E L I S A方法,具有良好的敏感性㊁特异性和重复性,适用于B E F V自然感染和疫苗免疫牛的鉴别诊断,为我国牛流行热诊断提供了新的技术储备㊂参考文献(R e f e r e n c e s):[1] WA L K E R P J.B o v i n e e p h e m e r a l f e v e r i n A u s t r a l i aa n d t h e w o r l d[J].C u r r T o p M i c r ob i o l I mm u n o l,2005,292:57-80.[2] WA L K E R P J,B Y R N E K A,C Y B I N S K I D H,e ta l.P r o t e i n s o fb o v i n e e p h e m e r a l f e v e r v i r u s[J].JG e n V i r o l,1991,72(1):67-74.[3] M C W I L L I AM S M,K O N G S UWA N K,C OW L E Y JA,e t a l.G e n o m e o r g a n i z a t i o n a n d t r a n s c r i p t i o ns t r a t e g y i n t h e c o m p l e x G N S-L i n t e r g e n i c r e g i o n o fb o v i n e e p h e m e r a l f e v e r r h a b d o v i r u s[J].J G e n V i r o l,1997,78(6):1309-1317.[4]J O U B E R T D A,B L A S D E L L K R,A U D S L E Y M D,e t a l.B o v i n e e p h e m e r a lf e v e r r h a b d o v i r u sα1p r o t e i n h a sv i r o p o r i n-l i k e p r o p e r t i e s a n d b i n d s i m p o r t i nβ1a n di m p o r t i n7[J].J V i r o l,2014,88(3):1591-1603.[5]J I A N G H H,H O U P L,H E H B,e t a l.C e l l a p o p t o s i sr e g u l a t e d b y i n t e r a c t i o n b e t w e e n v i r a l g e n e a l p h a3a n dh o s t h e t e r o g e n e o u s n u c l e a r r i b o n u c l e o p r o t e i n K f a c i l i t a t e sb o v i n e e p h e m e r a l f e v e r v i r u s r e p l ic a t i o n[J].V e tM i c r o b i o l,2020,240:108510.[6] Z A K R Z E W S K I H,C Y B I N S K I D H,WA L K E R P J.A b l o c k i n g E L I S A f o r t h e d e t e c t i o n o f s p e c i f i ca n t ib o d i e s t o b o v i n e e p h e m e r a l f e v e r v i r u s[J].JI mm u n o l M e t h o d s,1992,151(1-2):289-297.[7] L I Z,Z H E N G F Y,G A O S D,e t a l.L a r g e-s c a l es e r o l o g i c a l s u r v e y o f b o v i n e e p h e m e r a l f e v e r i n C h i n a[J].V e t M i c r o b i o l,2015,176(1-2):155-160.[8] Y A Z D A N I F,B A K H S H E S H M,E S M A E L I Z A D M,e t a l.E x p r e s s i o n of G1-e p i t o p e o f b o v i n e e p h e m e r a l f e v e rv i r u s i n E.c o l i:a n o v e l c a n d i d a t e t o d e v e l o p E L I S A k i t[J].V e t R e s F o r u m,2017,8(3):209-213. [9] H E C X,G A O S D,D U J Z,e t a l.D e v e l o p m e n t a n dv a l i d a t i o n o f a D I V A E L I S A f o r d i f f e r e n t i a t i n g B E F Vi n f e c t e d f r o m v a c c i n a t e d a n i m a l s[J].J V i r o lM e t h o d s,2022,310:114625.[10]高闪电,何辰香,田占成,等.一种牛流行热病毒蛋白复合物及在牛流行热病毒自然感染抗体检测中的应用:中国,202210635402.3[P].2022-08-05.G A O S D,H E C X,T I A N Z C,e t a l.B o v i n ee p h e m e r a lf e v e r v i r u s(B E F V)p r o t e i n c o m p l e x a n da p p l i c a t i o n i n B E F V n a t u r a l i n f e c t i o n a n t ib o d y d e t ec t i o nt h e r e o f:C N,202210635402.3[P].2022-08-05.(i nC h i n e s e)[11] W A L K E R P J,K L E M E N T E.E p i d e m i o l o g y a n d c o n t r o lo f b o v i n e e p h e m e r a l f e v e r[J/O L].V e t R e s,2015,46:124.[2023-08-21].h t t p s://v e t e r i n a r y r e s e a r c h.b i o m e d c e n t r a l.c o m/a r t i c l e s/10.1186/s13567-015-0262-4.[12]高闪电,王积栋,独军政,等.牛流行热病毒分离株HN1/2012的全基因组序列测定及演化分析[J].畜牧兽医学报,2018,49(10):2223-2231.G A O S D,WA N G J D,D U J Z,e t a l.T h e c o m p l e t eg e n o m e s e q u e n c e d e t e r m i n a t i o n a n d e v o l u t i o n a r ya n a l y s i s o fb o v i n e e p h e m e r a l f e v e r v i r u s s t r a i n HN1/2012[J].A c t a V e t e r i n a r i a n e t Z o o t e c h n i c a S i n i c a,2018,49(10):2223-2231.(i n C h i n e s e) [13] T I N G L J,L E E M S,L E E S H,e t a l.R e l a t i o n s h i p so f b o v i n e e p h e m e r a l f e v e r e p i z o o t i c s t o p o p u l a t i o ni mm u n i t y a n d v i r u s v a r i a t i o n[J].V e t M i c r o b i o l,2014,173(3-4):241-248.[14] T O N B A K S,B E R B E R E,Y O R U K M D,e t a l.A l a r g e-s c a l e o u t b r e a k o f b o v i n e e p h e m e r a l f e v e r i n T u r k e y,2012[J].J V e t M e d S c i,2013,75(11):1511-1514.[15]殷宏,郑福英,刘志杰,等.牛流行热病毒间接E L I S A抗体检测试剂盒及其制备方法:中国,201410244271.1[P].2014-08-06.5234畜牧兽医学报54卷Y I N H,Z H E N G F Y,L I U Z J,e t a l.B o v i n e e p h e m-e r a lf e v e r v i r u s i n d i r e c t E L I S A k i t f o r a n t i b o d y d e t e c t i o na n d i t s p r e p a r a t i o n m e t h o d:C N,201410244271.1[P].2014-08-06.(i n C h i n e s e)[16]朱雁,王建辉,陈燕眉,等.淮海经济区牛流行热流行病学调查及其疫苗免疫效果试验[J].中国奶牛,2018(4):41-43.Z HU Y,WA N G J H,C H E N Y M,e t a l.E p i d e m i o l o g i c a l i n v e s t i g a t i o n o f b o v i n e e p i d e m i c f e v e ri n H u a i h a i E c o n o m i c Z o n e a n d i t s v a c c i n e i mm u n ee f f e c t t e s t[J].C h i n a D a i r y C a t t l e,2018(4):41-43.(i n C h i n e s e)[17]詹建举,何辉,朱来萍,等.云南省部分地区牛流行热血清学初步调查[J].上海畜牧兽医通讯,2019(4):25-27.Z HA N J J,H E H,Z HU L P,e t a l.P r e l i m i n a r ys e r o l o g i c a l i n v e s t i g a t i o n o f b o v i n e e p i d e m i c f e v e r i ns o m e a r e a s o f Y u n n a n p r o v i n c e[J].S h a n g h a iJ o u r n a l o f A n i m a l H u s b a n d r y a n d V e t e r i n a r yM e d i c i n e,2019(4):25-27.(i n C h i n e s e)(编辑白永平)6234。

感受态细胞制备原理
感受态细胞（Acceptablecell）又称转基因细胞、外源DNA转化细胞，是指外源基因与宿主基因组结合并在宿主细胞内稳定表达的细胞。

根据其来源的不同，可分为外源基因在大肠杆菌中表达的感受态细胞和质粒在酵母中表达的感受态细胞。

外源DNA进入细胞后，首先与细胞核内的DNA聚合酶结合，使DNA聚合酶分子分解成单链，然后由DNA聚合酶催化单链复制形成双链DNA分子。

在这一过程中，DNA聚合酶活性与病毒颗粒的基因片段大小相关。

当感受态细胞将外源DNA 导入到受体细胞后，它们与受体细胞内的DNA聚合酶和DNA 聚合酶复合体结合，从而使载体上的目的基因片段得以复制和表达。

当质粒上的目的基因被整合到受体细胞基因组中时，目的基因被激活。

当感受态细胞与受体细胞融合后，被激活的目的基因便会在受体细胞中以单拷贝形式表达出来。

因此，感受态细胞对目的基因有较强的选择压力，在表达过程中会筛选出最具表达潜力的部分。

—— 1 —1 —。

大肠杆菌苹果酸脱氢酶的原核表达、纯化与酶活力测定摘要：苹果酸脱氢酶(malate dehydrogenase, MDH)普遍存在动物、植物、细菌等多种生物体中，负责催化苹果酸与草酰乙酸之间的可逆转换，在细胞的多种生理活动中发挥重要作用，如C4循环、光合作用、TCA循环。

本实验从实验室保存的DH5α重组菌中提取pET28b-mdh重组质粒，并对其进行双酶切鉴定。

将重组质粒pET28b-mdh转化入Rosetta(DE3)感受态细胞中，通过卡那霉素和氯霉素抗性进行筛选。

挑取单菌落培养至菌体浓度OD600≈0.6时，用0.1 mM的IPTG诱导表达MDH蛋白，然后收集、纯化MDH蛋白并分析其酶活力。

结果表明，MDH在大肠杆菌中获得了高量表达，MDH还原草酰乙酸的活力为194.75 U/mg。

关键词：苹果酸脱氢酶；原核表达；活力测定Expression and Purification of Malate Dehydrogenase from Escherichia coli and its Activity DeterminationAbstract: Malate Dehydrogenase is ubiquitous in animals, plants, and bacterias, which catalyzed the interconversion of oxaloacetate and malate linked to the oxidation/reduction of dinucleotide coenzymes, which play a key role in many metabolic pathways such as TCA cycle, photosynthesis, C4 cycle and so on. In this study, we extracted pET28b-mdh recombinant plasmid from DH5α, which was preserved in our laboratory, and examined the recombinant plasmid correctness through double enzymes digestion reaction. Then we transformed the recombinant plasmid into E.coli Rosetta(DE3) and screened the positive recombinant strain thought kalamycin and chloromycetin resistance. And then we cultured the individual colony until OD600≈0.6, then added IPTG to the finally concentration 0.1mM to induce the expression of MDH. We collected and purified the MDH and then analyzed MDH enzyme activity. The result showed that MDH can be highly induced to express in E.coli and its activity to reduce oxaloacetate is 194.75 U/mg. Keywords: malate dehydrogenase; prokaryotic expression; activity assay1 前言1.1苹果酸脱氢酶苹果酸脱氢酶(malate dehydrogenase, MDH; EC 1.1.1.37)普遍存在于动物、植物和细菌等各种生物体中，是生物体糖代谢的关键酶之一。

感受态细胞制备制备感受态常用的方法是电击法和CaCl2制备法，以下介绍CaCl2制备法：1、可以从-80℃冰柜中，取出一支冻存菌株，于事先照过紫外的超净台中，用无菌的接种环轻轻蘸取菌种后，在无抗平板（由于Rocetta含有氯霉素抗性，需要涂布在氯霉素抗性的平板，后面的都是如此）上划线，并将菌种迅速放回-80℃保存，在划线板上做好相应标记，于37℃培养过夜。

2、从37℃培养过夜的新鲜平板上挑取一个单克隆，接种于2mlEP管中，37℃，220rpm震荡培养约6个小时至对数生长中后期；将该菌悬液以1:100的比例接种于50mlLB液体培养基（2瓶）中,37℃振荡培养2.5小时至OD600=0.5。

注意：接种比例不得大于1:10。

3、在无菌条件下将细菌转移到一个无菌、预冷的离心管（50ml）中，在冰上放置5~10min；注意：划板、接种为了防止意外发生最好多划一块平板和多接一根试管，划板、接种、转接均要严格按照无菌操作。

4、4℃5000g离心5分钟。

用预冷的去离子水洗涤沉淀，4℃5000g离心5分钟；Note：此步主要是为了洗去培养基中的盐等5、沉淀加入2ml预冷的0.05mol/LCaCl2-15%甘油混合溶液，轻吹散，冰浴5分钟，4℃5000g离心5分钟；6、沉淀加入2ml预冷的0.05mol/LCaCl2-15%甘油混合溶液，轻吹散，即成为感受态细胞悬液。

分装成50~100μl的小份，贮存于-70℃可保存半年。

含15%甘油的0.05mol/LCaCl2制备方法:称取0.28gCaCl2(无水,分析纯),溶于50ml重蒸水中,加入15ml甘油,定容至100ml,高压灭菌。

感受态细胞的特征感受态：通过特殊处理使细胞处于能够吸收外源DNA的状态。

感受态细胞的特征：（1）细胞表面暴露出一些可接受外来DNA的位点（以溶菌酶处理，可促使受体细胞的接受位点充分暴露）。

（2）细胞膜通透性增加（用钙离子处理，可使膜通透性增加，使DNA直接穿过质膜进入细胞）。

Stable化学感受态细胞Stable Chemically Competent CellStable感受态细胞基因型F' proA+B+ lacI q∆(lacZ)M15 zzf::Tn10 (Tet R) ∆(ara-leu) 7697 araD139 fhuA ∆lacX74 galK16 galE15 e14- Φ80dlacZ∆M15 recA1 relA1 endA1 nupG rpsL (Str R) rph spoT1 ∆(mrr-hsdRMS -mcrBC)Stable感受态细胞说明：Stable菌株是NEB公司开发的高转化效率菌株，是逆转录病毒/慢病毒载体系统推荐使用的菌株，具有与Stbl2，Stbl3完全不同的基因型，但是表现出比Stbl2，Stbl3更优异的性能，特别适合慢病毒或具有末端重复序列DNA片段的克隆。

基因组含有重组酶recA1 rel A1突变，可有效抑制长片段末端重复区的重组，降低错误重组的概率；同时含有核酸酶endA1突变，避免了提取质粒过程中核酸酶的污染，大大提高了高纯度病毒质粒的产量和质量。

lacZΔM15的存在使Stable可用于蓝、白斑筛选，此菌株具有四环素和链霉素抗性，Stable 感受态细胞经特殊工艺制作，pUC19检测转化效率>5×108cfu/μg DNA。

Stable感受态细胞优点及应用:1.与Stbl3相比，基因组含有endA突变，提高了病毒质粒的产量和纯度。

2.比Stbl3生长速度快，倍增时间是Stbl3的1.5倍。

3.基因组中含有fhuA突变，赋予其对噬菌体T1的抗性。

4.具有较高的转化效率，pUC19检测转化效率>5×108cfu/μg DNA。

5.基因组中含有lacZΔM15，可用于蓝白斑筛选实验。

6.特别适合于不稳定DNA片段的克隆，及逆转录病毒/慢病毒载体的构建和扩繁。

Stable感受态细胞操作方法:1. Stable感受态细胞从-80℃拿出，迅速插入冰中，6分钟后待菌块融化，加入目的DNA（质粒或连接产物）并用手拨打EP管底轻轻混匀(避免用枪吸打)，冰中静置25分钟。

一、实验步骤1. 重组蛋白表达与纯化1）将将编码蛋白A的GST标签重组质粒转化到BL21或者Rosetta DE3感受态细胞中。

2）向高压灭菌的锥形瓶中倒入150 ml LB培养基，按照1:1000加入氨苄青霉素储液（工作浓度为50 μg/ml）。

用高压灭菌过的10 μl枪头挑取平板上的单克隆菌落，37℃条件下以200 rpm转速振荡培养约6 h，使OD600为0.6-0.8。

3）每管加入按照1:200-1:500加入IPTG（工作浓度为0.2-0.5 mmol/L），20-25℃条件下200 rpm继续振荡培养过夜。

4）4℃条件下4,000 rpm离心15 min，收集细菌沉淀。

a)尽量倒净上清，每管加入10 ml PBS缓冲液重悬细菌，置于冰上超声。

5）4℃，12,000 rpm离心30 min，留取上清并分装后（混匀）于-80℃保存，即为纯化的原核融合蛋白A。

2. GST-pull down实验1）将编码B蛋白的重组质粒转染入HEK293细胞中，48 h后提取细胞总蛋白。

2）留取50 µl蛋白加入2×蛋白样品缓冲液，混匀后100℃金属浴加热10 min使蛋白变性，室温12,000 rpm离心15 s，-20℃保存，作为Input。

3）用预冷PBS缓冲液洗涤Glutathione Sepharose 4B珠子，然后然后按照1:1的比例向Glutathione Sepharose 4B珠子中加入PBS缓冲液并混合均匀。

吸取珠子时应减掉枪尖部分，避免破坏珠子。

4）取适量纯化的原核融合蛋白A（SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色调整各个融合蛋白的蛋白量，如果有验证多个蛋白，比如截短蛋白，保证加到另一个蛋白里的蛋白量一样），加入30-40 µl预处理过的Glutathione Sepharose 4B珠子，4℃颠倒混匀4-6 h。

5）于4℃条件下12,000 rpm离心15 s，弃上清。

荧光共振能量转移(FRET)体系的构建及其验证钱月娇;冯钰斌;钱学文;朱传君;李鸽;卢多;陈飞虎【摘要】目的构建携带FRET体系( YFP-CFP对)的一组原核表达工程质粒,在大肠杆菌( E. coli)中高效表达后,验证该体系FRET信号作为细胞内监测蛋白相互作用指标的可行性.方法分别构建 N端、C端以及两端分别编码 YFP和(或) CFP 的 6 个原核表达工程质粒: pNYFP、 pCYFP、pNCFP、 pCCFP、 pYFP-CFP、 pCFP-YFP.设计 YFP-CFP 和CFP-YFP作为阳性对照,而等量的YFP与CFP混合的体系(YFP + CFP)作为阴性对照.将过表达的工程蛋白通过镍柱、分子筛层析柱进行初步纯化后使用酶标仪检测相同摩尔浓度纯化蛋白的FRET信号.在此基础上,进一步用酶标仪检测表达工程蛋白的菌液中的FRET信号.结果通过测序验证,成功构建了6个原核表达的工程质粒.酶标仪检测的结果显示在体外纯化蛋白条件和菌液条件下均可产生明确的FRET信号.结论成功构建了FRET体系的原核表达工程质粒,不仅验证了蛋白条件下的可行性,而且验证了菌液条件下的可行性,为在活细胞条件下对蛋白-蛋白相互作用进行实时的动态研究,提供一个非常便利的实验方法.【期刊名称】《安徽医科大学学报》【年(卷),期】2018(053)012【总页数】7页(P1821-1827)【关键词】荧光共振能量转移;蛋白-蛋白相互作用;活细胞;原核表达;工程质粒;蛋白纯化【作者】钱月娇;冯钰斌;钱学文;朱传君;李鸽;卢多;陈飞虎【作者单位】安徽医科大学药学院,合肥 230032;安徽医科大学药学院,合肥230032;安徽医科大学药学院,合肥 230032;安徽医科大学药学院,合肥 230032;安徽医科大学药学院,合肥 230032;中国医学科学院药物研究所,北京协和医学院,北京100032;安徽医科大学药学院,合肥 230032【正文语种】中文【中图分类】R966荧光能量共振转移(fluorescence resonance energy transfer，FRET)，是较早发展起来的一门技术[1]。

收稿日期:2010-04-07;修回日期:2010-05-16基金项目:国家自然科学基金(30500300;30870062);教育部新世纪优秀人才支持计划(NCET -06-0558);教育部回国留学人员启动基金;芜湖市自然科学基金重点项目(2009-4-7);安徽师范大学优秀创新团队建设计划资助作者简介:王程(1985-),女,硕士研究生,专业方向微生物分子生物学研究,E-m ai:l ellislinn a w@126.co m;通讯作者:朱国萍,教授,博士生导师,主要从事蛋白质功能进化与分子生物学研究,E-m ai:l gpz 1996@yahoo .com 。

do i 10.3969/j issn 2095-1736.2011 02 039大肠杆菌苹果酸合酶A 的酶学和生理功能研究王 程1,王 敖1,赵旵军2,朱国萍1(1.安徽师范大学生命科学学院,芜湖241000;2.芜湖市第二人民医院检验科,芜湖241000)摘要:苹果酸合酶是乙醛酸循环的关键酶之一。

E.coli 中苹果酸合酶A (m alate syn t hase A,M SA )由ace B 基因编码。

根据E.co li 基因组序列设计引物,利用PCR 技术扩增ace B 基因,并将其克隆入pET -29b (+),构建了重组表达质粒pET -M S A 。

经IPTG 诱导,M SA 在E.coli R ose tta (DE3)中获得高效表达。

纯化的M SA 蛋白的分子量大小约为60kDa ,最适反应p H 值和最适温度分别是p H 值8 0、30 。

纯化的蛋白质在M g 2+存在时才能发挥最大的活性,其对乙酰辅酶A 的K m 和V ma x 分别是8 07 M 和3 6 M /m i n 。

此外构建了M S A 和苹果酸合酶G (M S G )基因敲除菌株M G:: ace B 和MG:: ace B glcB 。

研究发现缺少M S A 的E.coli 突变菌株在乙酸中的生长速率要比野生型菌株慢很多,表明M S A 对大肠杆菌在乙酸中的生长起着重要作用。

OverExpress C43(DE3)化学表达感受态细胞OverExpress C43(DE3) Chemically Competent CellOVEREXPRESS C43(DE3)感受态细胞基因型：F–ompT hsdSB (rB- mB-) gal dcm (DE3)OVEREXPRESS C43(DE3)感受态细胞说明：OverExpress C43(DE3)、OverExpress C41(DE3)两个菌株均起源于BL21(DE3)，其优点是可以高效表达毒性蛋白或疏水性蛋白。

OverExpress C41(DE3)跟BL21(DE3)的区别在于其基因组含有至少一个未知突变，这个未知突变使其获得了高效表达毒性蛋白(1-5)的能力，此突变位点参与大肠杆菌表达毒性蛋白时的细胞死亡途径；OverExpress C43(DE3)来源于OverExpress C41(DE3)，是通过筛选OverExpress C41(DE3)对另一个不同毒性蛋白的抗性菌株获得。

OverExpress C43(DE3)菌株具有比OverExpress C41(DE3)更强的表达毒性蛋白和疏水性蛋白的能力，所以说OverExpress C43(DE3) 菌株与BL21(DE3)相比拥有至少两个未知突变，正是这两个未知突变使其获得了更广泛的表达毒性蛋白或疏水性蛋白的能力。

此菌株含有DE3区，可同时表达T7 RNA聚合酶和大肠杆菌RNA聚合酶，可用于pET系列，pGEX，pMAL等质粒的蛋白表达。

OverExpress C43(DE3)感受态细胞由特殊工艺制作，pUC19质粒检测转化效率可达5×108 cfu/μg DNA。

OVEREXPRESS C43(DE3)感受态细胞操作方法：1. OverExpress C43(DE3)感受态细胞从-80℃拿出，迅速插入冰中，5分钟后待菌块融化，加入目的DNA（质粒或连接产物）并用手拨打EP管底轻轻混匀(避免用枪吸打)，冰中静置25分钟。