超声微泡造影剂靶向治疗现状及研究进展王志会钱林学1968年Gramiak 首次报道了可增强显影的小气泡，即超声微泡造影剂（UCA），它的出现开创了无创超声诊断和治疗的新领域。
随着对其研究的不断深入，人们发现超声微泡造影剂不仅是一种良好的超声显像对比剂，而且是一种重要的药物递送载体[1]，对超声微泡造影剂携带基因或药物靶向治疗在医学领域的研究日益广泛。
超声微泡造影剂靶向治疗包括超声介导载药微泡的治疗及超声介导靶向载药微泡的治疗。
本文主要就靶向载药微泡的生物学效应、制备及其介导的靶向治疗现状及进展做一总结。
一、靶向载药微泡及其生物学效应超声微泡造影剂是内含气体的小球，以磷脂、白蛋白、糖类、非离子表面活性剂或可生物降解的高分子多聚物等物质为壳膜[2]。
目前研究的超声微泡造影剂的直径1～8μm，它能在血管腔中保持相对稳定并可以顺利通过肺循环[3]，实现全身器官组织、病变回声增强从而提高组织显影的清晰度[4,5]，但它作为一种药物递送载体，其特异性不强，对于病变组织没有亲和力，为此人们开始研究具有特异性的靶向载药微泡及其介导的靶向治疗。
靶向超声造影剂是将特异性抗体或配体连接到声学造影剂表面，依靠抗原-抗体或配体-受体之间的特异性结合，通过血液循环积聚到特异的靶器官或靶组织，从而使器官或组织在超声影像中得到特异性的增强或局部靶向治疗作用[6]。
与普通微泡相比，靶向载药微泡能够从分子水平识别并结合于病变部位，从而实现了微泡与病变部位的特异性结合，同时减轻基因或药物对正常组织的损害[7]，为微泡携带药物或基因对病变部位进行靶向治疗提供了前提。
超声微泡的生物学特性使其成为一种理想的基因或药物递送载体。
将少量携带基因或药物的微泡经外周静脉或局部注射后,微泡流经靶向部位时进行超声,即得到超声影像[8]。
当超声影像图证明超声准确定位于靶向部位时,增加声压使之达到一定强度,即可使微泡破裂产生空化效应[9]，空化效应是指存在于液态物质中的微小空泡(空化核)在高强度的超声的作用下被激发，空化核急剧膨胀和收缩直至爆裂，此过程中空化核吸收了大量的声能,并将能量集中释放在极小的区域，核内基金项目：北京市教育委员会科技计划面上项目（11020126）作者单位：10005，北京，首都医科大学附属北京友谊医院超声科通讯作者：钱林学，Email：qianlinxue2002@局部温度和压力急剧升高，随之产生强大冲击波、内切力、高速微束射流及自由基等二次效应，不仅使微血管破裂 ,血管内皮细胞收缩，细胞间隙增宽，微血管壁的通透性增大，还可使细胞膜的完整性遭到破坏，产生暂时性、可逆性的小孔，增加了细胞膜的通透性[2,10]，均能够增强载微泡对基因或药物的转移。
二、靶向载药微泡的制备1．制备超声微泡的材料和方法构成超声微泡的成分有气体核心及包封气体的壳膜材料。
第一代微泡造影剂(如Albunex®)其内充满了空气，由于空气血液溶解度高以及蛋白质外壳很薄仅10 -15nm,空气扩散速度很快，这些微泡经静脉注入血管后几秒钟之内消失[11]。
第二代及第三代超声造影剂则采用大分子的惰性气体全氟化碳或六氟化硫，它们的弥散系数低、血液溶解度低，这将有效延长微泡在血液循环中的停留时间，微泡外壳的主要成分有蛋白质（白蛋白[12]）、脂质类、表面活性剂[13]或生物相容性较好的高分子聚合物[14]，膜厚2-500nm，微泡稳定性高，避免了气体损失、扩散、溶解及微泡聚集，使得微泡的粒径缩小并趋于一致[15]。
外壳的成分不仅决定了微泡的稳定性，还决定了微泡逃逸网状内皮系统的识别和清除能力以及在超声场中抵抗破裂的能力。
高分子多聚物抗压性、稳定性高、生物相容性好，克服了脂质微泡的不稳定性和蛋白微泡的免疫原性，氟碳气体分子量较大、溶解度和弥散度较低，因此采用高分子多聚物作为壳膜材料内含氟烷气体制备的微泡具有直径小、粒径分布窄、半衰期长等优点，是近年来超声造影剂的研究热点[16]。
目前国内外常采用超声空化法、冷冻干燥法、喷墨打印法、中和法、机械匀化法、界面聚合法、薄膜-水化法、吸附法、乳化法等方法制超声微泡。
Cui[17]等用双乳化-溶剂蒸发法制备了一种多孔的、中空的、可吸收的PLGA微泡，平均直径为1.8um，可以安全到达狗模型的心脏中并可增强显影。
Marcel R. Böhmer[18]等用喷墨打印技术制成粒径分布狭窄，高分子多聚物外壳，平均直径为5um的微泡。
2．基因或药物与超声微泡造影剂的连接方式微泡与药物或基因的结合方法如图1所示: A药物直接黏附在微泡的表面B药物镶嵌在微泡外壳膜中间，可增加微泡外壳的稳定性; C某些药物或基因以非共价键结合在微泡表面; D疏水性药物可以混合在一层油脂层内，形成一层薄膜包绕在微泡内，其外包被着一层稳定的膜，在这种结合方式下可连接抗体用于靶向释放药物;E药物和气体包被在微泡的内部，靶向配体结合在微泡外壳膜的表面。
本图所示的微泡外壳膜的稳定材料是脂质，但也可以是高分子聚合物。
正如图1所示有多种不同的方式可以将药物连于微泡上。
这些方法的优点在于，空化效应产生时，微泡破裂所产生的一系列反应会促使微泡释放基因或药物，推动药物或基因从血管进入或穿过血管壁，到达组织。
3．超声微泡造影剂具有靶向性的方法为使携基因或药物的超声微泡造影剂具有靶向性，方法有[20]: ①利用微泡本身外壳的化学和电荷特性使之滞留于病灶部位; ②利用分子桥作用,将疾病相关的单克隆抗体与微泡结合,从而间接使微泡与病灶部位表达的相关抗原结合; ③在微泡表面连接特异性抗体或配体,使之结合到病灶部位细胞表达的特异性抗原或受体上,达到靶向性显影和治疗的目的。
目前研究较为广泛的是将特异性好、活性高的配体或抗体牢固连接到微泡表面，这也是制备靶向微泡的关键技术所在。
连接方法有[21]：①直接连接法：在不添加任何外在化学成分的情况下通过其自身离子键、物理吸附等方法将靶向配体或靶向配体混合物直接连接到微泡表面，在制备完成以后，根据微囊材料的化学组成和配体的性质调节溶液的p H值、离子强度、温度、时间的选择等将靶向配体吸附到微囊表面，得到靶向载药微泡。
②偶联剂连接法：偶联剂两端带有不同性质基团的，一端可与微泡特定基团反应，另一端可与配体表面的吸附水反应，形成粘合牢固的靶向载药微泡，偶联剂本身不属于微泡的构成成分。
③桥连剂结合方法：首先引入必要的化学基团对桥连剂进行结构修饰形成功能基团，微泡形成后激活功能基团，然后与配体结合，桥连剂本身属于微泡的构成成分。
④非吸附性非共价键结合的免疫化学固定：它是通过一种非共价非吸附性固定抗原抗体（如生物素-亲和素复合物）的方法将靶向配体连接于微泡表面，使微泡富集于病灶，在外力作用下选择性局部释放。
Borden MA[22], Klibanov AL[23].等通过生物素-亲和素(biotin-avidin system)已成功制备了具有靶向作用的生物素脂膜微泡，这样会有更多的“配体-受体对”形成，使微泡和靶器官之间结合得更加紧密，进一步扩大了靶向微泡制剂的研制领域。
4．靶向超声微泡造影剂的特点合格的靶向超声微泡造影剂应达到以下要求[24]：①微泡在流经靶向部位时，能特异性地与其结合并聚集于该部位;②有足够稳定的时间使微泡在靶向部位循环和积累;③在超声检查过程中结合到靶向部位的微泡需具有足够的稳定性;④微泡与靶向部位的结合应牢固,流动血液不能使两者分开;⑤靶向部位显像的造影剂用量应少,最好是毫克级或更少;⑥应迅速达到较高的靶向显影对比率；⑦在检查或治疗过程结束后微泡由机体逐步处理、清除。
靶向超声微泡造影剂在朝着这些目标一步步迈进，达到这些完美的标准后，它将成为超声诊断和治疗领域不可或缺的重要工具。
三、超声微泡造影剂靶向治疗的现状及进展超声微泡介导的靶向治疗有许多优点：低免疫原性、低毒性、低侵袭性、无创、器官组织特异性、可重复应用等诸多优点，已成为各种疾病治疗手段中具有潜力的新技术。
目前对超声造影剂的靶向治疗的研究主要集中于以下几方面，如：肿瘤、血管栓塞性疾病、心血管疾病等。
1．超声微泡造影剂靶向治疗肿瘤的研究将携有基因或细胞毒性药物的靶向微泡从外周静脉或局部注射后，当微泡特异性结合到肿瘤部位时，进行超声辐照破坏微泡，使基因或药物局部释放，达到提高局部药物或基因的浓度、保护药物避免被肝脏摄取、延缓药物的释放、减少给药次数、减小给药剂量、增加药物疗效[25]和减轻全身的毒副反应的目的，而且还可以通过改变超声仪器各个参数的设置，控制药物释放速度，进行实时监控，减少药物或基因破坏，节约用量。
靶向载药微泡携带基因或化疗药物可以达到靶向结合肿瘤并有效治疗肿瘤的目的，该方法是目前肿瘤治疗的研究热点。
最近，Xing W[26]等用1,2-二硬脂酸-3磷酸酰乙醇胺-N-聚乙烯乙二醇-叶酸嵌入微泡脂质膜中制备了具有叶酸配体的靶向微泡（MB(F)），通过共聚焦显微镜观察了携叶酸配体的靶向微泡与人卵巢癌SKOV3细胞的结合，人卵巢癌SKOV3细胞过度表达叶酸受体，结果显示携叶酸配体靶向微泡和人卵巢癌SKOV3细胞结合率明显増高，这充分说明了具有叶酸配体的靶向微泡与过渡表达叶酸受体的人卵巢癌细胞SKOV3之间有很高的亲和力，这为超声微泡靶向治疗叶酸受体阳性的肿瘤提供了潜在的可能性。
Ellegala 等[27]将抗 alpha(V)beta3抗体连接到脂质微泡表面，在大鼠脑胶质瘤模型中注入此种靶向微泡，在共聚焦激光显微镜下观察，结果发现靶向微泡聚集在整联蛋白表达v最多的地方——肿瘤周边，并且与肿瘤的微血管密度有相关性，而非靶向微泡造影剂就无此现象。
Kang J[28]等用机械振荡法制备了载多西紫杉醇脂质微泡，将其注入兔VX2肝肿瘤模型内，结果显示载多西紫杉醇微泡联合超声组抑瘤率和细胞凋亡指数最高，动物生存时间最长，增殖标记指数最低，基质蛋白金属酶2及其mRNA表达最低，Caspase 3mRNA表达最高。
这充分说明了载多西紫杉醇微泡联合超声靶向破坏技术能抑制兔VX2肝癌肿瘤，为肝癌化疗提供了一种新型的靶向治疗策略。
目前研制的超声微泡为微米级，无法透过血管壁进行肿瘤的真正靶向治疗，对此国外学者Rapoport N[29]、Gao Z[30]已研制出了一种新型的药物提送系统，即有效携载阿霉素的纳米气泡，经静脉注射到MDA-MB231乳腺癌异种移植瘤小鼠体内，载阿霉素的纳米气泡选择性的外渗到肿瘤间质并在此结合成微泡，此时阿霉素结合在微泡上，并可以在治疗超声辐照下释放出来，结果显示经超声介导载阿霉素纳米微泡治疗后，小鼠乳腺癌模型的肿瘤明显缩小。
还有学者Willmann JK [31]采用双靶向微泡使肿瘤新生血管增强显影，即将抗VEGFR2和抗alpha(V)beta3抗体连接到充有全氟化碳气体的微泡外壳上，这种双靶向微泡能明显增强小鼠卵巢癌异种移植瘤新生血管的显影，这可能为肿瘤靶向治疗提供了治疗策略。
