德氏乳杆菌保加利亚亚种的电转化条件优化
食品科学与工程学院：张旭指导教师：崔艳华
摘要：德氏乳杆菌保加利亚亚种（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus）是最具经济价值的乳酸菌之一，在世界上广泛应用于酸奶和其它发酵乳的生产。
当前对该菌的代谢机制等方面研究甚少。
外源基因的转化效率是制约其分子代谢机制研究的重要因素。
本研究以pMG36c为材料，对L. delbrueckii subsp. bulgaricus进行电转化条件研究。
结果表明，在电转化过程中，电场强度、质粒的浓度、细胞生长状态均对转化效率有明显影响。
本研究得到该菌株的最适电转化条件为：对数初期的细胞，质粒浓度为100 ng加入到50 μl OD600为45的样品中，在10 kV/cm电场强度下电转化，转化后细胞在复壮培养液中培养3h后涂布选择性培养基，转化效率可达2.6×103 CFU/µg DNA。
关键词：德氏乳杆菌保加利亚亚种；电转化；生长时期；转化效率
Abstract：Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus is a kind of Gram-positive bacteria, has been widely used in yogurt and other fermentation milk in the world, is recognized as the higher economic value of microorganism. The genetic transformation of L. delbrueckii subsp. bulgaricus is a key factor which restricts its genetic manipulation. The method of electrotransformation of L. delbrueckii subsp. bulgaricus CH3 was constructed by means of plasmid pMG36c. The factors were evaluated, including electric field strength,concentration of plasmid and cell growth phage. The optimum factors are the cell harvested at the early exponential growth phase, electrotransformation at the 10 kV/cm, with 100 ng plasmid per 50 μl sample, and 3h cell incubation time. The transformation efficiency is 2.6×103 CFU/µg DNA at the optimum conditions.
Key words：Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus electrotransformation growth phage transformation efficiency
1 引言
乳酸菌是一群微好氧、大多数G+C含量较低、能够发酵碳水化合物产生乳酸的革兰氏阳性菌。
除部分病原菌外，大部分乳酸菌是有益菌。
其中部分乳酸菌具有调节机体胃肠道微生态平衡，降低血清胆固醇、控制内毒素、抑制病原菌、调节免疫能力等诸多益生功能，是重要的益生菌。
目前，乳酸菌已广泛应用于食品、轻工业、医药、饲料等多个领域[1-2]。
德氏乳杆菌保加利亚亚种（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus）是最具经济价值的乳酸菌之一，在世界上广泛应用于酸奶和其它发酵乳的生产。
尽管研究者对其进行了大量研究，但主要集中在发酵性能和应用研究。
而对该菌的代谢机制等方面研究甚少，主要原因是该菌的遗传转化较为困难。
本研究拟从德氏乳杆菌保加利亚亚种的生长时期、外源质粒浓度和电转化参数等几个因素着手，优化该菌的电转化操作，建立最佳的电转化平台，为今后该菌的重要基因功能鉴定和分子代谢机制的研究奠定基础。
2 实验材料与方法
2.1 实验材料和仪器
2.1.1 宿主菌和载体质粒
大肠杆菌JM109、德氏乳杆菌保加利亚亚种由本实验室保存。
质粒pMG36c是长度大约为3.7kb，带有氯霉素抗性的大肠杆菌乳酸菌穿梭质粒，由本实验室保存。
2.1.2 试剂
DL15000Marker、DL2000Marker购自TaKaRa公司。
Tris饱和酚购自上海生工生物公司。
二硫苏糖醇（DTT）、吐温80、K2HPO4、NaAc、C6H6O7 (NH4)2、MgSO4·7H2O、MnSO4·4H2O等试剂均为国产分析纯试剂。
2.2 实验方法
2.2.1 DNA浓度和纯度的测定
取DNA样品，稀释1000倍，测定并记录样品液在280 nm和260 nm处的吸光度值。
质粒DNA浓度=50 µg/ml×A280×稀释倍数
2.2.2大肠杆菌质粒DNA制备
采用碱裂解法提取，方法参见《分子克隆》。
2.2.3电脉冲转化德氏乳杆菌保加利亚亚种
采用文献[3]中方法，有修改。
步骤如下：
(1)挑取平板上的单菌落接种于MRS液体培养基中培养过夜。
(2)将2 ml新鲜菌液接种到100 ml新鲜的MRS培养基中，37 ℃静止培养。
根据之前绘制的生长
曲线确定培养时间，并测定OD600值以确认。
(3)用1.5 ml离心管4 ℃以6000 g离心5 min/收集菌体，弃上清每管用1 ml预冷的Electroporation
Buffer重悬菌体，然后离心。
(4)再用1 ml 冰预冷的Electroporation Buffer 洗两次，将菌体重悬在Electroporation Buffer中并
使OD达到45，分装到离心管中，每管50 μl。
(5)菌悬液在45 ℃温育20 min，然后在冰上放置10 min。
(6)将50 μl菌悬液和1.0 μg的DNA混合，转入0.2 cm的电转杯。
(7)设置电转参数：电压实验具体情况设定，800 Ω，25 μF，电击。
(8)立即加入950 μl的milk medium，置于37 ℃静止培养复壮3 h。
(9)将复壮后的菌液梯度稀释，涂布在含有合适抗生素浓度（Cm 3.5 μg/ml）的MRS平板上，每
板涂布100 μl，置于37 ℃静止培养2-3天。
(10)平板计数，计算转化效率。
2.2.4测定德氏乳杆菌对氯霉素的耐受程度
液体培养基中确定：从实验室保存的-70℃的甘油菌中活化出德氏乳杆菌保加利亚亚种，挑取单菌落分别接种于含有不同浓度氯霉素的液体MRS培养基中培养，1号至6号试管中氯霉素浓度分别是1 μg/ml、2 μg/ml、3 μg/ml、4 μg/ml、5 μg/ml、6 μg/ml。
7号试管中不加氯霉素。
将这7支试管放于培养箱中37 ℃静止培养。
固体培养基中确定：挑取平板上活化的菌落，在含有不同浓度氯霉素的固体MRS培养基上划线
培养，1号至3号平板上氯霉素浓度分别是3 μg/ml、4 μg/ml、5 μg/ml。
4号平板上不加氯霉素。
将这
4个平板置于37 ℃静止培养。
2.2.5质粒酶切
将水、Buffer、质粒依次加入Ep管中，混合均匀，37℃温育2-3小时，然后取出进行凝胶电泳。
3结果与分析
3.1 质粒提取与鉴定
3.1.1 质粒提取与酶切鉴定
用实验室保存的pMG36c转化大肠杆菌JM109，提取质粒，结果如图3-1，从质粒位置和marker
及阳性对照比较，可见转化成功并得到所需质粒。
将质粒酶切后进行凝胶电泳，从图3-2上可以看出
所得质粒和阳性对照相符合。
图3-1质粒的琼脂糖电泳图图3-2 质粒的酶切检测
1：marker 2~ 3：pMG36c 1：marker 2~3：pMG36c
4：pMG36c 5：pMG36cL 4：pMG36c/Eco RI 5：pMG36cL/Eco RI
3.1.2 质粒浓度和纯度的测定
RNA酶处理提取的质粒，电泳检测结果。
将质粒稀释测定260 nm和280 nm处吸光值。
OD260=0.340 OD280=0.173 1.8＜OD260/ OD280=1.96＜2.0，表明RNA和蛋白质污染在可接受范围内，计算得出质
粒浓度为17 μg/μl。
图3-3 质粒去RNA
1: marker 2: pMG36c/去RNA
3.2 德氏乳杆菌保加利亚亚种生长曲线的测定
根据图3-4划分生长时期：0-4 h停滞期，4-16 h对数期（4-6 h对数早期，8-12 h对数中期，14-16 h对数后期），16-20 h稳定期。
实验中选取4 h、8 h、12 h、16 h和20 h五个水平。
图3-4 德氏乳杆菌保加利亚亚种生长曲线
3.3 氯霉素最佳选择浓度的确定
培养基中氯霉素浓度的确定：本研究选取了1-6 μg/ml的氯霉素筛选浓度，发现氯霉素浓度在3 μg/ml以下时，德氏乳杆菌能继续生长，而浓度大于4 μg/ml时，德氏乳杆菌无法生长，所以最终氯霉素筛选浓度确定为4 μg/ml。
3.4 电场强度对转化效率的影响
本实验选取了15 kV/cm 、12.5 kV/cm、10 kV/cm和7.50 kV/cm四个电压强度水平。
实验结果表明，电场强度对电转化效率影响明显。
由图3-5可见在电场强度为10 kV/cm时得到最高转化效率，当电场强度达到15 kV/cm时，细胞被击穿，没有获得转化子。
图3-5 不同电场强度对电转化效率的影响
3.5 质粒浓度对转化效率的影响
本研究选取了50 ng、100 ng、125 ng、250 ng、375 ng等5个质粒用量，分别加入到50 μl OD值为45的菌液中，检测质粒浓度对转化效率的影响。
图3-6 不同质粒DNA用量对电转化效率的影响
由图3-6可见，开始转化效率随质粒的加入量的增加而增加，在向样品中加入100 ng外源质粒DNA时候获得最高转化效率。
随后转化效率下降，这与文献报道的结果是一致的[3-5]，即质粒含量达到饱和前，转化效率随质粒用量增加而升高，质粒用量达到饱和后，转化效率随质粒用量增加而下降。
3.6 生长时期对转化效率的影响
生长时期是影响电转化效率的重要因素之一。
根据本实验前期测定德氏乳杆菌保加利亚亚种生长曲线，选取了对数早期(4 h)、对数中期(8 h)、对数后期(12 h)、稳定期(16 h)及稳定后期(20 h)等五个水平，探讨细菌生长状态对其电转化效率的影响。
实验结果见图3-7。
根据图3-7可以看出，在稳定后期和对数早期获得较高转化效率，首先稳定后期观察到较高转化效率，这和文献报道的结果是一致的[12]。
而对于对数早期的转化效率较高是比较正常的。
其他菌株的电转化一般也选择对数期的细胞来制备感受态，这个时期细胞生长旺盛，菌体形态单一。
这和Miller 和Taketo对乳酸菌电转化的研究结果也是一致的[6-7]。
图3-7 细胞生长时期对电转化效率的影响
结论
本实验利用pMG36c质粒转化德氏乳杆菌保加利亚亚种，通过优化的电转化参数获得了较高转化效率。
实验得到如下结论：
1. 通过测定德氏乳杆菌保加利亚亚种在液体和固体培养基中对氯霉素的耐受性，确定了固体培养基中最佳抗性筛选浓度为4 μg/ml。
2. 研究了四个电场强度水平7.5 kV/cm、10 kV/cm、12.5 kV/cm、15 kV/cm对电转化效率的影响。
研究10 kV/cm时达到最高转化效率，而15 kV/cm时电压过高，样品被击穿。
3. 通过利用不同质粒浓度进行电转化，发现开始转化效率随质粒的加入量的增加而增加，在向50 μl OD600值为45的样品中加入100 ng外源质粒DNA时候获得最高转化效率。
随后质粒浓度增加，而电转化效率下降，即质粒浓度达到饱和前，转化效率随质粒浓度增加而升高，质粒浓度达到饱和后，转化效率随质粒浓度增加而下降。
4. 通过测定德氏乳杆菌保加利亚亚种的生长曲线，确定了该菌的不同生长时期，进而确定了5个待测的生长点，结果发现稳定后期和对数早期获得较高转化效率。
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