吐温-80和脂质体对厚朴酚荧光光谱的影响

吐温-80和脂质体对厚朴酚荧光光谱的影响
熊玉涛;黎红梅
【摘要】分析厚朴酚在吐温-80胶束和脂质体溶液中荧光光谱的变化,发现:1)浓度为2 mmol·L-1的吐温-80胶束对厚朴酚有荧光增敏作用,厚朴酚存在于吐温-80的疏水核中,其荧光光谱发生了明显的红移;2)在4 mg·mL(1的脂质体溶液中,厚朴酚
的荧光光谱变得复杂,谱图信息反映厚朴酚同时存在于水相和双脂层膜相中,且在二
者之间存在分配平衡,通过测定λ365、λ397处的荧光光谱随厚朴酚浓度的变化,得到了厚朴酚在脂质体膜相和水相中的分配平衡关系;3)脂质体溶液中加入吐温-80,
厚朴酚在双脂层膜相中的分布增加,其荧光光谱发生了红移.
【期刊名称】《五邑大学学报（自然科学版）》
【年(卷),期】2009(023)002
【总页数】4页(P29-32)
【关键词】厚朴酚;吐温-80;脂质体;表面活性剂
【作者】熊玉涛;黎红梅
【作者单位】五邑大学,学报编辑部,广东,江门,529020;中国药科大学,基础部,江苏,
南京,321600
【正文语种】中文
【中图分类】O644.1;R284
表面活性剂是优良的增效分析试剂，在光度分析中的应用十分广泛[1~3]. 文献[4，5]报道了采用表面活性剂SDS荧光增敏法同时测定样品中厚朴酚、和厚朴酚的含
量. 厚朴酚具有多种药理作用，广泛用于临床. 为全面了解厚朴酚的溶剂化效应[6]，本文用表面活性剂吐温-80做荧光增敏剂，观察了其对厚朴酚光谱的影响；并研究了脂质体中厚朴酚的荧光光谱，以了解脂质体双脂层对厚朴酚光谱的作用，以及厚朴酚在脂质体中的分配平衡.
厚朴酚市售，纯度99 %. 药用蛋黄卵磷脂规格E-80，德国Lipoid公司. 胆固醇、吐温-80为分析纯试剂. 实验用水为二次重蒸蒸馏水，所有有机溶剂均为不含荧光
杂质的分析纯试剂，使用前没有经过进一步纯化. pH值为7.20的缓冲液由Tris组成.
上海雷磁pHS-2C型酸度计，岛津RF-5301荧光分光光度计.
取20 mmol·L−1的吐温-80储备液1 mL，分别加入1 mL浓度为1.0×10−6 mol·L−1、1.0×10−5 mol·L−1、2.5×10−5 mol·L−1、5.0×10−5 mol·L−1、
7.5×10−5 mol·L−1的厚朴酚储备液，定容至10 mL. 分别扫描其荧光激发和发射光谱.
脂质体的制备：将180 mg卵磷脂和20 mg胆固醇溶解在5 mL无水乙醇中.
在40 ~ 50 ºC水浴中，电磁搅拌下，用注射器缓慢将磷脂溶液滴入20 mL pH值为7.20的Tris缓冲液中，并继续搅拌3 h. 最后，溶液过0.2 μm滤膜，用Tris缓冲液定容至25 mL，得8 mg·mL -1 的脂质体储备溶液.
取上述制备的脂质体溶液5mL，分别加入1 mL浓度为1.0×10−6 mol·L−1、
1.0×10−5 mol·L−1、
2.5×10−5 mol·L−1、5.0×10−5 mol·L−1、7.5×10−5 mol·L−1的厚朴酚储备液，用缓冲溶液定容至10 mL. 分别扫描其荧光激发和发射光谱.
厚朴酚（结构式如图1，简写为H2A，）是二元有机弱酸，在pH值为7.20的缓冲溶液中，它能部分电离成HA－，即水溶液中同时存在H2A和HA－. H2A的激发位于250 nm、284 nm；HA－*的发射位于400 nm，在无水溶液中H2A*发
射位于355 nm. 但在有水存在时，由于厚朴酚强烈的光酸效应[7]，H2A*迅速电离为HA－*，因此，水溶液中只能看到HA－*位于400 nm处的发射谱. 依此可判断厚朴酚所处的环境中是否有水.
图2中，与水中厚朴酚的激发带相比：
1）在吐温-80、脂质体、吐温-80—脂质体中，厚朴酚最低能量激发带的荧光强度显著增强.
2）厚朴酚在脂质体、吐温-80、吐温-80—脂质体中的激发带发生了红移：在吐温-80中，厚朴酚的激发带位于263nm、296nm；脂质体中厚朴酚的激发光谱较复杂，是水中激发带（250nm和284nm）和疏水环境中激发带（263nm和
293nm）的叠加；在吐温-80—脂质体中，厚朴酚发射光谱相对于吐温-80略有红移.
图3中，与水中厚朴酚的发射带相比：
1）厚朴酚在吐温-80、脂质体、吐温-80—脂质体中的荧光发射强度显著增强. 2）脂质体溶液中厚朴酚的发射光谱有2种谱带：365 nm和400 nm；吐温-80中厚朴酚发射峰位于354 nm附近，400 nm发射带几乎消失；吐温-80—脂质体中厚朴酚发射谱类似于吐温-80，但有红移.
综合谱图，吐温-80、脂质体对厚朴酚的荧光分析有增敏和增加对比度（红移）的作用.
当超过临界胶束浓度（吐温-80的CMC为0.1 mmol·L -1 [8]），吐温-80分子在溶液内部自聚，即疏水基在一起形成内核，亲水基朝外与水接触，形成胶束. 荧光光谱表明厚朴酚存在于吐温-80胶束的疏水内核中：1）如图3所示，厚朴酚发射峰位于354 nm左右处，400 nm发射带消失，说明厚朴酚处于无水环境；2）如图2所示，不同于水中，厚朴酚在吐温-80中的最低能量激发带红移至296 nm 左右，另一激发带也从水中的250 nm移至263 nm.
磷脂分子分散在水中形成多层囊泡，囊泡中央和各层之间被水相隔开；两亲性物质胆固醇作为附加剂调节脂质体膜的通透性. 由于脂质体膜的选择性通透，一部分厚朴酚可以进入水相，另一部分则存在于疏水的脂质体膜相. 谱图也支持这一结论：1）脂质体中厚朴酚的发射光谱有2个谱带：365 nm和400 nm，其中短波带
365 nm属于膜相中H2A*的发射，长波带属于水相中HA－*的发射；2）激发光
谱是水中激发带（250 nm和284 nm）和疏水环境激发带（263 nm和293 nm）的叠加.
在吐温-80—脂质体的混合物中，由于吐温-80与脂质体双脂层的相互作用，可能是吐温脂链插膜作用改变了双脂层结构及其溶剂化效应，使得厚朴酚发射光谱相对于吐温-80发生红移，但从其激发光谱可清楚地看出仍有部分厚朴酚处于水相. 由
于厚朴酚的联苯骨架不是平面结构，其二面角为44.9º，分子具有一定的刚性，容易被排列整齐的双脂层“挤”出来，因此脂质体脂层中的厚朴酚不如吐温-80疏水内核中多. 在脂质体中加入吐温-80，会破坏双脂层结构，使其流动性增加，从而
增加厚朴酚在双脂层中的分布.
文献[5]报道在pH值4.0的HAc-NaAc缓冲溶液中，用阴离子表面活性剂SDS作为荧光增敏剂同时测定样品中厚朴酚与和厚朴酚的含量. 这其实是不合适的. 因为：1）一般，阴离子型表面活性剂要求在碱性或中性条件下使用；2）厚朴酚分布于SDS胶束疏水内核，由于疏水内核弱的受质子能力，处于胶束内部的厚朴酚分子
不能发生质子转移反应，而只表现为H2A*的发射，该波长位于355 nm附近，与和厚朴酚的发射带（346 nm）存在严重交叠，会使测定结果不准确. 文献[4]显然
考虑了该因素，对λ345处的荧光做了加和.
从图2.3可见，空白脂质体对厚朴酚荧光的测定存在一定的干扰，但厚朴酚浓度不很低时（大于1×10 -7 mol·L -1），影响不大. 我们测定了4 mg·mL -1 的脂质体溶液中，pH值为7.20时，厚朴酚的荧光光谱随浓度的变化，如图3. 在λ365、
λ397，分别取厚朴酚不同浓度下的荧光发射强度，对二者进行线性回归，得到
I365和I397与浓度的关系分别为：
该方程反映了厚朴酚在脂质体膜相和水相中的分配平衡. 脂质体的双脂层具有与生物膜类似的结构，常作为研究药物透膜吸收的模拟物[9]. 我们研究脂质体中厚朴酚荧光光谱的目的是，希望了解脂质体双脂层对厚朴酚光谱的影响，以及厚朴酚与双脂层的相互作用信息.
实验结果表明：厚朴酚存在于吐温-80的疏水核中，而在脂质体溶液中则存在于水相和双脂层膜相中，加入吐温-80会使厚朴酚在脂层中的分布增加. 该结果是对厚朴酚溶剂化效应的补充，也能为脂质体作为厚朴酚的药物载体提供一定的研究依据.
【相关文献】
[1] 王建英，刘茹. 表面活性剂的增效作用在光度分析中应用[J]. 理化检验—化学分册，1998, 34(5): 228-231.
[2] 王晓玲，朱建勇，强俊超，等. 胶束在光度分析中的应用进展[J]. 咸阳师范学院学报，2004,
19(6): 28-31.
[3] 肖进新，赵振国. 表面活性剂应用原理[M]. 北京：化学工业出版社，2003.
[4] 白小红，魏雁声，刘长松. 胶束增稳荧光法同时测定血清中厚朴酚及和厚朴酚同分异构体[J]. 分
析化学，1 1999, 27(4): 388-391.
[5] 庞立业，陈冠华，田益玲，等. 荧光分光光度法测定生药厚朴中的厚朴酚与和厚朴酚[J]. 河北大
学学报：自然科学版，2004, 24(2): 159-162.
[6] 熊玉涛，黎红梅. 厚朴酚的溶剂化显色效应[J]. 西安文理学院学报：自然科学版，2009, 12(2): 19-24.
[7]LI Hongmei, WANG Yunqing, YAN Zhengyu, et al. Proton transfer of magnolol in ground and excited states[J]. Journal of Photochemistry and Photobiology A: Chemistry, 2007, 186(2/3): 202-211.
[8] 林爱华，孙小梅，李步海. 表面活性剂对蛋白质变性作用的研究[J]. 中南民族大学学报：自然科
学版，2002,1 21(1): 21-24.
[9] METSOA Antti J, MATTILAA Juha-Pekka, KINNUNEN Paavo K J. Characterization of the main transition of dinervonoylphosphocholine liposomes by fluorescence spectroscopy [J]. Biochimica et Biophys Acta, 2004, 1663: 222-231.。