(2) DNA连接酶：被同一种限制性内切酶切割开来的目的基因和运载体，具有相同的黏性末端，将它们的黏性末端连接起来，就可以形成重组的DNA分子。这个将目的基因和运载体连接起来的过程就需要用到DNA连接酶。其功能是把两个DNA片段末端之间的“缝隙”连接起来。注意：DNA连接酶连接的是磷酸和脱氧核糖之间的磷酸二酯键，而不是两条链之间互补配对碱基之间的氢键，它与限制性内切酶作用是相反的。注意与DNA聚合酶区别，DNA聚合酶是在DNA复制时用到的，它连接的也是磷酸二酯键，但复制时需要模板链。
单克隆抗体
(1)单克隆抗体的概念：单克隆抗体是相对血清抗体而言的。血清抗体是将抗原反复注射到动物体内，然后从血清中获得抗体，其特点为：产量低，特异性差，纯度低，不灵敏。而单克隆抗体则是由效应B淋巴细胞产生的化学性质单一、特异性强的抗体。
细胞株：原代培养的细胞一般传至10代左右会出现生长停滞，衰老死亡，少数度过“危机”的细胞能传40～50代，形成细胞株。细胞株的遗传物质并没有发生改变。
细胞系：细胞株传至50代以后，会出现第二次危机，少数度过第二次危机的细胞能够无限制传下去，形成细胞系。细胞系的遗传物质发生了改变，带有癌变细胞的特点。
第三步：通过运载体把目的基因带入某生物体内。
将基因转入受体细胞，除了常用的运载体转运方法外，在一定的条件下还常使用以下一些方法：
(1)显微注射法：是转基因动物中常采用的方法，用微注射仪将目的基因注射入动物的受精卵。
(2)基因枪法：基因枪是一种专门用于基因转移的高压枪。该种方法是首先将目的基因的DNA附着于直径约为4μm的钨等金属粒子表面，然后用基因枪将其射入受体细胞。
(3)杂种细胞的筛选和培养：烟草与大豆的原生质体融合后，将原生质体转移到适当的培养基上培养，使其再生出细胞壁。这时，在细胞混合物中，不仅有烟草—大豆杂种细胞，还有烟草细胞、大豆细胞、烟草—烟草细胞、大豆—大豆细胞。杂种细胞的筛选，可以用机械方法，也可以用生理学或遗传学方法。
(4)杂种植株的再生与鉴定：杂种植株再生是指以愈伤组织培养出杂种植株的过程。由于烟草和大豆分别属于茄科和豆科植物，二者的原生质体融合后，至今只能长成杂种愈伤组织，还不能分化，更谈不上杂种植株的再生与鉴定。对于能够再生出杂种植株的烟草—海岛烟草、白菜—甘蓝、胡萝卜—羊角芹等，长出的植株究竟是不是杂种，还需要经过鉴定才能确定下来。杂种植株鉴定方法有形态学方法、生化方法(如电泳)、细胞学方法(如染色体组型分析)、分子生物学方法(如分子杂交)等。
植物体细胞杂交操作过程
(1)原生质体制备：选取烟草植株上的幼嫩叶片细胞和培养好的大豆根尖细胞，用酶解法制备原生质体。烟草的原生质体呈绿色，大豆是无色，在显微镜下很容易区别开来。
(2)原生质体融合：取等量烟草和大豆的原生质体混合后，加入聚乙二醇溶液。在显微镜下观察，可以看到原生质体相互黏集在一起。隔一段时间后，加入高钙、高pH的溶液，这时原生质体才开始融合。原生质体融合包括膜融合和核融合两个过程。诱导融合只能诱导细胞膜的融合，两个核的融合是在杂种细胞第一次有丝分裂时进行的。
基因治疗：将外源基因通过基因转移技术，将其插入病人适当的受体细胞中，使外源基因制造的产物能治疗某种疾病。1990年美同国立卫生研究院的一个研究小组对一个四岁的患腺苷脱氨酶(ADA)缺乏症的女孩进行基因治疗。他们将正常ADA基因利用反转录病毒载体导入女孩淋巴细胞内，体外培养后回输入她体内，实验获得圆满成功。这是人类历史上第一个成功基因治疗临床实验。
(2)转基因药物 自从美国1977年第一次用改造的大肠杆菌生产出有活性的人的生长激素释放抑制素以来，基因工程技术已经成功地应用于生物治疗药物的研制。现已研制成功的基因工程药物有几十种，如已上市的人的生长激素、胰岛素、干扰素、尿激酶原、超氧化物歧化酶等。
(3) 基因诊断和基因治疗
基因诊断：DNA分子杂交法(即DNA探针法)：该方法是根据碱基互补配对原则，把互补的双链DNA解开，把单链的DNA小片段用同位素、荧光分子或化学发光催化剂等进行标记，之后同被检测的DNA中的同源互补序列杂交，从而检出所要查明的DNA或基因。具体步骤：抽取病人的组织或体液作为化验样品；将样品中的DNA分离出来；用化学法或热处理法使样品DNA解旋；将事先制作好的DNA探针引入到化验样品中。这些已知的经过标记的探针能够在化验样品中找到互补链，并与之结合(杂交)在一起，找不到互补链的DNA探针，则可以被洗脱。这样通过遗留在样品中的标记过的DNA探针进行基因分析，就能检出病人所得的病。
细胞工程是指应用细胞生物学和分子生物学的方法，通过某种工程学手段，在细胞整体水平或细胞器水平上，按照人们。
1．细胞培养技术一条件：无菌操作
(1)植物组织培养
①愈伤组织特点：排列疏松无规则、高度液泡化、无定形的未分化的薄壁细胞。
⑤原代培养、传代培养、细胞株、细胞系及其关系
原代培养：可用有两种表述：①细胞悬浮液第一次在瓶中培养，没有分瓶培养之前的细胞培养；②第1代细胞的培养与传10代以内的细胞培养统称为原代培养。两种表述没有本质区别。
传代培养：同样有两种表述：①细胞悬浮液培养一段时间后，分瓶再进行的细胞培养；②传10代以后的细胞培养，统称为传代培养。
2、基因工程操作的基本步骤
第一步：获得符合人类意愿的基因，即获得目的基因。目的基因是依据基因工程设计中所需要的某些DNA分子片段，含有所需要的完整的遗传信息。获得目的基因的方法很多，目前常采用的是直接分离和人工合成目的基因的方法。具体做法是：
(1)直接分离法：直接分离法最常用的是“鸟枪法”又称“散弹射击法”。就是从供体细胞中取出DNA分子，用限制性内切酶进行处理得到DNA片段，然后分别用运载体转入到不同的受体细胞内进行DNA片段扩增，再从受体细胞中找出具有相应目的基因的细胞，得到目的基因。这种方法的优点是操作简便。存在的缺点则是工作量大，有盲目性；对于真核细胞的基因来说，目的基因中还含有不表达的内含子，无法将这样的基因在原核细胞内表达。因此此法可用于原核生物基因的获取。(2)人工合成法：就是按照自然基因的本来遗传信息，人工合成相应的DNA片段，可用于真核生物基因的获取。目前有两种方法，分别为反转录法和依据蛋白质氨基酸序列推测合成法。
①反转录法：从供体细胞内找出由目的基因转录出来的信使RNA，以该信使RNA为模板，反转录成互补的单链DNA，然后在酶的作用下合成双链DNA，从而获得所需要的基因。优点是专一性强、目的基因中不含内含子。缺点是操作过程复杂，mRNA存在时间短，技术要求高。
②依据蛋白质氨基酸序列推断合成法：根据已知蛋白质的氨基酸序列，推测出相应信使RNA序列，然后按照碱基互补配对原则，推测出其结构基因的核苷酸序列，再通过化学合成的方法，以单核苷酸为原料合成目的基因。优点专一性强，目的基因中不含内含子，可合成自然界不存在的基因。
②组织培养优点：取材少、培养周期短、繁殖率高、便于自动化管理。
③组织培养用途：快速繁殖名贵的花卉和果树；培育无病毒植物(采用根尖、茎尖组织)；获得植物细胞产品；制成人工种子以及转基因植物的培育等。
④植物细胞培养的原理／理论基础：细胞的全能性，属于无性繁殖。
(2)动物细胞培养
(3)动、植物细胞培养的对比
项 目 理论基础/原理 培养基 结果 用途
区别 植物组织培养 细胞的全能性 固体或半固体培养基；植物激素 子代植株 见上述
动物细胞培养 细胞增殖 液体培养基；动物血清 细胞株或细胞系 见上述
联系 都需要人工条件下的无菌操作
2．细胞融合技术
①培养液的成分：葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素、动物血清(类似于内环境成分)。
②动物细胞生长特点：贴壁生长直至贴满即停止分裂，大部分死亡、少部分生存。
③细胞培养用途：生产蛋白制品（如疫苗、干扰素、单抗等）；再造烧伤病人的皮肤；检测毒物毒性；研究病理和药理。
④动物细胞培养的原理／理论基础：细胞增殖。
4．基因工程是把“双刃剑”
基因工程技术的应用在给人们带来福音的同时，暗藏着对人类生存的巨大威胁。如基因工程可以制造超级细菌、超级杂草等；战争狂人、恐怖主义者可制造出难以制服的病原体、生物毒剂即生物武器，进行讹诈和大规模毁灭人类的生物战争；转基因动植物的出现引发物种入侵，有可能破坏原有的生态平衡，对原有物种产生威胁；还有转基因食品安全问题； (二)细胞工程的综合复习
3、基因工程技术的应用
(1)转基因生物 通过转基因技术把某种生物的基因或人工合成的基因转移到另一生物体内，从而培育出对人类有利的生物新品种。如我国科学家1989年将人的生长激素基因导入鲤鱼的受精卵中，培育成了转基因鲤鱼；1995年我国科学家将某种细菌的抗虫基因导入棉花，培育出了抗虫棉；1999年我国上海诞生了转基因牛，其牛奶中含有大量人体蛋白，可以治病。
(3)运载体 在基因工程操作中使用运载体的目的有两个：一是用它作为运载工具，将目的基因转移到宿主细胞中去；二是利用它在宿主细胞内对目的基因进行大量的复制(称为克隆)。现在所用的运载体主要有两类：一类是细菌的质粒，它是一种相对分子质量较小、独立于细菌DNA之外的小型环状DNA，有的细菌中有一个，有的细菌中有多个，质粒能通过细菌间的接合由一个细菌向另一个细菌转移，可以独立复制，也可以整合到细菌DNA中，随细菌DNA的复制而复制；另一类运载体是噬菌体或某些动植物病毒等。现在人们还在不断地寻找新的运载体，如叶绿体或线粒体DNA等也有可能成为运载体。如把外源基因导入叶绿体中，可减少了“基因污染”。作为运载体必须具备三个条件：①在宿主细胞中能保存下来并能大量复制；②有多个限制酶切点，而且每种酶的切点最好只有一个，如大肠杆菌pBR322就有多种限制酶的单一识别位点，可适用于多种限制酶切割的DNA插入；③有一定的标记基因，便于筛选，如大肠杆菌的pBR322质粒携带四环素抗性基因，就可以作为筛选的标记基因。此外，运载体存在对宿主细胞生存没有影响。
(一)基因工程知识小结
1、基因工程的工具
单克隆抗体
(1)单克隆抗体的概念：单克隆抗体是相对血清抗体而言的。血清抗体是将抗原反复注射到动物体内，然后从血清中获得抗体，其特点为：产量低，特异性差，纯度低，不灵敏。而单克隆抗体则是由效应B淋巴细胞产生的化学性质单一、特异性强的抗体。
细胞株：原代培养的细胞一般传至10代左右会出现生长停滞，衰老死亡，少数度过“危机”的细胞能传40～50代，形成细胞株。细胞株的遗传物质并没有发生改变。
细胞系：细胞株传至50代以后，会出现第二次危机，少数度过第二次危机的细胞能够无限制传下去，形成细胞系。细胞系的遗传物质发生了改变，带有癌变细胞的特点。
第三步：通过运载体把目的基因带入某生物体内。
将基因转入受体细胞，除了常用的运载体转运方法外，在一定的条件下还常使用以下一些方法：
(1)显微注射法：是转基因动物中常采用的方法，用微注射仪将目的基因注射入动物的受精卵。
(2)基因枪法：基因枪是一种专门用于基因转移的高压枪。该种方法是首先将目的基因的DNA附着于直径约为4μm的钨等金属粒子表面，然后用基因枪将其射入受体细胞。
(3)杂种细胞的筛选和培养：烟草与大豆的原生质体融合后，将原生质体转移到适当的培养基上培养，使其再生出细胞壁。这时，在细胞混合物中，不仅有烟草—大豆杂种细胞，还有烟草细胞、大豆细胞、烟草—烟草细胞、大豆—大豆细胞。杂种细胞的筛选，可以用机械方法，也可以用生理学或遗传学方法。
(4)杂种植株的再生与鉴定：杂种植株再生是指以愈伤组织培养出杂种植株的过程。由于烟草和大豆分别属于茄科和豆科植物，二者的原生质体融合后，至今只能长成杂种愈伤组织，还不能分化，更谈不上杂种植株的再生与鉴定。对于能够再生出杂种植株的烟草—海岛烟草、白菜—甘蓝、胡萝卜—羊角芹等，长出的植株究竟是不是杂种，还需要经过鉴定才能确定下来。杂种植株鉴定方法有形态学方法、生化方法(如电泳)、细胞学方法(如染色体组型分析)、分子生物学方法(如分子杂交)等。
植物体细胞杂交操作过程
(1)原生质体制备：选取烟草植株上的幼嫩叶片细胞和培养好的大豆根尖细胞，用酶解法制备原生质体。烟草的原生质体呈绿色，大豆是无色，在显微镜下很容易区别开来。
(2)原生质体融合：取等量烟草和大豆的原生质体混合后，加入聚乙二醇溶液。在显微镜下观察，可以看到原生质体相互黏集在一起。隔一段时间后，加入高钙、高pH的溶液，这时原生质体才开始融合。原生质体融合包括膜融合和核融合两个过程。诱导融合只能诱导细胞膜的融合，两个核的融合是在杂种细胞第一次有丝分裂时进行的。
基因治疗：将外源基因通过基因转移技术，将其插入病人适当的受体细胞中，使外源基因制造的产物能治疗某种疾病。1990年美同国立卫生研究院的一个研究小组对一个四岁的患腺苷脱氨酶(ADA)缺乏症的女孩进行基因治疗。他们将正常ADA基因利用反转录病毒载体导入女孩淋巴细胞内，体外培养后回输入她体内，实验获得圆满成功。这是人类历史上第一个成功基因治疗临床实验。
(2)转基因药物 自从美国1977年第一次用改造的大肠杆菌生产出有活性的人的生长激素释放抑制素以来，基因工程技术已经成功地应用于生物治疗药物的研制。现已研制成功的基因工程药物有几十种，如已上市的人的生长激素、胰岛素、干扰素、尿激酶原、超氧化物歧化酶等。
(3) 基因诊断和基因治疗
基因诊断：DNA分子杂交法(即DNA探针法)：该方法是根据碱基互补配对原则，把互补的双链DNA解开，把单链的DNA小片段用同位素、荧光分子或化学发光催化剂等进行标记，之后同被检测的DNA中的同源互补序列杂交，从而检出所要查明的DNA或基因。具体步骤：抽取病人的组织或体液作为化验样品；将样品中的DNA分离出来；用化学法或热处理法使样品DNA解旋；将事先制作好的DNA探针引入到化验样品中。这些已知的经过标记的探针能够在化验样品中找到互补链，并与之结合(杂交)在一起，找不到互补链的DNA探针，则可以被洗脱。这样通过遗留在样品中的标记过的DNA探针进行基因分析，就能检出病人所得的病。
细胞工程是指应用细胞生物学和分子生物学的方法，通过某种工程学手段，在细胞整体水平或细胞器水平上，按照人们。
1．细胞培养技术一条件：无菌操作
(1)植物组织培养
①愈伤组织特点：排列疏松无规则、高度液泡化、无定形的未分化的薄壁细胞。
⑤原代培养、传代培养、细胞株、细胞系及其关系
原代培养：可用有两种表述：①细胞悬浮液第一次在瓶中培养，没有分瓶培养之前的细胞培养；②第1代细胞的培养与传10代以内的细胞培养统称为原代培养。两种表述没有本质区别。
传代培养：同样有两种表述：①细胞悬浮液培养一段时间后，分瓶再进行的细胞培养；②传10代以后的细胞培养，统称为传代培养。
2、基因工程操作的基本步骤
第一步：获得符合人类意愿的基因，即获得目的基因。目的基因是依据基因工程设计中所需要的某些DNA分子片段，含有所需要的完整的遗传信息。获得目的基因的方法很多，目前常采用的是直接分离和人工合成目的基因的方法。具体做法是：
(1)直接分离法：直接分离法最常用的是“鸟枪法”又称“散弹射击法”。就是从供体细胞中取出DNA分子，用限制性内切酶进行处理得到DNA片段，然后分别用运载体转入到不同的受体细胞内进行DNA片段扩增，再从受体细胞中找出具有相应目的基因的细胞，得到目的基因。这种方法的优点是操作简便。存在的缺点则是工作量大，有盲目性；对于真核细胞的基因来说，目的基因中还含有不表达的内含子，无法将这样的基因在原核细胞内表达。因此此法可用于原核生物基因的获取。(2)人工合成法：就是按照自然基因的本来遗传信息，人工合成相应的DNA片段，可用于真核生物基因的获取。目前有两种方法，分别为反转录法和依据蛋白质氨基酸序列推测合成法。
①反转录法：从供体细胞内找出由目的基因转录出来的信使RNA，以该信使RNA为模板，反转录成互补的单链DNA，然后在酶的作用下合成双链DNA，从而获得所需要的基因。优点是专一性强、目的基因中不含内含子。缺点是操作过程复杂，mRNA存在时间短，技术要求高。
②依据蛋白质氨基酸序列推断合成法：根据已知蛋白质的氨基酸序列，推测出相应信使RNA序列，然后按照碱基互补配对原则，推测出其结构基因的核苷酸序列，再通过化学合成的方法，以单核苷酸为原料合成目的基因。优点专一性强，目的基因中不含内含子，可合成自然界不存在的基因。
②组织培养优点：取材少、培养周期短、繁殖率高、便于自动化管理。
③组织培养用途：快速繁殖名贵的花卉和果树；培育无病毒植物(采用根尖、茎尖组织)；获得植物细胞产品；制成人工种子以及转基因植物的培育等。
④植物细胞培养的原理／理论基础：细胞的全能性，属于无性繁殖。
(2)动物细胞培养
(3)动、植物细胞培养的对比
项 目 理论基础/原理 培养基 结果 用途
区别 植物组织培养 细胞的全能性 固体或半固体培养基；植物激素 子代植株 见上述
动物细胞培养 细胞增殖 液体培养基；动物血清 细胞株或细胞系 见上述
联系 都需要人工条件下的无菌操作
2．细胞融合技术
①培养液的成分：葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素、动物血清(类似于内环境成分)。
②动物细胞生长特点：贴壁生长直至贴满即停止分裂，大部分死亡、少部分生存。
③细胞培养用途：生产蛋白制品（如疫苗、干扰素、单抗等）；再造烧伤病人的皮肤；检测毒物毒性；研究病理和药理。
④动物细胞培养的原理／理论基础：细胞增殖。
4．基因工程是把“双刃剑”
基因工程技术的应用在给人们带来福音的同时，暗藏着对人类生存的巨大威胁。如基因工程可以制造超级细菌、超级杂草等；战争狂人、恐怖主义者可制造出难以制服的病原体、生物毒剂即生物武器，进行讹诈和大规模毁灭人类的生物战争；转基因动植物的出现引发物种入侵，有可能破坏原有的生态平衡，对原有物种产生威胁；还有转基因食品安全问题； (二)细胞工程的综合复习
3、基因工程技术的应用
(1)转基因生物 通过转基因技术把某种生物的基因或人工合成的基因转移到另一生物体内，从而培育出对人类有利的生物新品种。如我国科学家1989年将人的生长激素基因导入鲤鱼的受精卵中，培育成了转基因鲤鱼；1995年我国科学家将某种细菌的抗虫基因导入棉花，培育出了抗虫棉；1999年我国上海诞生了转基因牛，其牛奶中含有大量人体蛋白，可以治病。
(3)运载体 在基因工程操作中使用运载体的目的有两个：一是用它作为运载工具，将目的基因转移到宿主细胞中去；二是利用它在宿主细胞内对目的基因进行大量的复制(称为克隆)。现在所用的运载体主要有两类：一类是细菌的质粒，它是一种相对分子质量较小、独立于细菌DNA之外的小型环状DNA，有的细菌中有一个，有的细菌中有多个，质粒能通过细菌间的接合由一个细菌向另一个细菌转移，可以独立复制，也可以整合到细菌DNA中，随细菌DNA的复制而复制；另一类运载体是噬菌体或某些动植物病毒等。现在人们还在不断地寻找新的运载体，如叶绿体或线粒体DNA等也有可能成为运载体。如把外源基因导入叶绿体中，可减少了“基因污染”。作为运载体必须具备三个条件：①在宿主细胞中能保存下来并能大量复制；②有多个限制酶切点，而且每种酶的切点最好只有一个，如大肠杆菌pBR322就有多种限制酶的单一识别位点，可适用于多种限制酶切割的DNA插入；③有一定的标记基因，便于筛选，如大肠杆菌的pBR322质粒携带四环素抗性基因，就可以作为筛选的标记基因。此外，运载体存在对宿主细胞生存没有影响。
(一)基因工程知识小结
1、基因工程的工具
