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两株异养硝化—好氧反硝化细菌的分离、筛选、鉴定和特性研究一、本文概述本文旨在探讨两株异养硝化-好氧反硝化细菌的分离、筛选、鉴定及其特性研究。
异养硝化-好氧反硝化细菌是一类特殊的微生物，能够在好氧条件下进行硝化和反硝化过程，对于氮循环和环境保护具有重要意义。
本文首先通过分离和筛选方法，从自然环境中获取两株具有异养硝化-好氧反硝化功能的细菌，并对其进行初步的生理生化特性分析。
接着，采用分子生物学手段对这两株细菌进行鉴定，明确其分类地位和系统发育关系。
在此基础上，进一步深入研究这两株细菌的生长特性、硝化反硝化性能、以及环境因子对其生长和代谢的影响。
本文的研究结果不仅有助于深入了解异养硝化-好氧反硝化细菌的生物学特性和生态学功能，同时也为该类微生物在环境修复、污水处理等领域的应用提供理论支撑和实践指导。
二、材料与方法为了分离和筛选异养硝化—好氧反硝化细菌，我们从多个不同的生态环境中采集了土壤和水样，包括污水处理厂、河流、湖泊以及农田土壤等。
为了培养和筛选目标细菌，我们使用了多种培养基，包括常规的好氧反硝化培养基和异养硝化培养基。
这些培养基根据细菌的生长特性和需求进行了优化。
实验过程中使用了多种分子生物学试剂，如PCR引物、DNA提取试剂盒等。
同时，还使用了多种仪器，如PCR仪、凝胶电泳仪、微生物培养箱等。
采用稀释涂布法将采集的样品接种到含有相应培养基的平板上，通过观察菌落的形态、大小和颜色等特征，初步筛选出具有异养硝化—好氧反硝化能力的细菌。
通过形态学观察、生理生化特性分析以及分子生物学方法（如16S rDNA序列分析）对筛选出的细菌进行鉴定。
对筛选和鉴定出的细菌进行详细的特性研究，包括生长曲线测定、异养硝化速率测定、好氧反硝化速率测定等。
还研究了环境因子（如温度、pH、碳源和氮源等）对细菌生长和硝化反硝化活性的影响。
实验数据采用统计学方法进行分析，以揭示细菌的生长规律和硝化反硝化特性。
还通过图表等形式直观地展示了实验结果。
高效异养硝化细菌的分离筛选及多样性分析农业生产的发展和人民生活水平的提高，未经适当处理的含氮废水，如生活污水、工业、种植业及禽畜养殖业废水等，大量排放入江河湖泊，造成了越来越严重的水体富营养化问题，危害到农业、渔业、旅游业等诸多行业，对饮水卫生和食品安全也构成了巨大威胁。
近年来，国内外在脱氮微生物菌株的筛选和培育研究方面非常活跃，一些异养硝化菌、好氧反硝化菌、自养反硝化菌、厌氧氨氧化菌等非传统脱氮微生物不断被发现[1-4]，为研究开发经济有效的氮污染物净化技术提供了新的理论和思路。
异养硝化菌是指在好氧条件下能将氨氮或还原态有机态氮氧化成羟胺、亚硝酸盐和硝酸盐的一类微生物。
异养硝化微生物的发现，是对传统硝化理论的丰富与突破，特别是一些异养硝化微生物同时具有好氧反硝化的特性，可实现同步硝化反硝化的全新脱氮工艺。
因此，异养硝化微生物的重要性日益受到关注[7-10]。
异养硝化微生物种类繁多，分布于藻类、放线菌、真菌和细菌中。
由于其遗传背景的差异性，不同的异养硝化微生物的生长及硝化特点都有所不同。
并且异养硝化菌可以利用的基质范围广泛，如铵、胺、酰胺、N-烷基羟胺、肟、氧肟酸及芳香硝基化合物等，这使得异养硝化机理到目前仍不清楚，其代谢途径也未被确定和证实。
从自然环境中分离不同的异养硝化菌，对研究异养硝化途径和异养硝化微生物多样性，以及开发新型高效脱氮工艺具有重要意义。
为此，本研究通过四级富集培养法从生活污水排放渠中分离筛选高效异养硝化细菌，分析其多样性，为异养硝化菌的理论研究和应用研究提供材料。
1 材料和方法1.1 环境样品采集排污沟渠距水面10 cm处的水样以及其附近10 cm深度的土样。
采样后立即用于异养硝化细菌的筛选。
1.2 培养基富集培养基（pH 7.0）：C6H5O7Na3 5.00 g，（NH4）2SO4 1.24 g，KH2PO4 1.00 g，Na2HPO4 7.85 g，NaCl 0.50 g，MgSO4 0.05 g，微量元素溶液 1 mL，补充去离子水至1 L。
高效异养硝化菌的分离鉴定及硝化特性郭万茹㊀崔康平∗㊀郭㊀志㊀陈㊀鹏㊀贾永豪(合肥工业大学资源与环境工程学院,合肥230009)摘要:利用异养硝化培养基从南淝河底泥中分离筛选得到一株具有较高硝化性能的好氧异养硝化细菌XH3㊂根据菌落形态㊁生理生化分析㊁16S rDNA 序列的系统发育分析,对菌株XH3进行鉴定,结果表明,菌株XH3为枯草芽孢杆菌属(Bacillus subtilis.)㊂研究菌株XH3生长特性以及硝化性能,并将该菌应用于黑臭水体进行脱氮处理㊂菌株在培养基中48h 最大氨氮去除率为93.14%,最适培养条件是碳源为柠檬酸钠㊁C /N 比=10,接种量5%㊁温度35ħ㊁pH =8㊂处理实际黑臭水体48h 氨氮最大去除率61.49%㊂实验通过筛选得到的菌株XH3具有较强异养硝化性能且对黑臭水体氨氮具有一定转化率,丰富了在利用异养硝化细菌处理实际污染水体脱氮方面的研究,为解决实际污染水体㊁黑臭水体修复提供理论依据㊂关键词:异养硝化细菌;筛选;鉴定;氨氮;黑臭水体SCREENING AND IDENTIFICATION OF AN EFFICIENT HETEROTROPHICNITRIFYING BACTERIA AND THE STUDY OF ITSNITRIFICATION CHARACTERIZATIONGuo Wanru㊀Cui Kangping ∗㊀Guo Zhi㊀Chen Peng㊀Jia Yonghao(College of Resources and Environmental Engineering,Hefei University of Technology,Hefei 230009,China)Abstract :A heterotrophic nitrifying bacteria XH3with higher nitrification performance was isolated and screened from thesediment of Nanfei River by using heterotrophic nitrification medium.According to the colony morphology,physiological andbiochemical analysis,and phylogenetic analysis of 16S rDNA sequence,the strain XH3was identified.The results showedthat the strain XH3was Bacillus subtilis.The growth characteristics and nitrification performance of strain XH3were studied,and the strain was applied to black odorous water for denitrification treatment.The maximum ammonia-nitrogen removal rate of the strain XH3was 93.14%in the culture medium for 48h,and the optimal conditions were sodium citrate as carbon source,C /N ratio =10,inoculation amount 5%,temperature 35ħ,pH =8.The maximum removal rate of ammonia nitrogen was61.49%after 48h treatment.Keywords :heterotrophic nitrifying bacteria;screening;identification;ammonia nitrogen;polluted water㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀收稿日期:2019-10-30第一作者:郭万茹(1996-),女,硕士研究生,主要研究方向为环境微生物㊂gwr1002039127@∗通信作者:崔康平(1969-),男,博士,教授,主要研究方向为水处理技术和水污染环境修复技术㊂cuikangping@0㊀引㊀言近年来,河流水体污染问题日益突出,2018年全国地表水监测的1935个水质断面(点位)中,劣Ⅴ类比例为6.7%(环境保护部,2018)㊂氮元素污染物是造成水体中污染的重要原因之一[1],过量的氮元素导致水体透明度降低,水体环境恶化,严重影响水体中动植物的生存,水体中氮元素的去除引起了广泛的关注㊂虽然世界各国在废水氨氮污染的治理上投入大量精力,但河流中氨氮污染情况仍然明显存在[2]㊂南淝河作为巢湖入河污染量最大的河道,总氮污染占到流域总入湖量的三分之一以上,因此南淝河的污染治理对改善巢湖水质起到了极为关键的作用㊂生物脱氮技术(BNR)由于效率高㊁成本低㊁不会造成二次污染在污水处理中受到广泛应用[3]㊂在传统生物脱氮系统中,通常从氨氮(NH +4)开始,通过自养硝化细菌在有氧条件下转化为硝酸盐(NO -3)㊁亚硝酸盐(NO-2),最后通过异养反硝化细菌在厌氧条件下转化为氮气(N2)达到从系统中去除的目的[4]㊂但传统自养硝化细菌生长缓慢㊁脱氮效果不明显,难以形成优势菌种;相反,异养硝化细菌具有生长速度快㊁对高浓度氨氮适应性强和脱氮效率高等优点,并且异养硝化细菌能够同步进行有机物降解㊁硝化作用㊁反硝化作用,成为近年来河流脱氮的热点[1]㊂自20世纪70年代起,Verstraete等人成功分离第一株异养硝化菌Arthrobacter sp[5]㊂以及Roberston等人首次发现兼具异养硝化好氧反硝化能力的菌Paracoccus之后[6],许多异养硝化好氧反硝化菌株被分离出来并作为生物脱氮技术的潜在微生物进行深入的研究[7],如不动杆菌属(Acinetobacter sp.)[6],假单胞菌属(Pseudomonas stutzeri)[8],副球菌属(Paracoccus sp.)[1],芽孢杆菌属(Bacillus sp.)[9]等㊂本文通过从南淝河底泥中分离筛选出一株具有高脱氮效率的异养硝化细菌,具有较强异养硝化能力,命名为XH3㊂通过生理生化特性测定和16S rDNA鉴定,判定该菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis.)㊂同时对脱氮过程中菌株的生长趋势和脱氮情况进行了分析并探究了XH3在不同条件下的脱氮效率,深入了解XH3的脱氮特性,并将其分离菌株应用于受污染的南淝河水体,对其脱氮效果进行评价,为脱氮菌株的实际应用及理论研究奠定基础,为南淝河水体治理提供新思路㊂1㊀材料与方法1.1㊀材料1.1.1㊀实验样品南淝河中氮元素有机质含量较为丰富,满足异养硝化菌生长条件及环境,故异养硝化菌筛选所用样品为南淝河河底10cm以内底泥沉积物㊂1.1.2㊀培养基异养硝化细菌富集培养基:Na3C6H5O7㊃2H2O 2.17g,(NH4)2㊃SO40.5g,K2HPO40.8g,MgSO4㊃7H2O0.4g,NaCl0.4g,FeSO4㊃7H2O0.04g,CaCl2㊃H2O0.03g,定容至1L,pH7.0~7.2;加入20g琼脂即成固体培养基㊂异养硝化细菌分离培养基:Na3C6H5O7㊃2H2O 2.17g,(NH4)2㊃SO40.5g,K2HPO40.6g,MgSO4㊃7H2O0.2g,NaCl0.4g,FeSO4㊃7H2O0.04g,定容至1L,pH7.0~7.2;加入20g琼脂即成固体培养基㊂所有培养基使用前均在121ħ湿热灭菌30min㊂1.2㊀方法1.2.1㊀高效异养硝化菌富集与筛选取南淝河底泥沉积物接种于无菌水中,摇床培养3h,取出静置㊂将菌悬液接种至150mL灭菌后的异养硝化菌富集培养液中,相同条件下培养48h㊂取富集菌液进行梯度稀释后,采用稀释涂布平板法接种至异养硝化菌分离固体培养基中培养48h后,观察菌落形态,挑选典型菌落在平板上进行划线分离,为纯化所筛菌株,进行多次划线分离㊂将分离纯化后得到的单一菌株接种至锥形瓶中异养硝化细菌培养基进行摇床培养,测定培养基中氨氮浓度,筛选出氨氮去除率最高的菌株进行下一步实验㊂1.2.2㊀菌株鉴定观察培养基上单菌落形态,通过革兰氏染色在显微镜下观察菌株形态以及革兰氏染色情况,采用酚-氯仿-异戊醇法提取硝化菌XH3基因组DNA,以基因组DNA为模板扩增16S rDNA,扩增引物为细菌通用引物27f及1492R,测序所得16S rDNA序列,应用BLAST,与NCBI数据库中已知菌种序列进行同源性分析,系统发育树构建采用MEGA4软件完成㊂1.2.3㊀脱氮性能探究1)菌株脱氮曲线及生物量测定㊂将初筛菌株以5%接种量接种至锥形瓶中液体分离培养基,于35ħ㊁180r/min恒温摇床培养48h,每隔4h取样,检测培养液中光密度(OD600)㊁NH+4-N㊁NO-3-N以及NO-2-N的含量,测定菌株脱氮曲线以及生物量㊂2)菌株脱氮性能影响因素㊂为探究碳源㊁C/N比㊁接种量㊁温度㊁初始pH以及初始氨氮浓度对优势菌株脱氮性能的影响,确定优势菌株最佳培养生长条件,在上述实验接种和培养基的基础上,设计系列单因素实验:1)碳源种类:柠檬酸钠㊁丁二酸钠㊁琥珀酸钠㊁葡萄糖㊁蔗糖;2)C/N比: 2㊁6㊁10㊁15㊁20;3)接种量:1㊁3㊁5㊁7㊁10%;4)培养温度:10㊁20㊁30㊁35㊁40ħ;5)初始pH:5㊁6㊁7㊁8㊁9;6)初始氨氮浓度:25,500,1000,1500mg/L,在180r/min 条件下恒温振荡培养48h,定期取样测定培养液氨氮含量㊂3)菌株对黑臭水体处理效果㊂于春季采集南淝河水样,样品采集后4ħ保存备用,取样点水样COD均值为39.76mg/L,氨氮浓度为10.07mg/L,将筛选得到具有较强异养硝化能力的菌株接种至液体培养基,培养至对数期,取适量菌液离心后用生理盐水清洗两遍,然后直接投加至装受污染水体的锥形瓶中,在35ħ㊁180r /min 条件下恒温振荡培养48h,每隔8h 取样,测定培养液中光密度以及氨氮浓度㊂将菌种以相同方式投加至装有黑臭水体的锥形瓶中,向被污染河水中投加定量柠檬酸钠,定时检测培养液中光密度及氨氮浓度㊂1.3㊀分析方法OD600通过在600nm 处吸光度表示;NH +4-N 通过纳氏试剂光度法测定;NO -3-N 采用酚二磺酸光度法测定;NO -2-N 通过N -(1-萘基)-乙二胺光度法测定㊂氨氮转化率通过公式(1)计算得出:T =(N 0-N x )/N x ˑ100%(1)式中:T 为氨氮转化率;N 0表示培养液中初始氨氮浓度,mg /L;N x 表示培养液中任一时间的氨氮浓度,mg /L㊂2㊀结果与讨论2.1㊀异养硝化菌的筛选以南淝河底泥为菌种来源,通过稀释涂布平板法和划线分离法初步得到能够在硝化细菌固体分离培养基上生长的7株菌株㊂将初筛的7株菌株以5%接种量分别接种至100mL 硝化细菌液体培养基中,在35ħ㊁180r /min 条件下培养,检测其NH +4-N 的浓度㊂通过图1可以看出,初筛得到的7株菌株均有一定的氨氮降解能力,以0号未接种菌种的空白培养液做对比发现,3号㊁7号菌株氨氮降解能力较强,均达到80%以上,菌株生长能力较为旺盛,3号菌株对氨氮的去除效率最高,高达93.51%㊂因此挑选3号菌株斜面保存,作为本实验后续研究对象,并命名为XH3㊂图1㊀初筛硝化细菌脱氮率对比2.2㊀菌株鉴定通过分离筛选得到7株异养硝化菌株,选取硝化性能最好的菌株XH3进行后续实验㊂图2为菌株XH3菌落形态,菌株形态小而突起或大而平坦,呈圆形,边缘整齐,颜色灰白不透明,表面湿润光滑且粘稠,革兰氏染色呈阳性㊂对菌株进行16S rDNA 测序,所得序列通过BLAST 对比,发现与枯草芽孢杆菌具有99%相似度,构建系统发育树如图㊂图2㊀菌落形态图图3㊀菌株XH3的16S rDNA 基因系统发育树2.3㊀菌株脱氮性能研究2.3.1㊀菌株脱氮曲线及生物量测定将初筛菌株XH3以5%接种量接种于硝化细菌液体培养基中,定期取样,检测其培养液中光密度(OD600)以及NH +4-N㊁NO -3-N 以及NO -2-N 的含量,测定菌株脱氮曲线以及生物量,分析菌株XH3生长趋势以及氨氮转化情况㊂如图4所示,XH3生长呈现4个不同的阶段:适应期㊁对数增长期㊁稳定期㊁衰亡期㊂菌株在接种后4h 为生长延滞期,在4h 后生长迅速进入对数增长期,到24h 生物量达到最大值,随即进入稳定期和衰亡期,由此看出菌体XH3生长能力旺盛,能够在短暂时间内进入对数增长期㊂除此之外,可以看出XH3的氨氮降解速率在8h 前呈现缓慢的状态,之后,氨氮迅速下降,在28h 时氨氮浓度达到最低,氨氮去除率为93.14%,28h 后氨氮浓度略有升高,可能由于培养基中营养物质大量减少,细菌死亡,造成氨氮去除率降低且氨氮稍略有升高的现象[10]㊂从图中可以看出,氨氮去除主要发生在对数期且稍有滞后,该结果与目前研究得出的异养硝化菌脱氮作用主要发生在对数期的结果基本一致[1,2,8-10]㊂另外,菌株XH3培养过程中,在氨氮短时间内大量去除的同时,硝酸盐氮和亚硝酸盐氮并没有大量积累,而是维持在低浓度的水平,这与Yang 等人研究的Acinetobacter sp.JR1类似[11],表明本研究筛选所得菌株XH3具有异养硝化能力㊂图4㊀菌株XH3生长曲线及氨氮转化动力学曲线2.3.2㊀碳源对菌株脱氮性能影响碳源作为微生物能量的重要来源,碳源种类直接影响微生物生长及代谢活动,且不同菌株对不同有机碳源的利用情况有较大差异[1],从而影响微生物脱氮效率㊂图5为菌株XH3对不同有机碳源的利用情况㊂从图5可以看出,XH3以柠檬酸钠㊁丁二酸钠㊁琥珀酸钠㊁葡萄糖㊁蔗糖为唯一碳源时,对氨氮均具有一定的去除效果,但小分子碳源更有利于XH3吸收利用㊂XH3在以柠檬酸钠㊁丁二酸钠㊁琥珀酸钠为碳源时,脱氮率显著高于其他碳源,分别为87.44%㊁77.36%㊁75.11%㊂其中,XH3在以柠檬酸钠为唯一碳源,氨氮去除率最高,在32h 达到85.40%,期间最大去除速率为7.08mg /(L ㊃h)㊂而蔗糖作为大分子碳源不能很好被XH3吸收利用,氨氮去除率仅为39.60%㊂通过XH3对碳源的利用情况可以看出,碳源类型对菌株异养硝化活性至关重要[12],小分子碳源更易于被XH3同化利用,更有利用菌株异养硝化作用[13],这与胡杰等的Pseudomonas sp.WUST7[14]的研究结果保持一致㊂在处理实际水样时,也可以通过补给小分子碳源的方式,提高菌株的异养硝化性能,促进脱氮效率[15]㊂通过分析碳源对菌株XH3脱氮性能的影响,发现柠檬酸钠更有利于菌株XH3的生长代谢,故选取柠檬酸钠作为XH3异养硝化的最佳碳源㊂图5㊀碳源对菌株XH3脱氮性能影响2.3.3㊀C /N 对菌株脱氮性能影响图6㊀C /N 对菌株XH3脱氮性能影响由于XH3为异养硝化菌,在脱氮同时也要消耗有机物,碳源不足时,没有足够能源供菌体生长,进而影响菌体脱氮效率[16],所以一定范围内提高C /N 会提高硝化菌的氨氮去除率㊂通过调整培养基中柠檬酸钠含量改变C /N,分析不同C /N 对菌株XH3对氨氮去除效率,结果如图6㊂C /N =2时,去除率仅为49.85%,当C /N 持续上升,菌株对氨氮降解能力明显增强,当C /N =10时,去除率达到最大为82.22%㊂继续提高C /N,可以发现氨氮去除率几乎不变或略有降低,这与王弘宇等研究Pseudomonas sp.C3发现在最佳C /N 时,持续提高C /N,脱氮率基本没有变化的结论一致[17]㊂通常在实际废水的处理中,高C /N 会造成出水COD 过高,影响水质,所以在实际处理中要考虑选取最合适㊁最经济的C /N [18],通过图6可以看出,C/N=10已达到最大氨氮去除率,进一步提高C/N,脱氮效果提升不显著,所以C/N10已可满足XH3硝化过程对C/N要求,故选择C/N为10最为合适且经济㊂2.3.4㊀接种量对菌株脱氮性能影响接种量的大小会影响培养液中生物量浓度,进而影响菌株生长繁殖[19]㊂高浓度生物量会使菌体在短时间内提高脱氮率,而接种量过低则会导致菌体适应期延长,影响脱氮率㊁延长脱氮时间[20]㊂由图7可以看出,菌株以不同接种量接种培养后,对培养液中氨氮均有一定程度的去除,但是当接种量为1%时,接种量过小,培养液中生物量过少,菌株适应期延长,氨氮去除率低仅为46.00%;逐步提高菌种接种量,菌株对氨氮的去除率提高,在接种量为5%时,氨氮去除率在48h达到最高,为81.26%;而当接种量继续增加时,生物量增加,氨氮在短时间内大量去除,接种量为7%和10%时,16h氨氮去除率分别为48.23%和54.19%,相较接种量为5%时16h氨氮去除率有明显提升,但由于生物量过大,培养基中营养物质大量消耗,制约菌体继续生长,且会使菌体发生自溶,导致菌体活性降低,从而导致16h后氨氮去除速率降低㊂图7㊀接种量对菌株XH3脱氮性能影响2.3.5㊀温度对菌株脱氮性能影响温度高低直接影响微生物生长活动及代谢,温度过高或过低都会影响菌株的酶活性,导致微生物生长代谢缓慢或停滞生长,进一步影响菌株的脱氮效果[21]㊂另外每个微生物最适温度各不相同,图8反映了XH3脱氮性能和温度之间的关系㊂由图8可以看出,菌株XH3适应温度范围广,在10ħ到40ħ范围内均能生长,并对氨氮有一定的去除效果㊂当温度为10ħ时,菌株生长相对缓慢,酶活性受到影响,对氨氮去除能力最差,去除率仅为26.58%,当温度逐渐提高,菌株脱氮能力提高,在35ħ时达到最高氨氮去除率为75.71%㊂而当温度继续上升至40ħ时,由于温度过高,此时菌株的内源呼吸率增大,衰减系数增大,导致XH3脱氮能力有所下降[22]㊂图8㊀温度对菌株XH3脱氮性能影响2.3.6㊀初始pH对菌株脱氮性能影响图9㊀初始pH对菌株XH3脱氮性能影响初始pH值影响菌株酶活性㊁菌体细胞的结构以及菌株对营养物质吸收,进而影响菌株对氨氮的降解率[22]㊂为了探究初始pH对XH3硝化性能的影响,设置初始pH为5㊁6㊁7㊁8㊁9,XH3脱氮动力学曲线如图9所示㊂由图9可以看出,XH3在pH值5~9时,均可以良好生长且对氨氮具有一定降解率㊂但当pH 为弱酸性时,XH3降解率较低均小于50.00%㊂随着pH升高,XH3降解率提高,在pH=8时,菌株XH3对氨氮去除率达到最大为83.10%,这可能是因为硝化过程产酸,弱碱性环境更有利硝化反应的进行,继续提高pH,氨氮去除率随之下降,这是因为过高pH会影响菌株生长,从而造成氨氮去除率下降㊂本次实验结果表明,弱碱性环境更适应于菌株XH3的生长代谢,有利于硝化过程的进行,这与huang等研究结论一致[23],但当培养基碱性过大,会抑制菌体生长及酶活,影响菌株硝化性能,故选择pH=8作为菌株XH3培养的最适pH㊂2.3.7㊀NH+4-N负荷对菌株脱氮性能影响不同初始NH+4-N浓度对菌株XH3的脱氮性能影响如图10所示㊂菌株XH3具有较广的氨氮适应范围,在25~1500mg/L范围内均可正常生长,且均表现出较为良好的硝化性能㊂当初始氨氮浓度低于500mg/L时,菌株表现出较好的硝化性能,对氨氮的去除率均能达到80.00%以上,氨氮浓度继续升高时,菌株脱氮能力下降,氨氮去除率降低,在初始氨氮浓度1000mg/L和1500mg/L时,氨氮去除率为75.54%和60.86%,但氨氮去除速率仍保持增大趋势,此时氨氮去除率较低的原因可能是处理时间不足[24]㊂上述实验结果表明,虽然菌株XH3具有较广的氨氮适应范围,但是在高浓度氨氮条件下,菌株表现出的脱氮性能有所下降,但较高的氨氮降解速率使XH3具有潜在处理高浓度氨氮废水的工程应用价值[25]㊂图10㊀初始NH+4-N对菌株XH3脱氮性能影响2.3.8㊀XH3对黑臭水体处理效果通过上述实验发现,菌株XH3在不同探究条件下对液体培养基中的氨氮均有较好去除率,但是菌株XH3在实际污水中能否生存且具有良好去除效果及其对污水的耐受程度直接影响菌株XH3的工程应用前景㊂因此,我们用菌株对南淝河水体进行处理,结果如图㊂氨氮空白组为取自南淝河的水体样品,不做处理㊂氨氮实验组为接种菌体XH3的南淝河水体,氨氮对照组为接种菌体XH3且加入柠檬酸钠碳源的南淝河水体,OD600为氨氮实验组菌体生物量㊂取样点水样初始氨氮为10.07mg/L,实验组中,由于菌泥携带少量培养基,导致接种后初始氨氮浓度高于对照组的现象,但菌株在有机物相对缺乏的河水中仍能正常生长,菌株XH3接种至河水后至16h,为细菌生长适应期,菌株XH3在此阶段逐步适应贫瘠营养环境,随后,菌株数量随时间推移呈上升趋势,菌株开始大量繁殖,其生长情况与河水氨氮降解过程保持一致,证明河水中氨氮去除的主要原因是微生物同化作用[26]㊂32h后微生物进入衰亡期,菌株XH3逐渐减少,说明培养环境中有机物㊁氨氮不能满足微生物生长繁殖的需要,与此同时,氨氮降解过程减缓,去除速率降低,48h氨氮去除率为32.85%,虽然菌株XH3对实际河水有部分去除率,但仍远低于在培养基中对氨氮的去除㊂因此设置对照组,通过添加小分子碳源柠檬酸钠,促进微生物脱氮过程,在加入柠檬酸钠后, 48h脱氮率由32.85%提高至61.94%㊂进一步证明实际河水中可能缺乏能够被XH3利用的有机物,菌株XH3脱氮过程对小分子碳源依赖性较强㊂实验证明在实际废水处理时,通过投加小分子碳源的方式可以大幅提高菌株硝化性能,提升氨氮去除率[27]㊂图11㊀菌株对实际水体处理效果图3㊀结㊀论1)通过富集培养和平板划线法,从南淝河底泥中筛选出一株具有异养硝化性能的菌株XH3,通过对XH3进行生理生化鉴定和生物学鉴定,判断XH3为枯草芽孢杆菌㊂2)通过探究XH3脱氮特性,发现XH3硝化作用主要发生在对数增长期,24h内,氨氮浓度可由146.20mg/L下降到10.02mg/L,去除率达到93.14%,且在硝化过程中,几乎没有硝酸盐氮及亚硝酸盐氮的积累,具有良好异养硝化性能㊂在探究XH3培养条件时发现:XH3最佳碳源为柠檬酸钠,最适C/N比为10,菌株XH3对温度㊁pH具有较广的适应范围,最适温度为35ħ,最适pH为8㊂3)将菌株XH3通过直接投加方式处理实际黑臭水体,由于实际水体营养物质相对缺乏,脱氮率较低,但投加柠檬酸钠后,48h脱氮率由32.85%提升至61.49%,表明菌株对小分子碳源具有较强依赖性,补充充足小分子碳源时,菌株硝化性能增强,脱氮效率提升㊂本文研究筛选的菌株XH3在培养基中对氨氮去除率最高达93.14%,表现出较好的异养硝化性能,与国内外报道的异养硝化能力优异的菌株不相上下㊂菌株XH3对黑臭水体氨氮的转化,丰富与拓展了在利用异养硝化细菌处理实际污染水体脱氮方面的研究,为解决实际污染水体㊁黑臭水体修复提供理论依据㊂今后工作应该对脱氮条件进行进一步优化㊁完善以异养硝化菌为主体的各种脱氮方式,指导异养硝化细菌在工程上更深层次的应用㊂参考文献[1]㊀潘丹,黄巧云,陈雯莉.两株异养硝化细菌的分离鉴定及其脱氮性质[J].微生物学报,2011,51(10):1382-1389. 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[26]㊀黄郑郑,曹刚,陈海升,等.异养硝化-好氧反硝化菌协同竞争对脱氮特性的影响[J].环境科学研究,2017.30(5):765-767.[27]㊀LIU Y X,WANG Y,Li Y,et al.Nitrogen removal characteristicsof heterotrophic nitrification-aerobic denitrification by Alcaligenesfaecalis C16[J].Chinese Journal of Chemical Engineering,2015,23(5):827-834.。
1 施工期污染物排放及治理措施分析项目在成都市简阳城南工业园区内建设，建设过程中不涉及砍伐古树。
主要施工内容包括土方、基础、结构和设备安装几个阶段。
土方阶段主要施工内容包括场地填垫土、管网铺设、地面硬化等。
基础阶段主要施工内容包括建筑物桩基的修建。
结构和设备安装阶段主要工程相对土方和基础施工来说对环境影响较轻。
根据上述施工特点，本项目对环境的影响以土方阶段最大，基础阶段次之，结构和设备安装阶段对环境影响不明显。
工程施工中对周围局部区域环境会产生一定的影响。
在采取报告提出的施工期污染防治措施后，能将项目施工建设对外环境的影响降至最低。
1.1 施工期大气环境影响预测与评价工程施工期由于挖掘机、搅拌机、运输车辆等机具的使用会产生一定量的扬尘，对环境空气质量有一定的负面影响。
为了将产生的影响减小到最小，施工中应严格按照有关规定执行，采取切实有效的措施做到：①施工中采用密目安全网全封闭施工，以减少扬尘对环境空气的影响；②施工中应尽量减少建筑材料运输过程中的洒漏，运输车辆装截量适当，尽量降低物料输运过程中的落差，适当洒水降尘，减少扬尘对环境空气的影响；③进出场路面硬化，及时清除路面渣土。
另外，工程施工中燃油机械的使用，会产生少量的含油废气，但产生量极小，且施工场地形开阔，污染扩散条件，对环境空气的影响较小。
因此，施工期间建设方做到了文明施工、清洁施工和科学施工，减少了扬尘的产生量，项目施工期废气对周围环境敏感点影响较小。
1.2 施工期水环境影响预测与评价项目施工期产生的施工废水全部回用，项目施工期废水主要为施工人员生活污水，主要污染因子为SS、COD Cr、BOD5和NH3-N，依托周边企业及园区内已建预处理池处理后，经园区已建管网送简阳城南污水处理厂处理。
因此，项目建设施工期未对地表水环境造成影响，正常情况下施工不会对地下水造成污染。
1.3 施工期声环境影响预测与评价由于施工作业，工程机械（挖掘机、振动碾、运输车辆等）将产生噪声，噪声源强80~95dB，属间断性噪声。
异养硝化细菌LW的筛选及其硝化性能研究作者：范宝芸来源：《科技创新与生产力》 2013年第12期范宝芸（太原理工大学，山西太原030024）摘要：从焦化废水活性污泥中分离纯化出一株异养硝化细菌LW。
该菌株为革兰氏阴性短杆菌，无芽孢，无鞭毛；菌落为白色圆形，半透明，边缘整齐。
通过对该菌株进行硝化性能研究，证实NH4+-N去除率高达95%以上，TN和CODcr去除率分别为70.97%和91.01%。
在NH4+-N去除过程中有明显的亚硝酸盐积累。
通过对该菌株影响因素的研究表明，在pH 值为7～8、温度为30℃条件下,该菌株对氨氮去除能力较强。
研究表明，异养硝化细菌LW适应能力较高，因此具有一定的工业应用价值。
关键词：异养硝化细菌；硝化性能；菌株；焦化废水；生物活性污泥中图分类号：X172；X52文献标志码：ADOI：10.3969/j.issn.1674-9146.2013.12.095焦化废水主要产生于炼焦及煤气净化过程，成分复杂并且难以降解。
主要包括氨、氰化物、硫氰酸盐，和许多有毒的有机污染物[1-2]。
其中，氨氮浓度最高。
高浓度的氨氮会引起水体富营养化，消耗水中的氧，进而对水生生物产生直接的毒性作用[3]。
此外，苯酚也是焦化废水中有毒污染物之一，异养细菌在降解苯酚时需氧量较高，会间接抑制异养细菌的硝化作用[4]。
虽然污水脱氮技术种类很多，但生物活性污泥处理法是应用最广泛、成本较低的污水处理方法[1]。
传统的生物脱氮主要由好氧型自养硝化菌与厌氧型反硝化菌共同完成。
但这种方法有很多的弊端，如自养硝化菌生长缓慢，容易受到有机物与高浓度氨氮的抑制影响等。
与自养菌相比较，异养硝化菌生长代谢所需溶解氧较低，细胞产量高[5]。
近年来研究有Joo等筛选出来的异养硝化细菌Alcaligenes faecalis No.4，NH4+-N浓度约为1 200 mg/L时，NH4+-N去除速率最大达到28.9 mg/（L·h）；Kim等从人粪便堆中分离得到的24株芽孢杆菌属（Bacillus）菌株，溶解氧与碳氮比分别为30%、8时，NH4+-N去除率可达到90%；陈昢圳等分离纯化得到的嗜吡啶红球菌（Rhodococuus pyridinivorans），在异养硝化过程中，总氮去除率可达到98.70% [5-7]。
![异养硝化细菌的筛选方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s1/m/715bd0bb85868762caaedd3383c4bb4cf7ecb707.png)
[19]中华人民共和国国家知识产权局[12]发明专利申请公开说明书[11]公开号CN 1884480A [43]公开日2006年12月27日[21]申请号200610010263.6[22]申请日2006.07.07[21]申请号200610010263.6[71]申请人哈尔滨工业大学地址150001黑龙江省哈尔滨市南岗区西大直街92号[72]发明人马放 苏俊峰 杨基先 [74]专利代理机构哈尔滨市松花江专利商标事务所代理人荣玲[51]Int.CI.C12N 1/20 (2006.01)C02F 3/00 (2006.01)权利要求书 1 页 说明书 4 页[54]发明名称异养硝化细菌的筛选方法[57]摘要异养硝化细菌的筛选方法，属于污水处理技术领域。
本发明的目的是采用筛选异养硝化菌的方法，从生物学角度实现异养硝化现象，该技术是实现短程同步硝化反硝化的先决条件。
本发明按照下述步骤进行：1.微生物富集培养；2.从牛肉膏蛋白胨固体培养基中挑取单菌落，接种于氨化培养基中培养、纯化；3.从氨化培养基固体培养基中挑取单菌落，接种于亚硝化培养基中培养、纯化，获得异养硝化细菌。
本发明所筛选的异养硝化细菌仅可以利用氨氮作为唯一的氮源的培养基上进行生长繁殖，而且可以在亚硝酸盐作为唯一氮源的培养基中正常生长繁殖，对环境有较强的适应能力，在实际工程应用中有较大的发展潜力。
200610010263.6权 利 要 求 书第1/1页1、一种异养硝化细菌的筛选方法，其特征在于所述筛选方法为：一、微生物富集培养：将水样静置弃去上清液，取活性污泥接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，接种量为5～10％，在30～35℃、120～140rpm的条件下恒温振荡培育，目测培养液混浊度增加时，将富集培养液接种于牛肉膏蛋白胨固体培养基平板中，30℃温箱培养2～3d，挑取单菌落转接于斜面试管上，再将具有不同性状的菌落在牛肉膏蛋白胨固体培养基平板上划线纯化，平板倒置温箱2～3d，重复以上操作，直至分纯；二、从牛肉膏蛋白胨固体培养基中挑取单菌落，接种于氨化培养基液体培养基中，接种量为5～10％，在30～35℃、120～140rpm的条件下恒温振荡培育，目测培养液混浊度增加时，将富集培养液接种于氨化培养基固体培养基平板中，30～35℃温箱培养2～3d，挑取单菌落转接于斜面试管上，再将具有不同性状的菌落在氨化培养基固体培养基平板上划线纯化，平板倒置温箱2～3d，重复以上操作，直至分纯；三、从氨化培养基固体培养基中挑取单菌落，接种于亚硝化培养基液体培养基中，接种量为5～10％，在30～35℃、120～140rpm的条件下恒温振荡培育，目测培养液混浊度增加时，将富集培养液接种于亚硝化培养基固体培养基平板中，30～35℃温箱培养2～3d，挑取单菌落转接于斜面试管上，再将具有不同性状的菌落在亚硝化培养基固体培养基平板上划线纯化，平板倒置温箱2～3d，重复以上操作，直至分纯，获得异养硝化细菌。
异养硝化细菌的分离及其硝化特性实验研究
异养硝化细菌的分离及其硝化特性实验研究
摘要：采用将传统微生物学方法与现代分子生物学手段相结合的新型异养硝化细菌的分离筛选方法,从具有80.1%的SND效果的MBR 系统中分离筛选出2株异养硝化细菌,通过生理生化实验、16S rDNA 的序列分析,认定为属新报道的异养型硝化细菌.通过批式试验考察了分离纯化得到的异养硝化细菌的硝化性能.结果表明,Bacillus sp.LY及Brevibacillus sp.LY具有异养微生物的'性质,在充分利用有机碳进行有氧呼吸的同时还具有较强的硝化及脱氮能力:24d好氧培养后,COD的去除率分别为71.7%及52.6%;氨氮的转化率分别为78.2%及51.2%;总氮的转化率分别为69.2%及35.6%.作者：林燕孔海南何义亮严立李春杰 LIN Yan KONG Hai-nan HE Yi-liang YAN Li LI Chun-jie 作者单位：上海交通大学环境科学与工程学院,上海,200240 期刊：环境科学ISTICPKU Journal：ENVIRONMENTAL SCIENCE 年，卷(期)：2006, 27(2) 分类号：X703.1 关键词：分离 Bacillus sp.LY Brevibacillus sp.LY 异养硝化硝化特性。
异养硝化细菌硝化途径及氮转化功能研究进展异养硝化细菌硝化途径及氮转化功能研究进展引言：氮是生命体内不可或缺的重要元素之一，在自然界中广泛存在。
氮的转化过程对于维持生态平衡和生物多样性的稳定发挥着关键作用。
而异养硝化细菌是氮转化过程中的重要参与者之一，其通过硝化途径将氨氮转化为亚硝酸盐和硝酸盐，为生物有效氮的循环提供了必要的步骤。
本文将综述异养硝化细菌硝化途径及其氮转化功能的研究进展。
一、异养硝化细菌的分类异养硝化细菌主要分为亚硝酸盐氧化菌（Nitrite-oxidizing Bacteria, NOB）和氨氧化菌（Ammonia-oxidizing Bacteria, AOB）两大类。
其中亚硝酸盐氧化菌通过将氨氧化生成的亚硝酸盐进一步氧化为硝酸盐，如亚硝酸盐氧化古菌（Nitrosoarchaeum, NOA）。
而氨氧化菌则直接将氨氧化为亚硝酸盐，如氨氧化古菌（Nitrosococcus, NC）。
二、硝化途径的研究进展1. 亚硝酸盐氧化菌的硝化途径亚硝酸盐氧化菌的硝化途径一直备受研究者关注。
早期研究发现，亚硝酸盐氧化菌通过亚硝酸还原途径将亚硝酸盐氧化为氨，从而完成硝化过程。
然而，随着研究的深入，发现有些亚硝酸盐氧化菌无法利用亚硝酸还原途径进行硝化，于是人们提出了其他的硝化途径。
如最新的研究表明，一些亚硝酸盐氧化菌可能通过反硝化途径将亚硝酸盐氧化为氮气，具有更高的氮转化效率。
这为后续的硝化途径研究提供了新的思路。
2. 氨氧化菌的硝化途径氨氧化菌的硝化途径相对来说已经研究得比较清楚。
在氨氧化过程中，氨氧化酶（Ammonia Monooxygenase, AMO）是关键的催化酶。
它将氨氧化为亚硝酸盐，并产生大量的氧自由基。
亚硝酸盐之后通常由亚硝酸盐氧化酶（Nitrite Oxidoreductase, NXR）进一步氧化为硝酸盐。
不同种类的氨氧化菌可能具有不同的硝化途径，但这一领域仍需进一步研究来明确。
1株高温异养硝化细菌的分离鉴定和特性研究曹喜涛1,常志州23,黄红英2,沈中元1,徐莉1 (1.中国农业科学院蚕业研究所,江苏镇江212018;2.江苏省农业科学院农业资源与环境研究所,江苏南京210014)摘要 从高温堆肥中分离出1株高温异养硝化细菌。
菌株经革兰氏染色为阴性,无荚膜,有芽孢的杆菌。
根据形态、生理特征将该菌株初步鉴定为芽孢杆菌属(Bacillus spp),经研究发现该菌株以乙酰胺为唯一碳源和氮源时,能通过氨化和硝化作用产生亚硝酸。
关键词 异养硝化细菌;分离;硝化作用中图分类号 Q936 文献标识码 A 文章编号 0517-6611(2006)19-4833-02Isolation,Identification and Ch aracterization of the Thermophilic H eterotrophic N itrifierCAO X i2tao et al (T he Sericultural Research Institute,Chinese Academ y of Agricultural Sciences,Z henjiang,Jiangsu212018)Abstract A therm ophilic heterotrophic nitrifier was is olated from the high tem perature com posting sam ples.T he strain was gram negative,sporulating and rod shaped bacterium,and identified to belong to therm ophilic Bacillus spp.It could amm onize organic nitrogen com pounds and nitrify amm onia itself when it grew on acetam ide com panying the form ation of amm onia and nitrite.K ey w ords H eterotrophic nitrifier;Is olation;Nitrification 氨氮是引起水体富营养化的物质之一,而硝化作用是自然界氮素循环的一个重要环节,在石油、化工、化肥等行业中,外排含氮废水大多具有高温、高盐的特点。
异养硝化细菌的分离及其硝化特性实验研究林燕,孔海南,何义亮,严立,李春杰(上海交通大学环境科学与工程学院,上海 200240)摘要:采用将传统微生物学方法与现代分子生物学手段相结合的新型异养硝化细菌的分离筛选方法,从具有8011%的SND 效果的MBR 系统中分离筛选出2株异养硝化细菌,通过生理生化实验、16S rDNA 的序列分析,认定为属新报道的异养型硝化细菌.通过批式试验考察了分离纯化得到的异养硝化细菌的硝化性能.结果表明,Bacillus sp.LY 及Br evibacillus sp.LY 具有异养微生物的性质,在充分利用有机碳进行有氧呼吸的同时还具有较强的硝化及脱氮能力:24d 好氧培养后,COD 的去除率分别为7117%及5216%;氨氮的转化率分别为7812%及5112%;总氮的转化率分别为6912%及3516%.关键词:分离;Bacillus sp.LY;Brevibacillus sp.LY;异养硝化;硝化特性中图分类号:X70311 文献标识码:A 文章编号:025023301(2006)022*******收稿日期:2005202204;修订日期:2005203228基金项目:国家自然科学基金项目(20176027)作者简介:林燕(1976~),女,博士,主要从事废水生物处理方面的研究,E 2mail:li nyansjtu@Isolation and Characterization of Heterotrophic Nitrifying BacteriaLIN Yan,KONG H ai 2nan,HE Yi 2liang,YAN Li,LI Chun 2jie(School of Envir onmental Science and Engineering,Shanghai Jiaotong University,Shanghai 200240,China)Abstr act:Met hod of isolating the het erotrophic nitrifiers and the characterizat ion of the heterotrophic nitrification were studied.Two heterotrophic nitr ifiers were newly isolated fr om a membrane bioreactor (MBR)in which the TN removal efficiency was 8011%.The batch test results indicat e that Bacillus sp.LY and Brevib a cillus sp.LY could utilize the organic carbon as the source of assimilation when t hey grew on glucose and ammonium chloride medium companying the formation of oxidized 2nitrogen.After 24days incubat ion ,the removal efficiencies of the COD by Bacillus sp.LY and Br evibacillus sp.LY were 7117%and 5216%,r espectively .The removal efficiencies of ammonium nitrogen by the two isolates were 7812%and 5112%and the TN removal efficiencies by t he two isolates were 6112%and 3516%,respectively.Key words:isolation;Bacillus sp.LY;Br evibacillus sp.LY;heterotrophic nitrification;nitrifying characterization废水生物脱氮是目前水处理领域中关注和研究的热点,其中对异养硝化作用及其菌属的研究,是对传统硝化理论的丰富与突破.相对于自养硝化菌而言,虽然有的异养菌的分解效率较低,但是由于它们在环境中的数量以及生长速率上往往远大于自养菌,因此在某些环境之中,异养硝化作用的贡献可以与自养菌相当,甚至超出[1].关于异养硝化作用,虽然目前仍有很多机理未得到解释,对一些现象的解释也不尽圆满,但异养硝化作用的重要性日益受到关注[2~4].本文在膜生物反应器(Membrane Bioreactor,MBR)实现稳定高效同步硝化反硝化(Simultaneous N itrification and Denitrification,SND)效果的基础上,采用将传统微生物学方法与现代分子生物学手段相结合的新型异养硝化细菌分离筛选方法,对系统中异养硝化细菌进行了分离筛选,通过生理生化实验、16S rDNA 序列分析,对分离筛选获得菌株进行了分析.同时采取批式实验对分离菌株的异养硝化性能进行了进一步的试验研究,为开发设计新的脱氮工艺,提高脱氮效率,提供一定理论及技术基础.1 材料与方法111 菌种来源取自运行稳定且具有8011%SND 效果的MBR 系统.112 异养硝化细菌的分离筛选11211 分离平板牛肉膏2蛋白胨固体培养基,其配方为:牛肉膏10g #L -1,蛋白胨10g #L -1,NaCl 5g #L-1,琼脂15~20g #L -1.11212 样品的稀释吸取MBR 中活性污泥20mL 加入到盛有180mL 的无菌蒸馏水和玻璃珠(分散用)的500mL 三角瓶中,塞上灭菌的棉花塞,于恒温振荡器上以100r #min -1转速30e 下振荡10h,而后进行10倍浓第27卷第2期2006年2月环 境 科 学ENVIRONMENTAL SCIENCEVol.27,No.2Feb.,2006度梯度稀释至10-10.11213细菌的纯化分离在制备好的牛肉膏2蛋白胨固体培养基上,从各个稀释度的稀释液里均取011mL分别稀释涂布至固体平板上(每个稀释度3个重复),于生化培养箱30e下培养.在形成菌落的平板内,挑选出大约100个单菌落的平板.将单菌落用接种环挑出,划线分离.待形成菌落后,再用接种环移植到固体培养基上,30e条件下培养,然后挑取一接种环的细菌菌苔放到无菌水中,充分振荡.用此细菌悬液,按照活菌数测定方法在平板上涂布,使其在培养皿上形成30~50个单菌落,而后把单菌落按照上述方法再挑菌一次,反复2~3次.并以不接菌的平板做空白对照.11214液体纯培养的硝化活性验证将牛肉膏2蛋白胨固体培养基上生长的纯菌菌苔用接种环挑取适量接种于氨氧化能力鉴定培养基:葡萄糖5g#L-1,(NH4)2SO4015g#L-1,NaCl013 g#L-1,K2HPO4110g#L-1,MgSO4#7H2O013 g#L-1,FeSO4#7H2O0103g#L-1,CaCO3715g#L-1, 30e条件下振荡培养,培养期间每隔3d取2mL培养液至洁净试管,将格利斯试剂1~2滴直接点滴入试管中进行硝化活性确认[5],并以不接纯化菌株的氨氧化能力鉴定培养基作空白对照.如现红色乃至褐色,则说明由于硝化作用而积蓄了亚硝酸盐.2~ 3min后再在未显色的试管中加入锌粉少许,静置,观察是否呈现红色.如加入锌粉后显红色,则说明培养液中的产生了硝酸盐.即菌株也具有硝化活性,初步确认为硝化活性菌.113荧光原位杂交技术检验验证所分离的异养硝化细菌本文根据自养硝化细菌16S rRNA序列设计的探针Nso1225(CGCCATT GTAT TACGTGTGA)为变形细菌B2pr oteobacteria类的通用探针;探针N IT3(CCTGTGCT CCATGCTCCG)可检测出N itrobacter类的硝化杆菌[6].使用的探针EUB338 (GCTGCCTCCCGTAGGAGT)为样品总菌数的检测,以确保样品中有足够检出量的rRNA.具体检测过程如下.11311预处理及固定在60e水浴中向3@PBS溶液中加入多聚甲醛,012L m滤头的针筒过滤.将含分离菌的混合培养液015mL加入到110mL以上固定液中.在4e下15000r#min-1离心10min,弃上清液,PBS洗涤2次,离心.准确加入1mL PBS与9915%的乙醇(体积分数1B1)溶液.11312原位杂交过程样品用超声波仪清洗后,取上清液置于115mL 的离心管,用PBS稀释一定倍数振动后将适量菌液滴加到涂有明胶的载玻片上,用吹风机(冷档)吹干.依次用50%、80%、98%的乙醇水溶液脱水,在冰浴中用溶菌酶溶液处理,再用乙醇水溶液脱水,空气中干燥.将探针加入杂交缓冲液中,46e下杂交2h,然后用洗涤缓冲液洗涤,空气中风干.将风干后的样品立即用荧光共焦激光扫描显微镜(T CS4D;Leica Lasertechnik,Germany)进行观察,并将观察的图片拍摄(样品送至日本国立环境研究所完成检测). 114氮轨迹跟踪试验为了研究分离筛选的纯化菌株在好氧条件下的硝化能力,进行了氮轨迹跟踪试验.实验中应用培养基的具体配比见表1.表1氮轨迹跟踪试验中,营养溶液各成分配比列表Table1T he average con centration of substratesin culture i n the batch test成分浓度/g#L-1葡萄糖01467氯化铵01191ZnSO4#7H2O01009H3B O301011MgSO4#7H2O01214MnSO4#7H2O01006FeSO4#7H2O01010CaCl201111NaCl810首先在无菌条件下取30mL处于对数生长期的实验菌液以4000r#min-1的转速离心10min,去除上清液,用无菌水冲洗后再离心,反复3次,最后用无菌水配成5mL的菌悬液.将此菌悬液加入上述不同碳源和氮源的培养基中,于35e?2e回旋式气浴恒温振荡器上振荡培养,恒定转速110r#min-1.每隔一定时间取出一定量的溶液,经过滤预处理后,测定滤过液COD、NH+42N、NO-22N、NO-32N、TN等指标的变化[7],实验期间pH值用磷酸盐缓冲液调节至810左右.所有结果均以不接种细菌的经灭菌的混合营养培养基作对照,以了解分离菌株的异养硝化效果.在实验过程中,为了确定实验混合液是否被杂菌污染,每周培养后将培养菌在平板上涂布以确定其是否纯3252期环境科学化.另外,为了将D 600值与混合液中细菌数量相对应,用血小板计数法对一系列不同D 600值的细菌数目进行了两者之间关系的拟合,得到D 600值与血小板计数结果之间的关系.2 结果与讨论211 分离的目的菌株的形态及生理生化特性实验初始由MBR 系统混合菌群中分离得到281株细菌,在对其硝化性能验证后从中筛选出能够产生NO -x 2N 的菌株39株,截止目前对其中2株菌株进行了硝化性能实验研究,分别编号为B1及B2,并分别进行了相关的细菌学鉴定以及生理生化试验研究,结果如下.菌株B1在牛肉膏蛋白胨培养基平板上培养1~2d 后形成的菌落呈乳白色,不透明,革兰氏阳性芽孢杆菌,细菌大小为(015~016)L m @(116~216)L m(见图1),具球杆变化周期,60e 不生长,不具抗酸性.接触酶阳性,V 2P 试验阴性,淀粉水解阴性,厌氧洋菜不生长,葡萄糖不产酸,除个别生理生化特征(可利用葡萄糖做有机碳源等)外,其主要特征与Bacillus macr oides 基本一致[8].图1 菌株B1的显微摄影照片(标记长度为1L m)Fig.1 Microphotograph of strain B 1(Bar 1L m)菌株B2在牛肉膏蛋白胨培养基平板上培养1d 后形成的菌落呈乳白色偏灰,不透明,细菌大小为(014~016)L m @(112~211)L m(见图2),具球杆变化周期.革兰氏染色实验中,菌株在培养初期为呈阳性的芽孢杆菌,但革兰氏染色不稳定,在生长至7d左右染色却呈阴性,且菌落变至褐色.60e 不生长,不具抗酸性.接触酶阳性,V 2P 试验阳性,淀粉水解阴性,厌氧洋菜不生长,葡萄糖产酸,除个别生理生化特征(不具抗酸性,不在铵态氮上生长)外,其主要特征与短芽孢杆菌属(Brevibacillus )基本一致[8].图2 菌株B2的显微摄影照片(标记长度为1L m)Fi g.2 Microphotograph of strain B2(Bar 1L m)212 FISH 试验结果及分析从样品的荧光原位杂交结果来看,在样品中有足够检出量的rRNA 的条件下(见用探针EU B338的结果,图3及图4所示),用针对变形细菌B 2prote obacteria 类的通用探针Nso1225(CGCCATT GTATTACGT GTGA)及检测Nitrobacter 类的硝化杆菌探针NIT3(CCTGTGCTCCATGCTCCG)均未有自养硝化细菌检出.图3 以EUB338为探针,菌株B1的FISH 分析图Fig.3 FISH micrograph of strain B1using probe Eub3382fitc for demonstration of the presence of sufficient target rRNA i n samples探针的选择依据:自养型氨氧化细菌分布在5个属中,其中除了Nitrosococcus 属的一部分菌株外,均属于B 2proteobacter ia [9],根据所分离细菌的形态学分析,菌株B1及B2属于杆菌属,形态与N itrosococcus 属(球状至椭球状)相差较大,因此选用针对B 2proteobacter ia 的特异探针Nso1225;自养型亚硝酸氧化细菌分别在4个属中,其中Nitrobacter 属及Nitrospir a 属均可异养生长[10,11],根据所分离细菌的形态学分析,菌株B1及B2呈杆状,与Nitrospira 属(疏松螺旋状)相差较大,因此选取针对Nitr obacter 属的N IT 3探针进行检验.图4 以EUB338为探针,菌株B2的FISH 分析图Fi g.4 FISH m icrograph of strain B 2using proble Eub3382fitc for demonstration of the presen ce of sufficient target rRNA in s amples试验结果显示,在应用上述探针进行杂交实验中,并没有检测出目标菌株的存在,此试验结果排除了所分离细菌为自养硝化细菌的可能,此类研究在国内外的报道甚少,本文后续对分离的纯化菌株进行了16S rDNA 序列分析.213 16S rDNA 的PCR 扩增和测序结果菌株B116S rRNA 基因序列与Bacillus sp.ZYM 16S ribosomal RNA gene 相似性最高,达到为9917%,与另外4株菌株:Bacillus f usif ormis strain Z1,Bacillus macroides strain LMG 18474,Bacillus sp.TUT 1008以及Bacillus f usif ormis strain S10的相似性也在99%以上.菌株B1在GenBank 中名称为Bacillus sp.LY,其16S rRNA 基因序列的登录号为AY787805.菌株B216S rRNA 基因序列与Br evibacillus invocatus strain LMG 1816716S ribosomal RNA gene 相似性最高,达到9917%,与另外4株菌株:Brevibacillus sp.R 26774,Brevibacillus invoc a tus gene,Brevibacillus invocatus strain LMG 18962以及Brevibacillus sp.R 27745的相似性分别为9916%,9911%,9819%及9819%.菌株B2在GenBank 中名称为Brevibacillus sp.LY,其16S rRNA 基因序列的登录号为AY873841.上述菌株均未见有关异养硝化方面的研究与报道,本研究中分离的菌株Ba cillus sp.LY 及Brevibacillus sp.LY 属于新分离得到的新型异养硝化细菌214 异养硝化菌的硝化特性试验在采用葡萄糖2氯化铵做碳源及氮源检验微生物硝化性能时,经过24d 的好氧培养,系统中Ba cillus sp.LY 及Br evibacillus sp.LY 2株细菌对COD,TN 及NH +42N 的平均去除率的去除率如表2所示.表2 24d 培养后,在Bacillus sp.LY 及Brevibacillus s p.LY的作用下,COD,TN 及NH +42N 的平均去除率Table 2 Th e average removal rates of COD,TN,and ammonium nitrogen after 24days incubati on by Bacillus sp.LY and Brevibacillus sp.LY项目各物质变化纯化菌株Bacillussp.LY Brevibacillus sp.LY 初始浓度/mg #L -1424.28589.63COD结束浓度/mg #L -1120100279158去除率/%71175216初始浓度/mg #L -150********T N结束浓度/mg #L -11514831105去除率/%69123516初始浓度/mg #L-14513040171NH +42N 结束浓度/mg#L -1918919188去除率/%78125112NO -x 2N初始浓度/mg #L -101982180最高积累浓度/mg #L -101633130表2数据显示,经过24d 好氧培养,在Ba cillus sp.LY 及Brevibacillus sp.LY 的作用下,COD 及总氮(TN)浓度均呈现出降低的趋势,证实了这2株细菌具有可利用有机物及良好的脱氮性能,系统中Ba cillus sp.LY 及Br evibacillus sp.LY 2株细菌对COD 的去除率分别为:71.7%和5216%,说明Ba cillus sp.LY 和Brevibacillus sp.LY 可利用有机物进行异化分解和同化合成,具有异养生物的性质,可以充分利用有机碳源合成生命体.Ba cillus sp.LY 及Brevibacillus sp.LY 对TN 的去除率分别为:6912%和3516%,结合表3中2菌株在培养后期COD 浓度、菌体数目、菌体含氮量及反映混合液中细菌体密度的D 600值的变化分析了纯化菌株的硝化性能.表3中结果显示,在培养的后期,Bacillus sp.LY 的菌体含氮量由第2d 的20157mg #L -1下降至第24d 的8165mg #L -1,Bacillus sp.LY 及Brevibacillus sp.LY 2个培养上清液中NH +42N 浓度也出现了下降,分别降低了17121mg #L -1及8109mg#L-1,因此滤过液中的氨氮浓度的下降显然不是由于同化合成作用造成的,而是由去除氨氮的另外一个途径,硝化作用所引起的.实验结果显示, Bacillus sp.LY及Br evibacillus sp.LY同化合成作用结束之后发生的硝化作用使氨氮的去除效率为6315%及2819%.表3Bacillus sp.LY和Brevibacillus sp.LY在培养后期D600值、COD浓度、细菌数目及菌体含氮量的变化T able3The changes of COD con centration and D600value in the liquid and the number of cell s and nitrogen quantity in the bacteria during the final incubation by Bacillus sp.LY and Brevibacillu s sp.LY.项目各物质变化纯化菌株Bacillussp.LYBrevibacillu ssp.LYCOD稳定增长期初始137.36217153 /mg#L-1第24d120100275111D600稳定增长期初始0136501309第24d0127001178菌体数目稳定增长期初始41452@101211449@1011 /个#mL-1第24d11689@101221857@1010菌体含氮量稳定增长期初始2015701888/mg#L-1第24d8165011753结论(1)采用传统微生物学方法与现代分子生物学手段相结合的新型异养硝化细菌的分离筛选方法可以分离筛选获得异养硝化细菌.(2)分离筛选得到菌株B1主要特征与Bacillus macr oides基本一致;菌株B2主要特征与(Brevibacillus)基本一致.与分离菌株B1相似性最高的为Bacillus sp.ZYM16S rRNA;与菌株B2相同性最高的为Brevibacillus invocatus strain LMG 18167.(3)Bacillus sp.LY及Brevibacillus sp.LY具有异养微生物的性质,可以充分利用有机碳进行有氧呼吸,24d好氧培养后,对COD的去除率分别为7117%及5216%.(4)Bacillus sp.LY及Brevibacillus sp.LY具有较强的硝化能力,24d好氧培养后,对氨氮的转化率分别为7812%及5112%;对总氮的转化率分别为6912%及3516%.参考文献:[1]Brierley E D R,Wood M.Heterotrophic nitrification in an acidforest soil:isolati on and characterisati on of a nitrifyingbacterium[J].Soil B iol.B iochem.,2001,33:1403~1409. 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