病毒感染力的滴定（TCID50的测定）

病毒感染力的滴定（TCID50的测定）
病毒感染力的滴定（TCID50的测定）
概念：半数感染量（median infective dose，ID50）表示在规定时间内，通过指定感染途径，使一定体重或年龄的某种动物半数感染所需最小细菌数或毒素量。

一、实验目的
了解病毒感染力测定的几种常用方法，掌握半数细胞培养物感染量TCID50的操作步骤、计算方法及含义。

二、测定病毒感染力的方法
半数致死量LD50( 50% lethal dose)：用动物或鸡胚来检测
半数鸡胚感染量EID50(egg 50% infective dose)：用鸡胚来检测半数细胞培养物(tissue,组织)感染量TCID50（50% tissue culture inf ective dose)：用细胞来检测
蚀斑形成单位（plaque forming unit，PFU）：用细胞来检测
三、材料
1、长满单层的细胞1瓶
2、胰酶、吸球、吸管、生长液
3、96孔细胞培养板
4、加样器、枪头
5、病毒液（PRV）
四、TCID50的操作步骤
1、在青霉素瓶或离心管中将病毒液作连续10倍的稀释，从10-1-10 -10。

2、将稀释好的病毒接种到96孔微量培养板中，每一稀释度接种一纵排共8 孔，每孔接种100μl。

3、在每孔加入细胞悬液100μl，使细胞量达到2~3×105个/ml。

4、设正常细胞对照，正常细胞对照作两纵排。

（100μl生长液+100μl细胞悬液）
5、逐日观察并记录结果，一般需要观察5-7天。

lgTCID50=L-d(s-0.5)
L：最高稀释度的对数（-1）
D：稀释度对数之间的差（lg10-1-lg10-2=1）
S：阳性孔比率总和（1+1+0.875+0.375+0.125=3.375）
lgTCID50=-1-1×(3.375-0.5)
=-3.875
TCID50=10-3.875/0.1ml
含义：将该病毒稀释103.875接种100μl可使50%的细胞发生病变。

实例1鸡新城疫活疫苗
（一）培养病毒将鸡新城疫病毒（la sota株）接种于9～11d鸡胚的尿囊腔中，接种后48～72h收获病毒，供检测与制苗用。

（二）检测尿囊液病毒的EID50
1．EID50的概念 EID50为半数鸡胚感染量，是利用不同稀释度的病毒液接种鸡胚后，能使半数鸡胚发生感染的病毒量。

2．病毒EID50的测定
（1）稀释病毒将收获的尿囊液充分混匀后取1ml，作10倍递进稀释至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7…稀释度。

（2）接种鸡胚每个稀释度接种9～11d SPF鸡胚5枚，接种量为0.1ml/枚，37℃温箱培养，逐日观察至120h，其间死亡的鸡胚及时拿出冷藏，至第5d时将所有的鸡胚置4℃冰箱中冷却4h或过夜，收获每枚鸡胚的尿囊液，分别存放。

（3）检测血凝价，判断感染情况用微量血凝试验逐枚检测鸡胚尿
囊液中病毒的血凝价，当HA≥1:128时判为感染。

3．根据血凝价计算EID50：EID50计算举例
(1)EID50测定结果见表
EID50测定结果 (接种剂量0.1ml)
（2）按Reed和Muench法计算EID50
EID50的对数=高于50%病毒稀释度的对数＋距离比例×稀释系数的对数
本例高于50%感染鸡胚的病毒稀释度的对数为-6，距离比例为0.5，稀释系数的对数为-1。

代入上式则：
lg EID50=（-6）＋0.5×（-1）=-6.5
∴ EID50=10-6.5/0.1ml
即：将病毒悬液作10-6.5稀释后，给鸡胚接种0.1ml，可以使50%的鸡胚感染。

(3)结果判断
在生产实践中，通过EID50检测，当尿囊液中病毒的EID50≥10-6.0时，方可作为制苗毒液，达不到标准的毒液应弃去或浓缩处理，达到毒价标准后方可灭活制苗。

实例2鸡传染性法氏囊炎弱毒活疫苗制备
（一）培养病毒
按实训五制备鸡胚成纤维细胞悬液，通过细胞计数结果，调细胞数为100万个/ml。

按0.3%～0.5%的量同步接种鸡传染性法氏囊弱病毒，置37℃ 5%CO2培养箱培养72～96h，观察CPE，由法氏囊炎病毒所致的CPE主要表现为细胞变圆、拉丝、脱落等。

细胞出现
70%以上的CPE时即可将培养瓶反复冻融3次，收获病毒，供检测用。

（二）检测TCID50
1．TCID50的概念TCID50为半数细胞培养物感染量，是利用不同稀释度的病毒液接种细胞后，能使培养细胞一半发生细胞病变的病毒量。

2．病毒TCID50的测定
（1）稀释病毒液将细胞培养的病毒液作10倍递进稀释，即稀释成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7…。

（2）接种细胞培养板取适宜稀释度的病毒液分别与培养液按1∶1混合，接种于96孔细胞培养板上。

每个稀释度接种4～6孔，每孔100μL，同时设立病毒对照和细胞对照组。

置37℃ 5%CO2培养箱培养72h。

观察记录病变情况。

（3）判断70%以上的细胞出现CPE判为感染。

3．TCID50计算举例
（1）CPE结果见表
TCID50测定结果 (接种剂量100μL)
（2）计算按Reed和Muench法
TCID50的对数=高于50%病毒稀释度的对数＋距离比例×稀释系数的对数
本例高于50%病毒稀释度的对数为-6，距离比例为0.68，稀释系数的对数为-1。

代入上式则：
lgTCID50=（-6）＋0.68×（-1）=-6.64
∴TCID50=10-6.64，100μL
即：将病毒悬液作10-6.64稀释后，给细胞培养物接种100μL，可以使50%的细胞产生CPE。

（3）结果判断当细胞培养毒液中病毒的TCID50≥10-6.0方可判为合格。