耗材工程师生化培训教材1.生化检验的原理和方法临床生化检验，主要在技术方法的应用方面上探讨生化检验新技术以及新的标记物的选择和评价，用以帮助诊断，又称“诊断生化”。
主要应用了下列技术：光谱技术、电化学分析技术、层析技术、电泳技术、离心技术、抗原抗体特异性反应和标记技术、核酸扩增、杂交及序列分析技术等，其中生化分析仪主要运用了光谱技术中的吸收光谱法和比浊法。
分别介绍如下：1.1. 吸收光谱法1.1.1.吸收曲线波长从200nm-400nm的电磁辐射，称为紫外光，波长从400nm-760nm的电磁辐射，称为可见光。
以波长(λ)为横坐标，以吸光度为纵坐标而绘制出的一条曲线称为吸收曲线。
吸光度Aλmaxλmin波长λ在一段波长范围内，有最大吸收波长λmax和最小吸收波长λmin，在最大吸收波长处测定可获得最大的测定灵敏度。
1.1.2.吸光度的定义I0It一束强度为Io的平行单色光通过一个含有浓度为C的吸光物质、厚度为L的吸收池时，如上图，一些光子被吸收，光强从Io衰减为It，则该溶液的吸光度A等于：Io It LgA −= 其中IoIt 为透光率。
1.1.3. Lamber-Beer 定律CL A ε=其中ε为吸光系数，有两种表示方法摩尔吸光系数和比吸光系数，摩尔吸光系数的意义为1摩尔浓度的溶液在厚度为1cm 时的吸光度，比吸光系数的意义为浓度为1%(w/v)的溶液在厚度为1cm 时的吸光度；C 为溶液的浓度；L 为吸收池的厚度(单位为cm ，亦称光径)。
Lamber-Beer 定律的意义为：某溶液的吸光度等于该物质的吸光系数ε、浓度C 和光径L(cm)的乘积，当光径不变时，浓度和吸光度成正比，这是生化分析仪利用吸收光谱法进行定量测定的基础，见下图：ACLamber-Beer 定律成立的前提条件是：(1)被吸收光为单色平行光，(2)待测定溶液为稀溶液。
除特种蛋白外的大部分临床生化项目，配以相应的试剂，均可利用吸收光谱法在生化分析仪上进行测定。
如酶类：包括ALT ，AST ，ALP ，ACP ，r-GT ，α-HBDH ，LDH ，CK ，CK-MB,α-AMY等。
底物/代谢产物类：包括TG ，TC ，HDL-C ，LDL-C ，UA ，UREA ，Cr ，Glu ，TP ，Alb ，T-Bil ，D-Bil ，NH 4+,CO2等。
无机离子类：包括Ca ，P ，Mg ，Cl 等。
1.2. 比浊法1.2.1. 分类比浊法分两类：透射比浊法和散射比浊法。
带有小粒的悬浮液和胶体溶液都具有向四面八方散射入射光的性质，当一束平行光通过含有悬浮质点的悬浮液或胶体溶液时，同时受到散射和吸收两个因素的影响，使光的强度减弱。
在光源的光路方向上测量透射光(实际上还包括散射光)强度与入射光强度比值，并通过该比值测定出悬浮液或胶体溶液中质点的溶度，称为透射比浊法，在光路的其他方向上测定测量散射光强度，从而测定出悬浮液或胶体溶液中质点的溶度，称为散射比浊法。
1.2.2. 测定原理1) 透射比浊法IoI颗粒大小与光源波长接近一束强度为Io 的平行单色光通过一个含有悬浮质点(颗粒大小与光源波长接近)的悬浮液或胶体溶液时，如上图，其透射光强度I 可用下式表示：L Ioe I τ−=式中，L 为悬浮液或胶体溶液在光前进方向上的长度，τ为浊度系数，与悬浮质点的浓度C 成线性关系。
令τ=2.3KC ，则：KCL I Io =lg该式与Lamber-Beer 定律相似，这是生化分析仪利用透射比浊法进行定量测定的基础，该法可以与吸收光谱法共用一个检测器，所有生化分析仪，不需增加任何部件，均可利用此法进行测定。
大部分特种蛋白，如载脂蛋白类(apoAI,apoB 等)、补体类(C3、C4等)、免疫球蛋白类(IgA ，IgG ，IgM 等)等，配以相应的试剂，可利用此法在生化分析仪上进行测定。
2) 散射比浊法Io颗粒大小远小于光源波长I一束强度为Io 的平行单色光通过一个含有悬浮质点(颗粒大小远小于光源波长)的悬浮液或胶体溶液时，如上图，与入射光垂直方向上，其散射光强度I 可用下式表示：Io n n n n r I 22222433)22121(24+−=λνπ 式中，n1、n2分别表示质点与介质的折射率，ν表示单位体积内的质点数，r 表示质点半径。
可见散射光强度与悬浮质点的浓度成正比，这是利用散射比浊法进行定量测定的基础，因另需在光路垂直方向上增加一检测器，目前只有极少数生化分析仪可利用散射比浊法进行定量测定，而几乎所有的特种蛋白分析仪、免疫分析仪等都能利用散射比浊法进行定量测定。
1.2.3.方法学分析(1)散射比浊法与透射比浊法：散射比浊法灵敏度高，线性范围宽，但干扰因素多。
(2)比浊法与吸收光谱法：比浊法特异性差，灵敏度低。
1.3. 生化仪测定方法的分类1.3.1.终点法指经过一段时间(一般为10分钟左右)的反应，整个反应达到平衡，由于反应的平衡常数很大，可认为所有的被测定物已转变为产物，反应液的吸光度不再增加(或降低)，吸光度的增加(或降低)程度与被测定物的浓度成正比。
单试剂单波长：Att1t2t3如图所示：t1时刻加入试剂（体积为V）， t2时刻加入样本（体积为S），然后搅拌并反应，之后测量反应液的吸光度，在t3时刻反应达到终点； t2-t3为测定时间。
举例：BS-300上科华ALB液体单试剂的反应曲线双试剂单波长：At1t2t3t4tt1时刻加入第一试剂(体积为V1)，t2时刻加入样本(体积为S)，之后搅拌，t3时刻加入第二试剂(体积为V2)并立即搅拌，t4时刻反应达到终点。
t3-t2为孵育时间,t4-t3为测定时间。
举例：BS-300上科华UA液体双试剂的反应曲线1.3.2.一级动力学法（两点法、固定时间法）一级动力学法是指在被测物参与反应的条件下，在一定的反应时间内，反应速度与反应物浓度的一次方成正比，由于反应物在不断的消耗，因此整个反应速度在不断的减小，表现为吸光度的增加(或降低) 速度越来越小，由于这类反应达到平衡的时间很长，且平衡常数不算很大，必需在特定时间段内进行监测，该段时间内吸光度的增加(或)降低与被测定物的浓度成正比，见下图。
一级动力学法又被称为初速率法、固定时间法、二点动力学法等。
At1t2t如图所示：t1时刻加入试剂(体积为V)，之后测量试剂空白的吸光度，t2时刻加入样本(体积为S)，t3时刻反应稳定，t4时刻停止对反应进行监测；t2-t3为延迟时间，t3-t4为测定时间。
举例：BS-300上科华BUN液体双试剂的反应曲线1.3.3.零级动力学法（连续监测法）指反应速度与被测定物浓度的零次方成正比，也就是与被测定物浓度无关，因此，在整个反应过程中，反应物可以匀速地生成某个产物，导致被测定溶液在某一波长下吸光度均匀地减小或增加，减小或增加的速度(△A/min)与被测物的活性或浓度成正比。
零级动力学法即通常所说的动力学法，也被称为连续监测法；主要用于酶活性的测定。
实际上，由于底物浓度不可能足够大，随着反应的进行，底物消耗到一定程度后，反应速度不再与酶活性成正比，因此，零级动力学法是针对于特定时间段而言的，各试剂商对这段时间有严格规定，见下图中的t3-tn：At1时刻加入试剂(体积为V)，t2时刻加入样本(体积为S)，t3时刻反应稳定，tn时刻停止对反应进行监测；t3到tn之间的时间内，吸光度匀速变化，变化的速率和反应物的浓度成线性关系。
t3-t2为延迟时间，tn-t3为测定时间。
举例：科华公司r-GT液体双试剂的反应曲线2.试剂从二十世纪四五十年代开始产生第一代生化试剂开始，生化试剂得到了迅速的发展，从手工配置到大工业化生产，从单一的几个项目发展到现在七十多个项目，以及各种封装形式的出现，生化试剂在测试项目，测试反应的特异性、试剂的稳定性、测试结果的重复性和准确性、测试的线性范围等方面都发生的质的变化，而且这种发展现在仍然在迅猛的进行中。
2.1. 临床生化试剂的发展历史第一阶段：各医院实验室通常自行配制简单试剂，能开展的生化检测的方法及检测项目十分有限，无统一标准，准确性极差第二阶段：使用时要用多种试剂配制在一起，稳定性很差，多数在冰箱内只能保存数天，并且操作繁琐费时，容易加错试剂第三阶段：冻干试剂、干粉试剂。
冻干试剂是先将各种化学试剂溶解混合后，分装成不同试剂的瓶内，再经冻干处理。
冻干试剂中残留的含水量不易精确控制，造成瓶间差较大。
干粉试剂是用将各种干燥的化学试剂直接混合加工而成，各瓶内试剂中所含水量均一。
冻干和干粉试剂在用前要复溶，复溶时对水质及其加入量要求很高，复溶后保存期短，稳定性差，常常造成浪费，同时不能抗干扰。
第四阶段：液体双生化试剂。
准确、稳定性好；抗干扰能力强，无需复溶，使用方便，不易浪费，使用前无需准备，可直接上机使用，并适用于手工法。
2.2. 双试剂的优点双试剂是指将反应体系的全部试剂分成两大组分，即第一试剂先与被检样本中的干扰物质反应，使其被扣除，然后加入第二试剂，样本中的被检物质与反应体系中的试剂起反应，再进行测定。
2.2.1.抗干扰反应能力强在临床生化测定过程中，血标本本身成分十分复杂，除了含有待测物质外，还含有各种酶、有机物、无机盐等物质，这些物质都会干扰或参与测试反应，引起非特异性干扰反应。
为了克服这种干扰反应，将试剂盒分为两组，在测定过程中，试剂1与标本中的干扰物反应，使其消耗，再用试剂2启动真正的测试反应进行测定。
2.2.2.增强了工作试剂的稳定性许多酶法测定试剂盒为冷冻干燥试剂，在4℃保存一般稳定期在1年以上。
但复溶后的工作试剂的稳定性差，如ALT测定工作试剂4℃只能保存一周，AST测定工作试剂4℃只可保存四天，而液体双试剂则使稳定性大大延长，如ALT、AST测定的液体双试剂在4℃可稳定一年。
液体酶法试剂从配制上解决了这一矛盾：a．用户可根据每次标本量按一定比例配制适量工作液，当天配制当天用完这样便可减少试剂损失b．如果用户使用的自动生化分析仪有双试剂测定功能，那么，就不必把双试剂混合成工作试剂进行测定，试剂的有效期一年便是工作液的有效期。
c．对于干粉、片剂型等需复溶的生化试剂，水质的好坏直接影响了复溶后工作液的稳定性和测定重复性。
目前除了一些三级医院有自制的试剂级的蒸馏水外，其他医院很难获得符合试剂级要求的水，这就对干粉、片剂试剂的实际使用造成了一定的影响。
2.2.3.提高了测定结果的重复试剂组分的高度均一性，提高了测定结果的重复性，避免了瓶间差，试剂中每一组分均一性是影响测定重复性的一个重要因素。
2.3. 几个重要项目的测试方法的差别2.3.1.肌酐的测试方法肌酐主要是体内肌酸的代谢产物，少部分由食物经机体消化吸收而来。
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