吉西他滨时辰给药治疗荷瘤裸鼠的实验研究

吉西他滨时辰给药治疗荷瘤裸鼠的实验研究
王颖彦;常瑞明;常建星
【摘要】目的建立肺癌A549细胞裸鼠皮下注射成瘤模型,按照昼夜的不同时辰给予吉西他滨,观察其疗效和副作用,初步筛选出最佳给药时间.方法 32只裸鼠饲养在SPF级实验动物房,统一光照条件,光照时间(7:30～19:30),黑暗时间(19:30～7:30),温度控制在25℃左右,湿度控制在50％左右;收集对数生长期培养的A549细胞,浓缩成2× 107/mL的细胞悬液,在无菌条件下抽取约0.2 mL细胞悬液注射至裸鼠皮下.待肿瘤长到约1 cm×1 cm×1 cm大小,随机分为4组,每组8只.前三组按照时辰2 am、8 am、14 pm给予吉西他滨(50 mg/Kg),隔两天给药一次,持续三周,第四组给予等量无菌生理盐水作为对照组.每周测量肿瘤体积和裸鼠体重,绘制肿瘤的生长曲线和体重变化曲线.第30天处死裸鼠,抽血测肝肾功能,留取标本做HE染色观察镜下改变.结果吉西他滨对A549肺癌裸鼠移植瘤有治疗效果,其中2 am组抑瘤效果最明显,肿瘤生长最慢,裸鼠体重增长最快;8 am组抑瘤效果最差,肿瘤生长最快,裸鼠体重增长最慢.光镜下可见吉西他滨治疗组肺肝肾损伤较对照组减轻,肝肾功能改善(P＜0.05,8 am、14 pm组vs.对照组;P＜0.01,2 am组vs.对照组);药物治疗组当中,2 am组治疗效果最好,8 am组治疗效果最差(P＜0.05,2 am vs.8 am组).结论吉西他滨对A549肺癌移植瘤裸鼠有明显的抑瘤作用,而且疗效和副作用呈时辰节律变化,2 am组疗效最佳,8 am组疗效最差.
【期刊名称】《岭南现代临床外科》
【年(卷),期】2014(014)004
【总页数】4页(P362-365)
【关键词】时辰化疗;吉西他滨;肺癌A549细胞
【作者】王颖彦;常瑞明;常建星
【作者单位】510120广州广东省中医院药学部;510120广州中山大学孙逸仙纪
念医院急诊科;510120广州中山大学孙逸仙纪念医院外科
【正文语种】中文
【中图分类】R734.2
肺癌是严重威胁人类健康、发病率较高的一种疾病［1］，对于错过手术时机的患者采取药物化疗是非常重要的手段。

尽管多年来化疗药物取得了不错的效果，但其严重的不良反应如胃肠道反应、骨髓抑制、肝肾功能损害等迫使患者放弃化疗［2］。

时辰化疗是根据机体生理、生化和病理功能表现的节律性变化，以及药物在体内的代谢动力学特征、靶器官的敏感性节律等，选择药物疗效最佳、毒副作用最小的最佳给药时间点进行给药，从而提高疗效，降低副反应，制定出合理的给药剂量和时间［3］。

我们的实验采取肺癌A549细胞注射裸鼠皮下成瘤，观察不同时间给予吉西他滨的治疗效果及副反应，从而初步筛选出最佳给药时间，为临床医生提供实验依据。

1 材料与方法
1.1 实验药物与试剂
注射用吉西他滨（健泽）（批准文号：H20110535）购于ELI LILLY AND COMPANY公司；细胞培养所用试剂均购于杭州四季青生物材料公司；实验动物：裸鼠32只，购于中山大学实验动物中心［许可证号：SCXK（粤）2008－0002］，
雌雄各半；人肺癌A549细胞：购买于中国典型培养物保藏中心。

1.2 实验方法
1.2.1 肺癌 A549细胞培养 A549细胞用含有10%的胎牛血清的DMEM培养基置于37℃、5%的二氧化碳培养箱培养，细胞贴壁率为85%左右时用胰酶消化、传代、换液，不断扩增细胞数量。

1.2.2 建立肺癌 A549细胞裸鼠皮下注射成瘤模型：严格穿无菌隔离衣，戴口罩、帽子，换拖鞋，进入饲养裸鼠的SPF级饲养房，用无菌注射器抽取0.2 mL在超净台中浓缩的细胞悬液（浓度为2×107／mL），接种到局部棉签消毒的裸鼠右肩胛部皮下，观察注射处无渗液后放回笼中饲养，4～6天后成瘤（成瘤率90%以上）。

1.2.3 实验分组给药等到裸鼠局部肿瘤长到约1 cm×1 cm×1 cm大小，将32只裸鼠随机分为4组，每组7只。

给药组：分别于2 am、8 am、14 pm腹腔注射吉西他滨（0.4 mL），间隔 2天给药一次，共给药3次；对照组：给予等量无菌生理盐水。

用游标卡尺每周测量瘤体大小，绘制各组裸鼠肿瘤生长曲线；每周称裸鼠体重2次，绘制体重变化曲线。

1.2.4 标本取材实验结束后摘除眼球取血，放入肝肾功能检测管中送本院检验科测定；留取肺肝肾组织放入4%的多聚甲醛溶液中4℃冰箱保存待测。

1.3 统计学处理
符合正态分布和方差齐性的计量资料用x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析（one－way ANOVA），组间两两比较采用t检验，采用SPSS13.0 统计软件包处理分析，P＜0.05 为差异有统计学意义。

图1 不同时间给药组肿瘤生长曲线
图2 不同给药时间组裸鼠体重变化
表1 各组裸鼠肝肾功能的比较（±s，n＝8）注：★P＜0.01 vs.对照组；△P＜
0.05vs.对照组；▲P＜0.05 vs.8am 组；ALT：谷丙转氨酶；AST：谷草转氨酶；BUN：尿素氮；CREA：肌酐。

Con组8 am组14 pm组2 am组ALT／U·L－1 78.15±5.45 66.45±8.54△54.35±8.34△42.37±7.48★▲AST／U·L－1
132.26±9.27 113.25±21.24△89.48±13.23△80.16±9.23★▲BUN ／mmol L－1）19.36±2.14 14.26±2.46△12.36±2.18△8.68±1.56★▲CREA ／ummol L－1）52.29±4.35 43.37±6.69△39.45±5.57△31.28±3.15★▲
2 结果
2.1 肿瘤生长情况
2 am给药组：给药初期肿瘤生长较快，一周后生长逐渐减慢；8 am给药组：给
药初期肿瘤生长较快，两周后生长逐渐延缓，在较长一段时间内生长缓慢；14
pm给药组：用药初期肿瘤生长快，两周后生长稍有延缓，在较长一段时间生长相对较快；对照组：肿瘤呈持续迅速生长，生长曲线相对较陡直。

2.2 不良副反应
图3 各组裸鼠肺组织HE染色
图4 各组裸鼠肝组织HE染色
图5 各组裸鼠肾组织HE染色
2.2.1 裸鼠体重变化 2 am给药组：裸鼠体重在给药后第一周体重增加，然后逐渐
减慢；8 am给药组：裸鼠体重在给药后第一周体重增加，此后一直增加；14 pm 给药组：裸鼠体重在给药后第一周体重增加，此后也一直缓慢增加；对照组：裸鼠体重持续增加至第二周，此后增加幅度减慢。

2.2.2 不良副反应的其它表现 2 am给药组：给药后裸鼠行动较灵活，精神饮食饮
水较前变化不大；8 am给药组：给药后第5天，裸鼠出现精神萎靡，饮食饮水减少，行动迟缓、反应迟钝，约4周后有所恢复；14 pm给药组：给药后第6天，
裸鼠开始出现行动迟缓、反应迟钝，精神稍变差，饮食饮水较前稍减少，约4周
后基本恢复正常。

对照组：裸鼠行动灵活，反应快，精神饮食基本正常。

2.3 裸鼠肝肾功能
裸鼠肝肾功能结果提示，移植瘤模型对照组肝肾功能均有不同程度损害，给予吉西他滨治疗后给药组裸鼠肝肾功能均有不同程度改善，其中，2 am给药组效果最佳，8 am给药组效果最差。

2.4 裸鼠肺肝肾病理改变
A549细胞移植模型对照组及吉西他滨给药组裸鼠均会出现肺、肝、肾的病理改变，各组的严重程度有所不同。

肺的病理改变有：肺内导管上皮细胞轻度肿胀，管内有少量出血，肺泡壁轻度增厚，间质结缔组织轻度水肿，少量炎性细胞浸润；肝：肝细胞颗粒变性、坏死、融解，肝组织轻微水肿、肝窦增宽，汇管区结缔组织水肿、纤维结构模糊不清，肝细胞肿胀、坏死；肾：肾淤血、水肿、炎性细胞浸润，肾皮质间质血管淤血、结缔组织充血水肿。

光镜下可见对照组裸鼠肺、肝、肾受损最严重，吉西他滨治疗组较对照组有所减轻，其中2 am给药组表现最轻，8 am组表
现较其它治疗组重，14 pm组见于2 am和8 am组之间。

3 讨论
时辰药理学是研究药物与人体生物周期性相互关系的科学，人和其它生物一样，存在有规律的生物周期节律［4］。

同一种药物在一天当中不同的给药时间其疗效和副作用存在差异，正常人的体温、心率、血压、基础代谢、激素的分泌等都呈规律的节律性变化，这种变化直接影响药物在体内的吸收、分布、代谢，从而影响药物的疗效和副作用［5］，我们的实验目的是初步筛选出吉西他滨对荷瘤裸鼠的最佳给药时间，发挥其最佳疗效，降低其副作用。

吉西他滨是一种破坏细胞复制的二氟核苷类抗代谢物抗癌药，是去氧胞苷的水溶性类似物，属于核糖核苷酸还原酶的一种抑制性酶的替代物，用于胰腺癌、肺癌、膀胱癌等肿瘤的治疗［6］。

我们的实验结果表明，人源性肺癌A549细胞给裸鼠皮下注射成瘤模型稳定，成瘤率高。

2 am、8 am、14 pm 给予吉西他滨（50 mg／kg）对荷瘤裸鼠均有治疗
作用，可以不同程度抑制肿瘤生长，减轻肝肾功能的损害，保护肺肝肾的组织改变。

但疗效和副作用存在差异，2 am组疗效最好，副作用最小，8 am组疗效最差，
副作用最明显。

初步表明吉西他滨对A549荷瘤裸鼠的治疗给药时间为2 am。

参考文献
【相关文献】
［1］Wang X， Ling L， Su H， et al.Aberrant mehtylationof genes in sputum samples as diagnostic biomakers for non-small cell lung cancer： a meta-analysis ［J］.Asian Pac J Cancer Pre，2014，15（11）：4467－4474.
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