无菌检查方法学验证方案
版次：□ 新订□ 替代:
制定人：年月日审批会签：年月日批准人：年月日生效日期：年月日
一、目的
当建立医疗器械无菌检查法，或产品原材料改变，试验条件改变时应进行方法的验证，以证明所采用的方法适合于该医疗器械的无菌检查。
二、范围
适用于本公司生产的********的无菌检查方法验证。
三、验证依据
《中国药典》——2010版，附录：无菌检查法
ISO11737-2:2009 医疗器械的灭菌——微生物学方法，第一部分：确认灭菌过程的无菌试验
GB/T 14233.2-2005 医用输液、输血、注射器具的检验方法，第二部分：生物学试验方法四、验证机构组成及职责：
五、方法验证
5.1 验证条件
5.1.1 检验环境：无菌检查应在环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域内进行操作。其全过程必须严格遵守无菌操作，防止微生物污染。
5.1.2 检验设备：主要的仪器、设备确认情况（附表1）
5.1.3 培养基及稀释液：硫乙醇酸盐流体培养基、改良马丁液体培养基、改良马丁琼脂培养基、营养肉汤，pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液、0.1%蛋白胨水溶液、0.9%无菌氯化钠溶液。（培养基灵敏度评价附表2）
5.1.4 其它实验材料：微孔滤膜（孔径≤0.45um，直径约50mm）、无菌过滤杯、无菌剪刀、无菌镊子、无菌钳子、无菌手套、吸管（1ml）、酒精灯、三角烧瓶、接种环。
5.2 方法验证
5.2.1 原理：活检钳的形状为不溶物，为微生物转移更彻底，验证试验结果更准确，特选用无菌检查法中的薄膜过滤法。
5.2.2 供试品的取样按照GB/T 2828.1-2003相关规定进行取样。
5.2.3 菌种
所用的菌株传代次数不得超过5代（从菌种保存中心获得的冷冻干燥菌种为第0代），试验用菌种应采用适宜的菌种保存技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性。
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)〔CMCC(B) 26 003〕
大肠埃希菌（Escherichia coli）[CMCC(B) 4 4102〕
枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）〔CMCC（B）63 501〕
生孢梭菌(Clostridium sporogenes)〔CMCC(B) 64 941〕
白色念珠菌(Candida albicans)〔CMCC(F) 98 001〕
黑曲霉(Aspergillus niger) 〔CMCC(F) 98 003〕
5.2.4 菌悬液制备
接种金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，接种生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，30℃～35℃培养18小时～24小时；接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中，23～28℃培养24～48小时，上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml 含菌数小于100cfu（菌落形成单位）的菌悬液。
接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基上，23～28℃培养5～7天，加入3～5ml含0.05％（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后，用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05％（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml 含孢子数小于100cfu 的孢子悬液。
菌悬液在室温下放置，应在2小时内使用；若保存在2～8℃可在24小时内使用。黑曲霉孢子悬液可保存在2～8℃，在验证过的贮存期内使用。
5.2.5 薄膜过滤法
取6根供试品，剪断置600ml 0.1%蛋白胨水溶液中，充分振摇，平均加入至6个无菌过滤杯中，按薄膜过滤法过滤，每杯加入pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液100ml，冲洗三次，在最后一次的冲洗液中加入50—100cfu的试验菌，过滤。取出带有金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌的滤膜分别接种至100ml硫乙醇酸盐流体培养基中，带有白色念珠菌、黑曲霉的滤膜分别接种至100ml改良马丁培养基中。
另取六份装有同体积培养基的容器，加入等量试验菌，作为对照。
阴性对照：培养基空白对照、冲洗液/缓冲液空白对照、无菌滤膜空白对照
5.2.6 培养条件
硫乙醇酸盐流体培养基：30℃～35℃，3～5天
改良马丁培养基：23～28℃，3～5天
5.2.7 结果判断
a.阴性对照应无菌生长。
b.与对照培养基比较，如含供试品各容器中的试验菌均生长良好，则说明供试品的该检验量在该检验条件下无抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不计，照此检查方法和检查条件进行供试品的无菌检查。如含供试品的任一容器中的试验菌生长微弱、缓慢或不生长，则说明供试品的该检验量在该检验条件下有抑菌作用，可采用增加冲洗量、增加培养基的用量、使用中和剂或灭活剂、更换滤膜品种等方法，消除供试品的抑菌作用，并重新进行方法验证试验。
六、验证结果的汇总、评定及审批
6.1阳性对照：一般情况下，供试品无菌检查若采用薄膜过滤法，应增加1/2的最小检验数量作阳性对照用
6.2阳性对照应根据供试品特性选择阳性对照菌：无抑菌作用及抗革兰阳性菌为主的供试品，以金黄色葡萄球菌为对照菌；抗革兰阴性菌为主的供试品以大肠埃希菌为对照菌；抗厌氧菌的供试品，以生孢梭菌为对照菌；抗真菌的供试品，以白色念珠菌为对照菌。阳性对照试验的菌液制备同方法验证试验，加菌量小于100cfu，供试品用量同供试品无菌检查每份培养基接种的样品量。阳性对照管培养48～72小时应生长良好。
6.3 按照方法验证方案的要求实施验证，并将验证过程记录在验证报告中。对验证的结果进行分析和评价，并建议何种条件下进行再验证。（附表4）
