高效液相色谱法分析玉屏风散成分

高效液相色谱法分析玉屏风散成分
郑浩;刘可心;王彦予;王旭;魏全浩;王岩;王哲;容蓉
【摘要】建立玉屏风散高效液相色谱指纹图谱分析方法,探讨市售饮片对玉屏风散质量一致性的影响.用传统水煎法制备玉屏风散水煎液,采用高效液相色谱法对不同来源的单味药饮片制备的玉屏风散样品进行测定,用色谱指纹图谱相似度评价软件对指纹图谱进行分析,以对照药材制得的标准方剂为参照,评价不同批次饮片对玉屏风散成分的影响.试验结果表明,10批玉屏风散指纹图谱之间的相似度差异较大,与标准方剂的指纹图谱相比较,有6批相似度低于0.5,3批在0.5～0.8之间,1批高于0.9.10批样品指纹图谱中有22个共有峰,利用标准品对照法鉴定了其中6个成分.试验表明药材饮片的来源对玉屏风散的成分影响较大.
【期刊名称】《化学分析计量》
【年(卷),期】2019(028)001
【总页数】6页(P29-34)
【关键词】玉屏风散;水煎液;指纹图谱;高效液相色谱法;质量评价
【作者】郑浩;刘可心;王彦予;王旭;魏全浩;王岩;王哲;容蓉
【作者单位】山东中医药大学药学院,济南 250355;山东中医药大学药学院,济南250355;山东中医药大学药学院,济南 250355;山东中医药大学药学院,济南250355;山东中医药大学药学院,济南 250355;山东中医药大学药学院,济南250355;山东中医药大学药学院,济南 250355;山东中医药大学药学院,济南250355
【正文语种】中文
【中图分类】O657.7
玉屏风散出自宋代张松的《究原方》，由黄芪、白术和防风组成，具有益气固表止汗的功效，可以治疗中医学的各种汗证虚症［1］，为中医“扶正固本”的经典名方。

现代药理研究表明玉屏风散还具有抗肿瘤［2-4］、免疫调节［5-8］、抗氧化［9］等方面的功能。

复方配伍是中医用药最重要的特点之一，复方质量稳定是药物剂量准确的基础和前提。

目前市面上中药饮片的来源渠道多、范围广，市售饮片对方剂质量一致性的影响值得探讨。

指纹图谱是中药一致性评价、复方解析和研究的主要手段之一，已用于玉屏风散的质量评价［10-11］。

文献报道的玉屏风散水煎液高效液相色谱指纹图谱［12］因流动相梯度洗脱条件不理想而分离效果欠佳。

笔者以乙腈-0.05%磷酸水为流动相，优化洗脱条件，对市售药材饮片制备的玉屏风散进行色谱分析，利用高效液相色谱指纹图谱技术，从全化学成分的角度探讨市售饮片对该方剂组成一致性的影响，为玉屏风散的质量控制和评价提供依据。

1 实验部分
1.1 主要仪器与试剂
高效液相色谱仪：1260型，配置四元泵、全自动进样器、DAD二极管阵列检测器、高效液相色谱工作站，美国安捷伦科技有限公司；
旋转蒸发仪：EYELA OSB-2100型，日本东京理化器械株式会社；
台式离心机：Heraeus Biofuge Primo R型，美国赛默飞世尔科技有限公司；
中药指纹图谱相似度评价系统软件：2004A，国家药典委员会；
乙腈：色谱纯，美国费希尔公司；
甲醇：色谱纯，山东禹王和天下新材料有限公司；
毛蕊异黄酮苷（M-020-170926）、升麻素苷（S-004-170827）、升麻素（S-007-170429）、5-O-甲基维斯阿米醇苷（J-002-170731）、白术内酯Ⅲ（B-035-160822）、3-羟基 -9，10-二甲氧基紫檀烷（Q-057-171011）对照品：纯度均大于98%，成都瑞芬思生物科技有限公司；
对照药材蒙古黄芪（120974-201612）、膜荚黄芪（121462-201304）、白术（120925-201611）、防风（120947-201409）：中国食品药品检定研究院；
中药材饮片：来源列于表1，所有饮片均由山东中医药大学张芳副教授鉴定为正品，黄芪为豆科植物蒙古黄芪或膜荚黄芪的干燥根，（炒）白术为菊科植物白术的干燥根茎的麸炒品，防风为伞形科植物防风的干燥根；
实验用水为娃哈哈纯净水。

1.2 色谱条件
色谱柱：Agilent Eclipse XDB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，美国安捷伦科技有限公司）；流量：1 mL／min；柱温：30℃；进样体积：20 μL ；流动相：以乙腈为流动相A，以0.05%磷酸水为流动相B，按表2所示浓度变化进行梯度
洗脱，进样前以初始流动相条件平衡20 min；检测波长：230 nm。

1.3 玉屏风散饮片样品溶液的制备
按照《究原方》中玉屏风散配比，取黄芪饮片6 g、（炒）白术饮片6 g、防风饮片3 g，粉碎，加入10倍量纯净水浸泡30 min，加热回流40 min，过滤；向药渣中加入5倍量纯净水，加热回流20 min，过滤，合并滤液并混匀，于40℃浓
缩至相当于原药材含量1.0 g／mL。

取玉屏风散浓缩液4 mL，置于10 mL容量
瓶中，加入甲醇至标线，振摇混匀，于4℃冰箱中放置过夜，将混悬液抽滤，取续滤液，过0.45 μm微孔滤膜，得玉屏风散饮片样品溶液。

将购自不同药店的10
批饮片，按上述方法制备玉屏风散饮片样品溶液10份。

表1 玉屏风散饮片来源批序号饮片名称产地批号来源1黄芪白术防风甘肃安徽河北A170501 D7030201 B706072-01 A药店A药店A药店2黄芪白术防风甘肃河北内蒙X17061304 160958 161206 B药店B药店B药店3黄芪白术防风内蒙浙江内蒙20170801 20170801 20170801 C药店C药店C药店4黄芪白术防风甘肃安徽河北20160153 161201 13612061 D药店E药店E药店5黄芪白术防风甘肃内蒙内蒙170501 235175 160903 F药店F药店F药店6黄芪白术防风甘肃安徽内蒙1708103 160221 170501 G药店G药店G药店7黄芪白术防风甘肃浙江内蒙16041521 1612003 161001 H药店H药店H药店8黄芪白术防风甘肃安徽河北170803281 170802 1702027 I药店I药店I药店9黄芪白术防风甘肃安徽河北1707001 161201 161206 J药店J药店J药店10黄芪白术防风K 药店K药店K药店河北浙江湖北20150301 20150301 20150201
表2 流动相梯度洗脱程序时间／min 流动相A／% 流动相B／%0 3 97 55 20 80 80 21 79 85 21.5 78.5 90 24 76 95 29 71 130 80 20
1.4 标准方剂对照溶液的制备
取对照药材蒙古黄芪0.2 g、白术0.2 g、防风0.1 g，加入50倍量纯净水浸泡30 min，于60℃超声提取20 min，过滤；向药渣中加入25倍量纯净水，于60℃超声提取10 min，过滤，合并滤液并混匀，挥干溶剂，向残渣加入60%甲醇溶液超声溶解，至药液浓度相当于原药材含量0.4 g／mL，振摇混匀，于4℃冰箱中放置过夜，将混悬液以12 000 r／min离心，取上清液，得标准方剂对照溶液。

按上述方法制备膜荚黄芪复方、空白对照溶液对与单味药材溶液。

1.5 对照品溶液的制备
取毛蕊异黄酮苷、升麻素苷、升麻素、5-O-甲基维斯阿米醇苷、白术内酯Ⅲ、3-羟基-9，10-二甲氧基紫檀烷对照品适量，精密称定，用甲醇溶解，制得质量浓度均为100 μg／mL的对照品溶液，摇匀，于4℃冰箱中储存备用。

1.6 实验方法
采用高效液相色谱法按1.2色谱条件测定玉屏风散饮片样品溶液、标准方剂对照溶液、空白对照溶液与单味药材对照品溶液，得各复方、药对、单味药高效液相色谱指纹图谱，计算各批玉屏风散样品之间、各批玉屏风散样品与标准方剂之间指纹图谱的相似度，对复方指纹图谱中的主要色谱峰进行归属，探讨市售饮片对玉屏风散质量一致性的影响。

2 结果与讨论
2.1 色谱条件优化
采用DAD检测器进行190～400 nm全波长扫描并考察美国安捷伦科技有限公司生产的两种色谱柱Agilent HILIC色谱柱（2.1 mm×100 mm，2.7 μm）与Agilent Eclipse XDB-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）对玉屏风散饮片样品溶液中各成分的分离效果，结果表明前者分离效果差，后者能实现主要色谱峰的分离且色谱峰信息较全。

参考文献［11］，以乙腈-0.05%磷酸水为流动相，优化梯度洗脱程序，玉屏风散饮片样品溶液中各成分实现较好分离，所得谱图基线平稳、峰形理想。

故最终选择Agilent Eclipse XDB-C18色谱柱与乙腈-0.05%磷酸水流动相。

2.2 稳定性试验
取同一玉屏风散饮片样品溶液，分别于制备后 0，2，4，8，12，24 h 进样 6 次进行分析。

按相同方法分析单品药材对照溶液。

结果显示，各主要色谱峰的保留时间无明显变化，相对标准偏差为0.02%～0.18%；色谱峰面积相对标准偏差为0.53%～2.76%（个别色谱峰略高），表明样品溶液在24 h内稳定性良好。

2.3 精密度试验
取同一玉屏风散饮片样品溶液，在1.2色谱条件下连续进样6次进行分析。

按相同方法分析单品药材对照溶液。

结果显示，各主要色谱峰的保留时间无明显变化，相
对标准偏差为0.01%～0.12%；色谱峰面积相对标准偏差为0.62%～2.57%，表明方法的精密度良好。

2.4 重现性试验
取同一批玉屏风散饮片，按1.3方法制备6份样品溶液，在1.2色谱条件下进样分析。

结果显示，各主要色谱峰的保留时间无明显变化，相对标准偏差为0.01%～0.22%；色谱峰面积相对标准偏差为0.79%～3%，（个别色谱略大于3%），表明该方法的重现性良好。

2.5 玉屏风散饮片样品溶液的测定
在1.2色谱条件下测定10批玉屏风散饮片溶液、标准方剂溶液、空白对照溶液与单味药材对照溶液，色谱分别如图1、图2所示。

图1 高效液相色谱指纹图谱
图2 10批玉屏风散饮片溶液高效液相色谱指纹图谱
比较色谱图，确定了22个共有峰，其中5号色谱峰与相邻峰分离度较好且峰面积稳定适中，故选其为参照峰（S）。

通过与空白对照溶液及单味药材对照溶液指纹图谱比较，确定玉屏风散指纹图谱中色谱峰的药材归属。

各共有色谱峰的相对保留时间与相对峰面积见表3。

表3 12批玉屏风散的相对保留时间与相对色谱峰面积注：“+”表示含有该色谱峰，“-”表示不含该色谱峰，S11为含蒙古黄芪的标准方剂，S12为含膜荚黄芪的标准方剂。

峰号相对保留时间相对色谱峰面积黄芪（炒）白术防风S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 S11 S12 1 0.251 0.126 0.067 0.149 0.086 0.187 0.097 0.059 0.085 0.120 0.124 0.106 0.064 - - +2 0.390 1.070 0.122 0.972 0.479 0.584 0.397 0.222 0.458 0.108 0.176 0.309 0.265 + + +3 0.827
4.264 2.179 6.259 1.778 1.922 2.696 1.376 1.986 1.537 2.067 1.006 0.842 - - +4 0.927 2.027 0.321 1.860 0.742 0.925 0.645 1.012 1.039 0.488 1.147 0.555
0.156 + - -5 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000
1.000 1.000 1.000 - - +6 1.113
2.830 2.077 5.551 1.945 1.702 1.506 2.139
2.690 1.451 1.837 0.944 0.701 - - +7 1.212 0.961 0.156 0.778 0.358 0.350 0.257 0.332 0.309 0.201 0.448 0.586 0.212 + - -8 1.332 0.661 0.121 0.520 0.217 0.273 0.281 0.330 0.347 0.191 0.237 0.160 0.040 + - -9 1.370 0.200
0.053 0.192 0.056 0.132 0.082 0.107 0.160 0.057 0.045 0.081 0.052 + - +10
1.433 0.128 0.130 0.161 0.091 0.104 0.091 0.187 0.071 0.115 0.096 0.054 0.051 - - +11 1.523 0.435 0.031 0.240 0.090 0.134 0.059 0.203 0.148 0.043 0.297 0.237 0.044 + - -12 1.643 0.751 0.218 1.208 0.585 0.541 0.214 0.604 0.728 0.499 0.174 0.395 0.068 + - -13 1.684 0.455 0.351 0.976 0.539 0.945 0.734 0.141 0.406 0.486 0.471 0.211 0.205 + - +14 1.860 0.326 0.048 0.187 0.112 0.075 0.096 0.093 0.106 0.063 0.065 0.141 0.027 + - -15
2.030 0.090 0.005 0.045 0.018 0.036 0.039 0.030 0.027 0.015 0.087 0.042 0.057 + - -16 2.042 0.066 0.048 0.170 0.038 0.093 0.087 0.020 0.059 0.046 0.014 0.041 0.032 - + +17 2.155 0.244 0.032 0.129 0.203 0.287 0.055 0.081 0.058 0.063 0.078 0.085 0.076 - - +18 2.178 0.342 0.113 0.431 0.366 0.287 0.145 0.231 0.217 0.251 0.082 0.154 0.029 + - +19 2.202 0.223 0.052 0.257 0.164 0.136 0.059 0.144 0.138 0.078 0.102 0.112 0.043 + - -20 2.226 0.381 0.032 0.265 0.074 0.307 0.041 0.191 0.204 0.167 0.342 0.230 0.117 + - -21 2.339 0.279 0.221 0.603 0.185 0.462 0.364 0.395 0.383 0.148 0.399 0.118 0.131 - + -22 2.415 0.136 0.017 0.095 0.063 0.043 0.025 0.030 0.024 0.021 0.028 0.035 0.037 - - +
将10批玉屏风散色谱图原始数据导入“中药指纹图谱相似度评价系统软件（2004A）”，以S1为参照谱，利用平均值法计算相似度，计算结果见表4。

结果显示，随机选取不同来源的10批玉屏风散指纹图谱差异较大，说明市售药材中化学成分含量有较大的差异，影响了药材的品质。

表4 10批玉屏风散HPLC指纹图谱相似度峰序号 S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 S1 1 0.788 0.882 0.909 0.788 0.834 0.789 0.727 0.666 0.361 S2 0.788 1 0.91 0.779 0.728 0.852 0.728 0.799 0.862 0.523 S3 0.882 0.91 1 0.832 0.732 0.868 0.764 0.771 0.775 0.517 S4 0.909 0.779 0.832 1 0.613 0.687 0.677 0.558 0.524 0.331 S5 0.788 0.728 0.732 0.613 1 0.932 0.751 0.824 0.8 0.416 S6 0.834 0.852 0.868 0.687 0.932 1 0.763 0.821 0.846 0.516 S7 0.789 0.728 0.764 0.677 0.751 0.763 1 0.92 0.83 0.772 S8 0.727 0.799 0.771 0.558 0.824 0.821 0.92 1 0.946 0.697 S9 0.666 0.862 0.775 0.524 0.8 0.846 0.83 0.946 1 0.68 S10 0.361 0.523 0.517 0.331 0.416 0.516 0.772
0.697 0.68 1
中国药典规定中药黄芪有蒙古黄芪与膜荚黄芪两种正品来源，进一步按1.4方法分别制备含蒙古黄芪与膜荚黄芪的标准方剂溶液，建立玉屏风散水提液标准图谱，以S11为参照谱，利用平均值法计算各批玉屏风散指纹图谱与标准图谱的相似度，计算结果见表5。

表5 10批玉屏风散图谱与标准图谱相似度注：标准方剂Ⅰ中黄芪为蒙古黄芪；标准方剂Ⅱ中黄芪为膜荚黄芪。

批次 S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10标准方剂Ⅰ 0.369 0.493 0.461 0.357 0.398 0.462 0.732 0.650 0.639 0.934标准方剂Ⅱ 0.261 0.405 0.378 0.280 0.297 0.391 0.688 0.586 0.572 0.932
由表5可知，各批玉屏风散饮片指纹图谱与标准方剂指纹图谱相比较，有6批相似度低于0.5，3批在0.5～0.8之间，1批高于0.9。

以标准药材的特征指纹峰为
参比，对市售药材制备的玉屏风散进行初步质量评定，随机取样的10个药店中，只有一个药店所采购的药材质量令人满意。

3 结语
高效液相色谱法具有灵敏度高、分析速度快、应用范围广等优点，高效液相色谱指纹图谱技术既能从全化学成分的角度评价中药饮片与复方，又能体现中医整体性的用药特点，方法简便且稳定可靠，该技术在中药质量标准、药效物质基础等方面的研究中具有重要意义。

本次分析结果证明了饮片对复方质量的重要影响，药材生长条件、炮制方法等均会影响中药饮片的质量［13-15］，进而影响复方的质量，控制复方质量是保证中药质量稳定可控、中医治疗安全有效的主要措施。

因此，应将高效液相色谱指纹图谱技术应用于中药全面研究，明确中药药效物质基础，实现饮片与方剂的质量可控。

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