附录ⅩC 干扰素生物学活性测定法
第2法报告基因法（适用于Ⅰ型干扰素）
本法系将含有干扰素刺激反应元件和荧光素酶基因的质粒转染到HEK293细胞中，构建细胞系HEK293puroISRE-Luc，作为生物学活性测定细胞，当Ⅰ型干扰素与细胞膜上的受体结合后，通过信号转导，激活干扰素刺激反应元件，启动荧光素酶的表达，表达量与干扰素的生物学活性成正相关，加入细胞裂解液和荧光素酶底物后，测定其发光强度，，得到标准品溶液生物学活性对其化学发光强度的剂量反应曲线，以此测定Ⅰ型干扰素生物学活性。
试剂（1）完全培养液MEM培养液，含有2mM的L-谷氨酰胺，1mM的丙酮酸钠，0.01mg/L的非必需氨基酸，2μg/ml的嘌呤霉素，100U/ml的青霉素，100μg/ml的链霉素，10%的胎牛血清。4℃保存。
（2）测定培养液除不含嘌呤霉素外，其它成分与完全培养液相同。4℃保存。
（3）PBS 取氯化钠8.0g、氯化钾0.20g、磷酸氢二钠1.44g、磷酸二氢钾0.24g，加水溶解并稀释至1000ml，经121℃、15分钟灭菌。
（4）消化液称取乙二胺四乙酸二钠0.2g、胰酶2.5g，用PBS溶解并稀释至1000ml，除菌过滤。4℃保存。
（5）荧光素酶报告基因检测试剂盒包括细胞裂解液、荧光素酶底物等。
标准品溶液的制备取重组人干扰素生物学活性测定国家标准品，按说明书复溶后，用测定培养液稀释至每1ml约含10000IU。在96孔细胞培养板中，做4倍系列稀释，共8个稀释度，每个稀释度做2孔。在无菌条件下操作。
供试品溶液的制备将供试品按标示量溶解后，用测定培养液稀释成每1ml约含10000IU。在96孔细胞培养板中，做4倍系列稀释，共8个稀释度，每个稀释度做2孔。在无菌条件下操作。
测定法使HEK293puroISRE-Luc细胞在完全培养液中贴壁生长。按1∶4传代，每周2～3次，于完全培养液中生长。取培养的细胞弃去培养液，用PBS洗1次后消化和收集细胞，用测定培养液配制成每1ml含3.5×105～4.5×105个细胞的细胞悬液。将配制完成的标准品溶液和供试品溶液移入可用于细胞培养和化学发光酶标仪测定的96孔细胞培养板中，每孔加入100μl，然后将上述细胞悬液接种于同一96孔细胞培养板中，每孔100μl。于37℃、5%二氧化碳条件下培养18～24小时。小心吸净96孔细胞培养板中的上清液，按荧光素酶报告基因检测试剂盒说明书加入细胞裂解液和荧光素酶底物，用化学发光酶标仪进行测定发光强度，记录测定结果。
试验数据采用计算机程序或四参数回归计算法进行处理。并按下式计算试验结果：
D s×
E s
供试品生物学活性（IU/ml）=P r×------------
D r×
E r
式中P r为标准品生物学活性，IU/ml；
D s为供试品预稀释倍数；
D r为标准品预稀释倍数；
E s为供试品相当于标准品半效量的稀释倍数；
E r为标准品半效稀释倍数。
基因检测可行性运营方案 一．项目介绍 基因是DNA分子上的一个功能片断，是遗传信息的基本单位，是决定一切生物物种最基本的因子；基因决定人的生老病死，是健康、靓丽、长寿之因，是生命的操纵者和调控者。因此，哪里有生命，哪里就有基因，一切生命的存在与衰亡的形式都是由基因决定的，包括您的长相、身高、体重、肤色、性格等均与基因密不可分。 基因检测是通过血液、其他体液、或细胞对DNA进行检测的技术。 基因（Gene,Mendelian factor）是指携带有遗传信息的DNA或RNA序列（即基因是具有遗传效应的DNA或RNA片段），也称为遗传因子，是控制性状的基本遗传单位。基因通过指导蛋白质的合成来表达自己所携带的遗传信息，从而控制生物个体的性状表现。 1. 基因与健康 现代医学研究证明，除外伤外，几乎所有的疾病都和基因有关系。像血液分不同血型一样，人体中正常基因也分为不同的基因型，即基因多态型。不同的基因型对环境因素的敏感性不同，敏感基因型在环境因素的作用下可引起疾病。另外，单独由异常基因直接引起疾病，被称为为遗传病。 可以说，引发疾病的根本原因有三种：
（1）基因的后天突变； （2）正常基因与环境之间的相互作用； （3）遗传的基因缺陷。 绝大部分疾病，都可以在基因中发现病因。 基因通过其对蛋白质合成的指导，决定我们吸收食物，从身体中排除毒物和应对感染的效率。 第一类与遗传有关的疾病有四千多种，通过基因由父亲或母亲遗传获得。 第二类疾病是常见病，例如心脏病、糖尿病、多种癌症等，是多种基因和多种环境因素相互作用的结果。 基因是人类遗传信息的化学载体，决定我们与前辈的相似和不相似之处。在基因“工作”正常的时候，我们的身体能够发育正常，功能正常。如果一个基因不正常，甚至基因中一个非常小的片断不正常，则可以引起发育异常、疾病，甚至死亡。 健康的身体依赖身体不断的更新，保证蛋白质数量和质量的正常，这些蛋白质互相配合保证身体各种功能的正常执行。每一种蛋白质都是一种相应的基因的产物。 基因可以发生变化，有些变化不引起蛋白质数量或质量的改变，有些则引起。基因的这种改变叫做基因突变。蛋白质在数量或质量上发生变化，会引起身体功能的不正常以致造成疾病。 2. 基因检测概念 基因检测是通过血液、其他体液或细胞对DNA进行检测的技术，是取被检测者脱落的口腔黏膜细胞或其他组织细胞，扩增其基因信息后，通过特定设备对被检测者细胞中的DNA分子信息作检测，预知身体患疾病的风险，分析它所含有的各种基因情况，从而使人们能了解自己的基因信息，从而通过改善自己的生活环境和生活习惯，避免或延缓疾病的发生。 基因检测可以诊断疾病，也可以用于疾病风险的预测。疾病诊断是用基因检测技术检测引起遗传性疾病的突变基因。目前应用最广泛的基因检测是新生儿遗传性疾病的检测、遗传疾病的诊断和某些常见病的辅助诊断。目前有1000多种遗传性疾病可以通过基因检测技术做出诊断。
根据来源、基因序列和氨基酸组成分类 I 型干扰素： IFNα、IFNβ、IFN τ、IFN ω 来源：白细胞、成纤维细胞、病毒感染的组织细胞等 功能：抗病毒感染、抗肿瘤生长 免疫调节(较弱） 其中IFN-α为多基因产物，有23种以上的亚型。 II 型干扰素：干扰素γ（IFN ) 来源：活化的T细胞和NK细胞产生 功能：免疫调节 提高单核巨噬细胞、树突状细胞的抗原提呈能力 增强Tc细胞和NK细胞的杀伤活性 抑制TH2细胞形成，下调体液免疫应答 趋化作用 抗病毒和抗肿瘤作用（次要）
2. 根据动物来源确定分类，例如人干扰素（HuIFN），小鼠干扰素（MuIFN）。 免疫调节作用表现在对宿主免疫细胞活性的影响，如对巨噬细胞、T细胞、B细胞和NK细胞等均有一定作用。 ●对巨噬细胞的作用：IFNγ可使巨噬细胞表面MHCⅡ类分子的表达 增加，增强其抗原递呈能力；此外还能增强巨噬细胞表面表达Fc 受体，促进巨噬细胞吞噬免疫复合物、抗体包被的病原体和肿瘤细胞。 ●对淋巴细胞的作用：干扰素对淋巴细胞的作用较为复杂，可受剂 量和时间等因素的影响而产生不同的效应。在抗原致敏之前使用大剂量干扰素或将干扰素与抗原同时投入会产生明显的免疫抑制作用；而低剂量干扰素或在抗原致敏之后加入干扰素则能产生免疫增强的效果。在适宜的条件下，IFNγ对B细胞和CD8+T细胞的分化有促进作用，但不能促进其增殖。IFNγ能增强TH1细胞的活性，增强细胞免疫功能；但对TH2细胞的增殖有抑制作用，因此抑制体液免疫功能。IFNγ不仅抑制TH2细胞产生IL-4，而且抑制IL-4对B细胞的作用，特别是抑制B细胞生成IgE。 ●对其它细胞的作用：IFNγ对其他细胞也有广泛影响：①刺激中性 粒细胞，增强其吞噬能力；②活化NK细胞，增强其细胞毒作用；
附录ⅩC 干扰素生物学活性测定法 第2法报告基因法（适用于Ⅰ型干扰素） 本法系将含有干扰素刺激反应元件和荧光素酶基因的质粒转染到HEK293细胞中，构建细胞系HEK293puroISRE-Luc，作为生物学活性测定细胞，当Ⅰ型干扰素与细胞膜上的受体结合后，通过信号转导，激活干扰素刺激反应元件，启动荧光素酶的表达，表达量与干扰素的生物学活性成正相关，加入细胞裂解液和荧光素酶底物后，测定其发光强度，，得到标准品溶液生物学活性对其化学发光强度的剂量反应曲线，以此测定Ⅰ型干扰素生物学活性。 试剂（1）完全培养液MEM培养液，含有2mM的L-谷氨酰胺，1mM的丙酮酸钠，0.01mg/L的非必需氨基酸，2μg/ml的嘌呤霉素，100U/ml的青霉素，100μg/ml的链霉素，10%的胎牛血清。4℃保存。 （2）测定培养液除不含嘌呤霉素外，其它成分与完全培养液相同。4℃保存。 （3）PBS 取氯化钠8.0g、氯化钾0.20g、磷酸氢二钠1.44g、磷酸二氢钾0.24g，加水溶解并稀释至1000ml，经121℃、15分钟灭菌。 （4）消化液称取乙二胺四乙酸二钠0.2g、胰酶2.5g，用PBS溶解并稀释至1000ml，除菌过滤。4℃保存。 （5）荧光素酶报告基因检测试剂盒包括细胞裂解液、荧光素酶底物等。 标准品溶液的制备取重组人干扰素生物学活性测定国家标准品，按说明书复溶后，用测定培养液稀释至每1ml约含10000IU。在96孔细胞培养板中，做4倍系列稀释，共8个稀释度，每个稀释度做2孔。在无菌条件下操作。 供试品溶液的制备将供试品按标示量溶解后，用测定培养液稀释成每1ml约含10000IU。在96孔细胞培养板中，做4倍系列稀释，共8个稀释度，每个稀释度做2孔。在无菌条件下操作。 测定法使HEK293puroISRE-Luc细胞在完全培养液中贴壁生长。按1∶4传代，每周2～3次，于完全培养液中生长。取培养的细胞弃去培养液，用PBS洗1次后消化和收集细胞，用测定培养液配制成每1ml含3.5×105～4.5×105个细胞的细胞悬液。将配制完成的标准品溶液和供试品溶液移入可用于细胞培养和化学发光酶标仪测定的96孔细胞培养板中，每孔加入100μl，然后将上述细胞悬液接种于同一96孔细胞培养板中，每孔100μl。于37℃、5%二氧化碳条件下培养18～24小时。小心吸净96孔细胞培养板中的上清液，按荧光素酶报告基因检测试剂盒说明书加入细胞裂解液和荧光素酶底物，用化学发光酶标仪进行测定发光强度，记录测定结果。 试验数据采用计算机程序或四参数回归计算法进行处理。并按下式计算试验结果： D s× E s 供试品生物学活性（IU/ml）=P r×------------ D r× E r 式中P r为标准品生物学活性，IU/ml； D s为供试品预稀释倍数； D r为标准品预稀释倍数； E s为供试品相当于标准品半效量的稀释倍数； E r为标准品半效稀释倍数。
髓系细胞中C9orf72抑制STING诱导的炎症 导读 肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)和额颞叶痴呆(FTD)在临床表现、病理和遗传有很多共同点，并且这两种疾病种也都伴随着自身免疫性紊乱。C9orf72基因突变导致蛋白表达降低，大脑和外周血细胞重复突变的RNA和双肽增加累积。本研究完全敲除了小鼠髓系细胞中的C9orf72，进而发现小鼠表现出年龄依赖性淋巴细胞肥大和自身炎症，从C9orf72?/?小鼠中分离出来的树突状细胞显示I型干扰素反应早期激活，而C9orf72?/?髓系细胞对干扰素基因(STING)蛋白刺激因子过度激活，同时自身溶酶体途径对STING的降解减弱，激活了C9orf72?/?免疫细胞中的I型干扰素反应，造成了脾肿大和炎症。此外，还发现缺少一个或两个C9orf72基因拷贝的小鼠更容易患自身免疫性脑炎，这与C9-ALS/FTD患者对自身免疫性病的易感性相似，通过STING抑制剂可以降低I型干扰素。结果表明，C9-ALS/FTD患者由于C9orf72蛋白水平降低无法抑制由STING介导的I型干扰素炎症反应最终导致免疫失调。 实验设计 结果 1 C9orf72敲除小鼠免疫状态改变 C9orf72敲除小鼠表现出淋巴器官增生和年龄相关性全身炎症。研究者发现C9orf72?/?小鼠在8周时出现有轻微炎症和淋巴样增生，在8个月时出现明显的全身炎症。DC亚型在C9orf72?/?小鼠中发育正常，随着年龄的增长CD11b DC细胞上共刺激分子CD86的表达增加（图1. a, b）。C9orf72?/?小鼠胸腺中的T细胞发育正常，但是记忆和效应记忆CD4和CD8 T细胞的数量甚至在8周时就增加了，并且随着年龄的增长变得更加明显(图1.c, d)。 考虑到C9orf72在淋巴细胞中表达水平较低，研究者将C9orf72f l/f l小鼠分别与Cx3cr1C re 和LysM Cre小鼠进行杂交，以确定其髓系细胞的特有表型。C9orf72fl/fl小鼠体内中髓系群体(包括
Dual-Luciferase? Reporter Assay 试剂准备 Luciferase Assay Buffer II 10ml Luciferase Assay Substrate 1vial Stop & Glo? Buffer 10ml Stop & Glo? Substrate, 50X 200ul Passive Lysis Buffer (PLB), 5X 30ml 1.1X PLB: 加1体积的5X Passive Lysis Buffer (PLB)到4体积的dH20中，40C 保存（一个月）。 https://www.doczj.com/doc/054908692.html,R II：将Luciferase Assay Substrate重悬于10ml Luciferase Assay Buffer II 中（-200C保存1个月，-700C保存1年）。 3.1X Stop & Glo 试剂：1体积50X Stop & Glo? Substrate加入49体积的 Stop & Glo? Buffer中（-200C保存15天）。（每次试验需要100ul） 细胞处理 1. 吸除细胞培养液 2. 1X PBS轻柔的冲洗细胞 3. 加入1X PLB（推荐用量） 4.细胞溶解 室温条件下，轻摇细胞15min，
瞬时转染和报告基因实验 采用脂质体介导技术转染。重组质粒分别为p-629/+100，p-401/+100，p-238/+100，p-80/+100，p-25/+100。pGL3- basic为阴性对照;同时以转染phRL-tk(海肾荧光素酶)作内对照。具体转染方法参照转染(Polifectamine Reaent)说明书进行。 1. 将质粒DNA(3.2μg)与phRL-tk (0.8μg)按1:4混合后为A液，混匀30s， PolyFect(QIAGEN)与无血清无抗生素的DMEM按1:50混匀后为B液，混匀30s; 2. A+B混匀(B加入A)15s，室温下孵育5-10 min; 3. 吸出六孔板中的培养液，用无血清无抗生素的DMEM洗3遍，然后加入AB 混合液，每孔0.8mL; 4. 6h后，加入2mL完全DMEM; 5. 24h后，倒出旧培养液，换为完全DMEM; 6. 100μg H2O2或B(a)P处理lh或24h;（200 μM MMS，24h-溶解于Me2SO, Sigma)； （H2O2不引起OGG1升高）
基因工程及其在大肠杆菌生产人干扰素中的应用 一、课程设计目的 了解工业生产中的新型育种技术并比较不同育种技术的优势； 学习理解基因工程育种技术及其操作原理； 研究基因工程育种技术在人干扰素生产中的创新。 二、课程设计题目描述与要求 本文介绍一种二十世纪七十年代发展起来的一种新型生物技术——基因工程，介绍其在育种中的应用。文中重点介绍了基因工程育种的一般步骤，以及近年来出现的运用基因工程进行定向育种的主要新技术：基因的定点突变，易错PCR，DAN重排及基因组重排。之后，应用基因工程育种技术重组大肠杆菌BL21(pBAI)生产人干扰素a2b, 通过优化补料分批培养时葡萄糖的流加策略,提高了hIFNa2b的表达量和表达速率。不同的葡萄糖流加方式有各自的优点,采用恒速流加葡萄糖的方式,hIFNa2b的表达量达到6 540 mg/L,高于目前已知文献中hIFNa2b的最高表达量5 200 mg/L。
三、课程设计报告内容 引言 基因工程是二十世纪七十年代发展起来的一种新型生物技术，其发展从根本上改变了生物技术的研究和开发应用模式。1972年美国的Berg和Jackson等人将猿猴病毒基因组SV 40DNA、λ噬菌体基因以及大肠杆菌半乳糖操纵子在体外重组获得成功。翌年，美国斯坦佛大学的Cohen和Boyer等人在体外构建出含有四环素和链霉素连个抗性基因的重组质粒分子，将之导入大肠杆菌后，该重组质粒得以稳定复制，并赋予受体细胞相应的抗生素抗性，由此宣告了基因工程的诞生。在二十世纪八十年代以来，随着大批大批成果的出现及应用，基因工程带来了一场新的革命。 利用这些技术，可以直接地、有针对性地在DNA分子水平上改造生物的遗传性状。通过转入外源基因，微生物和动、植物细胞可以产生出自身原来没有的蛋白质。同样，利用重组DNA技术，也可以使一些原来存在量极低但有重要工业或医学用途的小分子(抗生素)或蛋白质之外的大分子物质得以大量生产。特别是随着重组DNA技术的完善和发展，以基因水平为核心的现代分子定向育种技术越来越受到工业微生物育种学家的关注，并展示了良好的应用前景。 1、基因工程育种 基因工程育种是在基因水平上，运用人为方法将所需的某一供体生物的遗传物质提取出来，在离体条件下用适当的工具酶进行切割后，与载体连接，然后导入另一细胞，使外源遗传物质在其中进行正常复制和表达引，与前几种育种技术相比，基因工程育种技术是人们在分子生物学指导下的一种自觉的、能像工程一样可预先设计和控制的育种新技术，它可实现超远缘杂交，因而是最新最有前途的一种育种新技术。基因工程技术的全部过程一般包括目的基因DNA片段的取得、DNA片段与基因载体的体外连接、外源基因转入宿主细胞和目标基因的表达等主要环节。 1.1 基因工程育种的一般步骤是： (1)目的基因的获得：一般通过化学合成法、物理化学法(包括密度梯度离心法、单链酶法、分子杂交法)、鸟枪无性繁殖法、酶促合成法(逆转录法)、Norther
干扰素介导的信号转导 学院：生命科学学院 专业：发育生物学 姓名：刘彩云 导师：张立 学号：2011211019 联系方式：liucaiyun121320@https://www.doczj.com/doc/054908692.html,
干扰素介导的信号转导 摘要:IFN-α／β是一类重要的细胞因子,在体内外可介导多种生物学活性,包括 抗病毒、抗肿瘤和免疫调节作用。近来研究表明, IFN-α／β与细胞表面的特异 性受体结合,除了诱导经典的JAK-STAT途径外,还能诱导IRF途径、p38MAPK 途径、IRS-PI3K 途径、CrKL途径等。而且不同的信号途径有一定的交互反应。明 确各种信号传导途径及其介导的生物学效应,有助于了解IFN的作用机制,本文 综述了IFN-α／β发挥其生物学效应所历经的不同信号转导途径。 关键词：IFN-α／β，细胞因子，信号途径 1.前言 干扰素（interferon,IFN）是细胞对相关刺激反应时所产生的细胞信号蛋白质，是细胞因子超家族中一个糖蛋白类同源细胞因子家族，称为IFN家族。已鉴 定出该家族中的3个主要成员：IFN-α、IFN-β和IFN-γ[1]。干扰素通过不同 的信号传导通路发挥不同的生物活性, 其中Ⅰ型干扰素通过含JAK-STAT, MAPK-p38 和 PI3K 这 3 条通路发挥抗病毒、抗细胞增殖及免疫调节等重要作用, 而Ⅱ型干扰素则通过 JAK-STAT 和 MAPK-p38 路径发挥生物学作用, Ⅲ型干扰 素则仅通过 PI3K 通路发挥生物学作用; 这 3 条传导通路包含 98 个基因和 19 693 个 SNPs, 组成了复杂的基因间相互作用网络[2]。近期研究表明，IFN-α 与其受体结合后，可激活多种信号转导途径，从而发挥其抗病毒、抗肿瘤（抗增殖）及免疫调节等多种生物学功能。本文综述IFN-α／β发挥其生物学效应所 历经的不同信号转导途径及其信号转导分子的近期研究进展。 IFN-α／β及其受体 IFN和靶细胞上的受体结合介导其生物学效应。IFN-α、IFN-β共用一个受 体即IFNAR,它由IFNARⅠ和IFNARⅡ两个亚单位组成。IFNARⅡ有两种剪接体,一 种较短,由331个氨基酸组成,命名为IFNAR2b;另一种较长,由515个氨基酸组成, 命名为IFNAR2c。IFNAR2b只含26 个氨基酸,不能传导信号,而IFNAR2c胞内区 较长,由251个氨基酸组成,可传导信号。IFNARⅠ和IFNARⅡ的胞内区无酶活性,
synergistic and antagonistic effects（协同作用和干扰作用） innate and adaptive immunity（先天性和适应性免疫） antiviral agent （抗病毒剂） 一、干扰素分类： 基于与IFNs的结构特征、细胞来源、受体类型以及生物活性，将IFNs分为三种。 1.结构特征： 所有I型IFN组分缺乏内含子，并且聚集在小鼠基因组的4号染色体上，人的染色体9的短臂上。（以单体形式起作用） Ⅱ型干扰素基因具有3个内含子，并且聚集在小鼠基因组的10号染色体上，人的染色体12的长臂上。（以同型二聚体的形式起作用） Ⅲ型干扰素聚集在小鼠基因组的7号染色体上，人的染色体9的上。 2.细胞来源： I型IFN： IFN-α是由造血细胞，特别是浆细胞样细胞、树突状细胞产生的。（而书上说所有细胞均能产生多种） IFN-β是由大多数细胞产生的。（而书上说它是由成纤维细胞产生的） Ⅱ型IFN： IFN -γ主要由T淋巴细胞（主要），天然杀伤细胞和抗原呈递细胞（APC）如单核细胞，巨噬细胞和树突状细胞分泌（在早期宿主细胞感染过程中）。3.受体类型 IFN也是II类细胞因子中的一部分，其他包括6个IL-10相关细胞因子：IL-10，IL-19，IL-20，IL-22，IL-24，和IL-26 以及几种病毒IL-10相关的细胞因子。II类细胞因子都通过在其细胞外结构域中共享共同基序的受体信号，并且表示为II类细胞因子受体家族（CRF2）。 I型IFN受体： 二聚体受体复合物：IFN-α受体1（IFNAR1）和IFN-α受体2（IFNAR2）。II型IFN受体： 两亚基组成的细胞表面受体结合：IFNGR1和IFNGR2。 III型IFN受体： 两个亚基组成的IFN-1受体（IFN1R）：IFN1R1（IL28Rα）和IL10Rβ。 4.生物活性： Ⅰ型干扰素最显著的作用是 （1）抗病毒和抗细胞增殖； （2）调节天然免疫，增强NK细胞和T细胞的毒性； （3）激活适应性免疫系统； （4）在被感染了的细胞及其相邻细胞中诱导产生一种细胞内在的抗微生物
干扰素a-2b与a-2a的区别 干扰素是人和动物细胞受到合适的刺激时产生的一种微量的、具有高度生物学活性的糖蛋白，一般分为I型和Ⅱ型。Ⅰ型干扰素包括α-IFN和β-IFN是由白细胞和成纤维细胞产生，Ⅱ型干扰素，又称γ-IFN或免疫干扰素是由有丝分裂原刺激T淋巴细胞产生。 IFN-α是人体抵抗病毒和细菌侵袭的重要蛋白质，当人体受到病毒感染时，机体内就会产生大量的干扰素。当你得流感时，你就会感受到干扰素的存在，感冒时的发烧、关节痛、全身肌肉酸痛症状就是由于流感病毒感染后，体内产生了大量干扰素蛋白质引起的。IFN-α按氨基酸序列的不同，IFN-α可分为a-1b、a-2a、a-2b等。 临床上用于治疗乙肝和丙肝的干扰素都是基因工程生产的干扰素蛋白质。我们谈干扰素a-2b与a-2a的区别时，指的是两种蛋白质的区别。 干扰素a-2b和干扰素a-2a是干扰素a的两种类型，分别由干扰素a-2b 基因和干扰素a-2a基因产生。干扰素a-2b与a-2a蛋白的不同，根本上，是由于两种干扰素的基因不同。研究表明，干扰素a-2b基因是我们人类本身就有的基因，通过对15000人的干扰素基因分析后发现，人体内没有找到干扰素a-2a基因，这就意味着干扰素a-2b蛋白质是我们人类本来就有的“天然干扰素”，而干扰素a-2a是人本来没有的，是“外来的蛋白质”。 这种基因上的差别有什么意义呢？我们知道，免疫系统最重要功能就是区分什么是“自我的”，什么是“外来的”。当免疫系统认为是自我的蛋白质时，
不进行攻击，相安无事；但是当免疫功能认为是“外来”的蛋白质时，就会把它当做敌人发起攻击，动员免疫细胞，产生出抗体去中和“外来的蛋白质”。干扰素a-2b基因是人本来就有的基因，治疗乙肝时，当干扰素a-2b蛋白（如Intron A，甘乐能）注射入人体后，人体认为是“自我”的蛋白，不会产生中和抗体进行中和；与此相反，由于人本来没有干扰素a-2a基因，当干扰素a-2a被注射入人体后，免疫系统会认为干扰素a-2a是“外来”的蛋白质，从而发动攻击，结果产生“中和抗体”，对体内的干扰素a-2a蛋白进行结合和中和，导致治疗无效或治疗一段时间有效后疾病再次复发。 蛋白质由氨基酸组成，多个氨基酸连接起来就成为蛋白质。如果把氨基酸比做一个一个珍珠，那么蛋白质可以简单地比喻为一串珍珠项链。下面我们看看干扰素a-2b与a-2a的这两串珍珠项链有什么区别。两种干扰素都有165个氨基酸，只有第23位氨基酸不同，干扰素a-2a的第23位是精氨酸，用R表示，干扰素a-2b的第23位是赖氨酸，用K表示。 如果把组成干扰素的氨基酸比做是一个一个字母，那么，干扰素a-2b 与a-2a的区别就只有“一字之差”。但就这“一字这差”，决定了一个是“自我” 的“天然干扰素”，一个是“外来”的干扰素蛋白质。临床应用时，干扰素a-2b 治疗时的中和抗体发生率较低，约6%，而干扰素a-2a的中和抗体发生率高达25%。治疗慢性乙肝或慢性粒细胞白血病时，由于中和抗体的产生，干扰素a-2a的无效或复发率要稍高于干扰素a-2b。
疾病易感基因检测报告 Gene Testing Report
一、基本信息 个人信息： 姓名：XXX 身份证号：XXXXXXX 性别：男 邮寄地址：XXXX 联系电话：XXXX 检测信息表：
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I 型干扰素诱导的信号通路 一、背景 人体在受到病原物感染后， 会激活自身的免疫调节系统 一先天免疫和后天免疫， 来抑制 病毒的入侵和复制。免疫系统会释放一系列细胞因子抵御病原物入侵， 其中对抵御病毒最有 效的就是干扰素(interferon , IFN)。干扰素是一种细胞因子蛋白， 能够激活人体免疫细胞 (如巨噬细胞和天然杀伤细胞)，有效的干扰病毒复制，增强宿主的防御力。受感染的细胞 会释放干扰素，保护宿主细胞免受病毒、寄生虫、细菌等多种病原体的侵袭。在临床治疗中， 重组人干扰素广泛用于治疗乙肝、丙肝、 单纯疱疹、多发性硬化和多种病毒引起的癌症。 目 前，人类发现的干扰素种类已超过了 20种，它们可以分成三大类：I 型干扰素，II 型干扰 素和III 型干扰素。干扰素 a 和干扰素B 是两种典型的I 型干扰素，人类和大多数动物体 内都发现了它们的存在，并且主要产生于病毒感染后的先天免疫反应中。本文主要讨论 I 型干扰素在人体内触发的信号通路。 I 型干扰素在免疫细胞中的产生是由于宿主细胞内的模式识别受体(pattern recognition receptor , PRR 对病原体特殊成分的识别引起的。目前的研究发现，主要有 四种途径会诱导I 型干扰素的产生：DNA 病毒激活第二信使 cGAMP( cyclic GMP-AMP )诱导 途径；RNA 病毒激活 RLRs( RIG-I-like receptors )诱导途径；TLR3 和 TLR4 ( Toll-like receptors )激活适配蛋白TRIF 诱导途径；TLR7/TLR8和TLR9激活转录因子IRF7诱导途径。 I 型干扰素产生后，通过与干扰素受体结合引发进一步的抗病毒反应。 二、I 型干扰素受体 I 型干扰素a 和B 的分子有序列同源性，功能类似，并共用相同的细胞表面受体。 I 型 IRF9 EIF4E i 卄;： 精品文档 精品文档脱氧核糖核酸（DNA）位点测定报告单 NO. 姓名：性别：年龄：身高：体重：民族： 科室：病历号： 病床号： 送检医生： 送检日期： 临床诊断: DNA序列测定结果：（氯吡格雷用药相关基因） 序号检测基因检测位点 检测结果 1 CYP2C19*2 681G>A（rs4244285）GA 2 CYP2C19*3 636G>A（rs4986893）GG CYP2C19*1/*2突变杂合型3 CYP2C19*17 806C>T (rs12248560) CC 4 PON1 576 G > A (rs662) GA：PON1突变纯合型 检测结论：该患者PON1为突变杂合型此基因型氯吡格雷活性代谢物水平减弱，血小板活性较少被抑制。CPY2C19酶活性表达弱，因此，从理论上认为该患者使用常规剂量(75mg/d)的氯吡格雷有一定抵抗风险，应关注血小板等指标，临床可根据实际情况调整方案。 个体化用药建议： 1)目前可使用氯吡格雷标准方案进行抗血小板治疗，但使用氯吡格雷血栓风险中等，特别是半年后引发 支架血栓与心肌梗死风险。应持续关注抗凝效果，如抵抗应及时调整方案，换用其他抗血小板药物。 2)如发生抵抗，建议治疗卒中等脑血管狭窄等可将氯吡格雷换为西洛他唑或双嘧达莫阿司匹林复合剂 型，如心血管狭窄可换用替格瑞洛或使用三抗治疗； 3)或上调氯吡格雷剂量至150mg/d持续1至3个月后根据血小板情况调整方案。 4)如患者同型半胱氨酸水平较高，建议同时补充叶酸,VB6,VB12等药物控制水平。治疗期间应密切关注 患者有无皮肤黏膜及消化道等部位出血的发生，若出现则应调整给药方案，并加用保护胃黏膜药物或PPI类药物，该患者如继续使用氯吡格雷，应尽量避免同时使用奥美拉唑等PPI类药物，可选择如雷贝拉唑等不经CYP2C19代谢的药物； 5)调整给药方案后，应检测血小板聚集率或血栓弹力图以评价临床疗效； 本结论仅根据基因检测结果和循证医学证据得出，具体用药方案，尚需结合患者血小板反应等具体情况综合判断。 说明：氯吡格雷为前体药，主要依赖于CYP2C19代谢生成活性代谢产物，发挥抗血小板疗效。CYP2C19基因存在多态性，其酶有四种不同的代谢类型：快代谢型(RM，*1/*1)；超快代谢型(UM，*1/*17，*17/*17)；中间代谢型(IM，*1/*2，*1/*3，*17/*2，*17/*3)；慢代谢型(PM，*2/*2，*2/*3，*3/*3)。常规剂量的氯吡格雷在慢代谢型患者中产生的活性代谢物减少，抑制血小板聚集作用下降，形成血栓风险增加；在超快代谢型患者中产生活性代谢产物增加，抑制血小板聚集作用增强，出血风险增加。2010年美国FDA修改的 中国科学: 生命科学 2015年 第45卷 第2期: 142 ~ 155 SCIENTIA SINICA Vitae https://www.doczj.com/doc/054908692.html, https://www.doczj.com/doc/054908692.html, 引用格式: 徐刚, 刘实, 朱应. Ⅲ型干扰素最新研究进展. 中国科学: 生命科学, 2015, 45: 142–155 Xu G, Liu S, Zhu Y. Complicated, critical and elusive role of IFN-λ. SCIENTIA SINICA Vitae, 2015, 45: 142–155, doi: 10.1360/N052014-00298 《中国科学》杂志社 SCIENCE CHINA PRESS 中国知名大学及研究院所专栏 武汉大学专题 评 述 Ⅲ型干扰素最新研究进展 徐刚, 刘实, 朱应* 武汉大学生命科学学院, 病毒学国家重点实验室, 武汉 430072 * 联系人, E-mail: yingzhu@https://www.doczj.com/doc/054908692.html, 收稿日期: 2014-10-12; 接受日期: 2014-11-16; 网络版发表日期: 2015-02-03 国家自然科学基金(批准号: 81461130019)资助项目 doi: 10.1360/N052014-00298 摘要 IFN-λ是新发现的分类为Ⅲ型干扰素的细胞因子, 由IFN-λ1, IFN-λ2和IFN-λ3组成, 也称作IL29, IL28A 和IL28B. IFN-λ通过与其受体复合物结合进行信号转导, 该复合物由特异性的IFN-λR1以及与IL-10相关的细胞因子共有的受体IL-10R2组成. IFN-λ主要激活Jak-STAT 通路诱导抗病毒、抗增殖、抗癌以及先天或适应性免疫反应. 其晶体结构与IL-10细胞因子家族相似. 诱导IFN-λ基因表达的通路尚未被研究透彻, 在一定程度上同IFN-α类似, 涉及TRIF, RIG-I 或IRF7通路. IL28B 的核苷酸多态性与丙型肝炎病毒(HCV)的自发性清除及HCV 联合疗法的结果有关联, 预示IFN-λ可以作为替代目前IFN-α治疗HCV 感染的一个更有效的选择. 本文提供了IFN-λ的一些研究进展, 关于IFN-λ的很多机制目前仍是未知的. 关键词 IFN-λ 信号通路 抗病毒 单核苷酸多态性 IFN-λ(interferon-λ)是在2003年被2个独立的研究组共同发现的一种新的Ⅲ类细胞因子家族, 由IFN-λ1, IFN-λ2和IFN-λ3(也称白介素29(interleukin 29, IL29)、白介素28A(IL28A)和白介素28B(IL28B))组成[1,2]. IFN-λ现在统称为Ⅲ型干扰素, 根据其结构特征、受体及生物学功能同Ⅰ型和Ⅱ型干扰素区分 开[3]. 它们利用一个独特的由IFN-λR1(CRF2-12 (cytokine receptor family 2 member 12))和IL-10R2 (CRF2-4)形成的异二聚体受体复合物, 通过Jak-STAT(Janus kinase-signal transducers and activators of transcription)信号通路来进行信号转导, 发挥其生物学功能[4]. IFN-λR1主要存在于上皮组织的细胞, 如角质形成细胞、支气管上皮细胞和肝细胞, 一些免疫细胞也可以产生IFN-λR1; 而IL-10R2则在很多细胞中表达, 同时也是IL-10, IL-22和IL-26受体复合物 的重要组分[2,5,6]. Lind 等人[7]的研究揭示了人类胰岛中Ⅲ型干扰素受体IFN-λR1的表达, 从而为IFN-λ调节胰岛的柯萨奇病毒感染提供了基础, 从某方面说明, 未知的IFN-λR1表达的细胞类型可能是因为很多细胞类型并没有被研究而未被发现. IFN-λ也在相对有限的细胞类型中产生, 主要由先天免疫细胞产生, 如树突状细胞[8,9]、巨噬细胞; 也可以在非免疫细胞中产生, 如上皮细胞[10,11]. IFN-λ主要作用是诱导抗病毒、抗增殖、抗癌和免疫反应[2,12]. 1 IFN-λ和IFN-λR1晶体结构 IFN-λ典型的拓扑学结构特征是由A~F 6个螺旋组成, 6个螺旋以不同长度的环相连接, 其中A, C, D, F 形成一个标准的上-上-下-下四螺旋束(图1), 组成 肿瘤化疗药物基因检测报告解读 DPYD(IVS14+1G>A)基因多态性 二氢嘧啶脱氢酶（DPD ）是5-Fu 代谢过程中的关键酶，DPD 酶活性在人群中存在个体差异，且受DPD 酶基因（DPYD ）多态性的影响。DPYD 基因 IVS14+1G>A 突变几乎完全局限于DPD 酶活性低的患者[1]，该酶活性缺乏可导致5-Fu 体内清除受阻，半衰期显著延长，分解减弱而合成增加，细胞毒性也相应增强[2]。FDA 建议在服用5-Fu 药物前进行 DPYD 基因多态性的检测。 参考文献： [1]van Kuilenburg AB. Eur J Cancer. 2004, 40(7):939-950. [2] Raida M, et al. Clin Cancer Res. 2001, 7(9):2832-2839. MTHFR （C677T ）基因多态性 MTHFR 还原5,10-亚甲基四氢叶酸为5-甲基四氢叶酸，前者是胸苷酸合成的重要原料之一，参与DNA 的合成与修复；后者是体内主要的甲基供体，参与DNA 甲基化[1]。MTHFR 基因677C→T 的突变使223位氨基酸由丙氨酸变为缬氨酸→MTHFR 酶活性降低→5,10-MTHFR 浓度提高：5-FdUMP 与5,10-MTHFR 、TS 形成稳定的共价络合物，干扰DNA 的合成和修复，提高5-FU 抗肿瘤效果[2]。 参考文献 [1] Thomas F, et al. Br J Cancer. 2011, 105(11):1654-1662. [2] Prasad VV , et al. Onkologie. 2011, 34(8-9):422-426. 冻干基因工程α1b干扰素使用说明书 本品系用健康人白细胞中获得的α1b干扰素基因组建杂交质粒，转化大肠杆菌，使之高效表达人α1b干扰素，经高度纯化后冻干制成。本品为微黄色疏松体，每支含α1b干扰素10μg、20μg或30μg，相当于用MDBK/EMC系统测定的效价100万单位，200万单位和300万单位，用于慢性乙型肝炎、丙型肝炎及毛细胞白血病的治疗。 用法 每支用灭菌注射用水1ml溶解，肌内或皮下注射，不得静脉注射，建议晚上给药。剂量及疗程推荐如下： 毛细胞白血病：40～60μg，每天注射一次，连续用药6个月以上。可根据病情适当调整，缓解后可改为隔天注射1次。 慢性乙型肝炎：40μg（20～60μg），每天注射一次，或在用药4周后改为每周3次，连续治疗3个月或更长。 副反应 最常见的副反应为发热和疲劳，常在开始用药阶段出现，多数为低热（38℃以下），一般为一过性。其他副反应有头痛、肌痛、关节痛、食欲不振、恶心等。 常见的化验异常是颗粒白细胞减少和血小板减少，停药后可恢复。 如出现上述患者不能忍受的严重副反应，应减少剂量或停药，并进行对症治疗。 禁忌证 1.已知对干扰素制品过敏者； 2.有心绞痛、心肌梗塞病史以及其他严重心血管病史者； 3.有其他严重疾病，不能耐受本品之副反应者； 4.癫痫和其他中枢神经系统功能紊乱者。 注意事项 1.凡有明显过敏体质，特别是对抗生素有过敏者，本品应慎用，必须使用时应先用本品作皮肤试验（1:100稀释，皮内注射），阴性者方可使用。在使用过程中如发生过敏反应应立即停药，并给予相应治疗。 2.使用前应仔细检查安瓿，如安瓿有裂缝、破损不可使用。在加入灭菌注射用水后稍加振荡，制品应溶解良好，如有不能溶解的块状或絮状物，不可使用。 3.制品溶解后应一次用完，不得分次使用。 https://www.doczj.com/doc/054908692.html, I型干扰素诱导的信号通路 一、背景 人体在受到病原物感染后，会激活自身的免疫调节系统—先天免疫和后天免疫，来抑制病毒的入侵和复制。免疫系统会释放一系列细胞因子抵御病原物入侵，其中对抵御病毒最有效的就是干扰素（interferon，IFN）。干扰素是一种细胞因子蛋白，能够激活人体免疫细胞（如巨噬细胞和天然杀伤细胞），有效的干扰病毒复制，增强宿主的防御力。受感染的细胞会释放干扰素，保护宿主细胞免受病毒、寄生虫、细菌等多种病原体的侵袭。在临床治疗中，重组人干扰素广泛用于治疗乙肝、丙肝、单纯疱疹、多发性硬化和多种病毒引起的癌症。目前，人类发现的干扰素种类已超过了20种，它们可以分成三大类：I型干扰素，II型干扰素和III 型干扰素。干扰素α和干扰素β是两种典型的I型干扰素，人类和大多数动物体内都发现了它们的存在，并且主要产生于病毒感染后的先天免疫反应中。本文主要讨论I型干扰素在人体内触发的信号通路。 I型干扰素在免疫细胞中的产生是由于宿主细胞内的模式识别受体（pattern recognition receptor，PRR）对病原体特殊成分的识别引起的。目前的研究发现，主要有四种途径会诱导I型干扰素的产生：DNA病毒激活第二信使cGAMP（cyclic GMP-AMP）诱导途径；RNA病毒激活RLRs（RIG-I-like receptors）诱导途径；TLR3和TLR4（Toll-like receptors）激活适配蛋白TRIF诱导途径；TLR7/TLR8和TLR9激活转录因子IRF7诱导途径。I型干扰素产生后，通过与干扰素受体结合引发进一步的抗病毒反应。 二、I型干扰素受体 合同号：HY-XXXX 双萤光素酶报告基因检测 （miRNA靶基因验证）实验 和元生物技术（上海）有限公司，2013年4月21日 摘要：本实验使用双萤光素酶报告基因检测系统验证hsa-mir-21对目的基因Tropomyosin 1（TPM1）的抑制作用；通过检测带有TPM1的3’UTR的luciferase在hsa-mir-21过表达时的表达情况，同时结合带有突变预测结合位点的3’UTR的luciferase的表达，进一步确定了hsa-mir-21与TPM1靶基因3’UTR的作用位点。 关键词：hsa-mir-21，3’UTR，Tropomyosin 1（TPM1），Dual-Reporter Assay 1.实验原理: 萤光素酶是理想的报告基因，因为哺乳动物细胞中不含内源性萤光素酶，一旦转录完成立刻就生成功能性的萤光素酶。单报告基因实验往往会受到各种实验条件的影响，而双报告基因则通过共转染的“对照”作为内参为试验提供一基准线，从而可以在最大程度上减小细胞活性和转染效率等外在因素对实验的影响，使得数据结果更为可信。Dual-Luciferase双萤光素酶报告基因检测系统在细胞中同时表达萤火虫萤光素酶和海肾萤光素酶，两者没有种源同源性并对应不同的反应底物，故而没有交叉干扰。得益于超强的光信号和超高的信噪比，本系统被广泛用于miRNA靶基因验证。 由于miRNA主要通过作用于靶基因的3’UTR起作用，可以将目的基因3’UTR区域构建至载体中报告基因luciferase的后面，通过比较过表达或者干扰miRNA后，报告基因表达的改变（监测萤光素酶的活性变化）可以定量反映miRNA对目的基因的抑制作用；结合定点突变等方法进一步确定miRNA与靶基因3’UTR的作用位点。 2.实验目的: 验证hsa-mir-21与靶基因Tropomyosin 1 3’UTR是否发生作用并进一步确定hsa-mir-21与靶基因Tropomyosin 1 3’UTR的作用位点。 浅谈基因工程药物 基因工程药物是指用现代基因重组高科技对基因进行克隆，通过重组DNA导入大肠杆菌、酵母或动物细胞成功构建工程菌株或细胞株，在工程菌株、细胞中所表达生产的新型药物包括细胞因子、多肽类激素、溶血栓药物、疫苗、抗体、反义RNA及基因治疗药物等等多种难治疾病的基因工程药物. 基因工程药物因其疗效好、应用范围广泛、副作用小的特点成为新药研究开发的新宠。也是发展最迅速和最活跃的领域。自1982年美国Lilly公司上市了第一个基因工程产品——人胰岛素以来，至今已有基因工程药物大约140多种上市，尚处于临床试验或申报阶段的基因工程药物有500多种。当传统制药业的增长速度减慢时，基因工程制药正在加速发展，全世界基因工程药物持续6年销售额增长率都在l5％～33％，基因工程制药已成为制药业的一个新亮点[1-2]。 一.目前药物治疗的主要类型 1.胰岛素至今仍是临床上治疗糖尿病最有效的方法。 过去，胰岛素主要从猪等大家畜胰腺中提取。从一头猪的胰腺中只能提取出300单位胰岛素，而一个病人每天就需要40单位胰岛素，因此远远不能满足需要。 基因工程技术一问世，科学家就想到利用该技术来解决胰岛素药源不足的问题。他们首先要找到胰岛素基因，在人的胰岛细胞里有一段特定结构的DNA 分子指挥着胰岛素的合成，然后又找到在人的大肠里存在对人体无害的大肠杆菌。把人的胰岛素基因转入到大肠杆菌的细胞中，随着大肠杆菌的繁殖，胰岛素基因也一代代的遗传下去。大肠杆菌繁殖速度相当快，大约20分钟就能繁殖一代，把它放到大型的发酵罐里进行人工培养，就可以大量繁殖，并且生产出大量人的胰岛素。 1981年，基因重组人胰岛素产品正式投入市场，大肠杆菌成了名副其实的生产胰岛素的“活工厂”，胰岛素供不应求的问题彻底解决了 胰岛素是治疗糖尿病的特效药，长期以来只能依靠从猪、牛等动物的胰腺中提取，100Kg胰腺只能提取4-5g的胰岛素，其产量之低和价格之高可想而知。将合成的胰岛素基因导入大肠杆菌，每2000L培养液就能产生100g胰岛素!大规模工业化生产不但解决了这种比黄金还贵的药品产量问题 2.干扰素： 是哺乳动物细胞在诱导下产生的一种淋巴因子，能够加强巨噬细胞的吞噬作用和对癌细胞的杀伤作用，抑制病毒在细胞内的增殖，用于肿瘤和其他病毒病的治疗。基因工程干扰素干扰素治疗病毒感染简直是“万能灵药”!过去从人血中提取，氯吡格雷基因检测结果报告(汇编)
_型干扰素最新研究进展_徐刚
肿瘤化疗药物基因检测报告解读2012-11-6
冻干基因工程α1b干扰素使用说明书
I型干扰素诱导的信号通路
双萤光素酶报告基因检测 靶基因验证 实验报告
基因工程在疾病治疗方面的应用
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