严重烫伤小鼠主要器官自噬变化的实验研究

细胞自噬过程在肠道菌群调控中的作用研究近年来，细胞自噬被认为是一种维持细胞稳态的重要途径，它可以将不需要的或者受损的细胞器、蛋白质和其它细胞成分通过溶液体系断裂和合并，包裹成小的囊泡，送到溶酶体内分解降解，使得细胞能够再次得到营养和能量的补充。

而最近的研究表明，细胞自噬过程在肠道菌群调控中也起到了非常重要的作用。

肠道菌群是人体内最为复杂的微生物生态系统之一，它在维持人体生理状态、调控免疫系统、调节代谢等方面发挥着重要的作用。

而细胞自噬作为一种保护机制，可以通过调节肠道菌群的数量和种类来维持肠道免疫耐受性、避免肠道菌群异常过度生长，从而达到促进肠道健康的效果。

细胞自噬与肠道菌群调节关系的探索，来源于細胞自噬相关蛋白（ATG）在哺乳动物肠道中的表达和自噬的增强。

研究通过允许研究人员针对哺乳动物中的特定细胞自噬蛋白，以及确定肠道自噬粒体通路是否介导肠道细胞和免疫细胞的丰富。

它可以调节肠道菌群的数量和类型，进而对肠道健康产生积极影响。

此外，在多种器官和疾病模型中，值得注意的是细胞自噬的减少或者异常，包括在哺乳动物中表达Autophagy Gene（ATG）相关蛋白的突变或缺失，都会导致肠道微生物群落的失衡和肠道疾病的发生。

比如，IBD（炎性肠病）、过度活性免疫反应和OXIDATIVE STRESS（氧化应激）都与细胞自噬异常或缺陷有关，因此，肠道细菌群的调节和细胞自噬之间的互动是肠道健康中不可忽视的重要因素和方向。

最近的一份研究表明，雌激素可以通过细胞自噬机制，影响肠道菌群。

在该研究中，科学家给阉割的小鼠器官组织注射雌激素，观察到处理后的肠道菌群中丰度发生了较大变化，尤其是肠道菌属数量的增加。

进一步分析发现，这种变化与雌激素调节细胞自噬机制有关。

雌激素可以增加自噬体的数量，加速自噬流动，帮助细胞更快地腐解垃圾。

这些结果表明，雌激素通过影响细胞自噬，促进了肠道菌群的平衡和稳定。

另一个研究通过分别表达或阻断小鼠自噬相关蛋白 Beclin1，检测发现 Beclin1对肠道菌群稳定和胃肠道健康都有重要的作用。

丁酸钠对严重烫伤大鼠肾血流量和微血管通透性的影响唐富波;郭静;郑金光;白晓东【摘要】目的研究丁酸钠对50％TBSAⅢ度烫伤大鼠肾血流量和微血管通透性的影响.方法雄性SD大鼠48只,体重250～ 270 g,随机分为假烫组、烫伤组和丁酸钠组,每组16只.丁酸钠组和烫伤组分别采用100℃烫伤背部15 s、腹部8s,造成50％总体表面积(TBSA)Ⅲ度烫伤,伤后立即腹腔注射丁酸钠(400 mg/kg)或等体积生理盐水.假烫组采用37℃温水浸泡.于伤后3h和6h采用多普勒血流仪测定肾脏血流量;心脏穿刺取血检测血浆肌酐(Cr);留取肾脏组织检测肾微血管通透性及肾组织含水率.结果烫伤后3h,烫伤组与假烫组比较,血管通透性[(9.53±1.86) μg/ml vs (7.61±0.85)μg/ml]、组织含水率[(78.72±2.07)％vs (61.71±1.86)％]、血Cr[(50.96±5.15) μmol/L vs (23.62±3.06) μmol/L]均增高,血流量明显降低[(39.18 ±6.28)BPU vs (140.6 ±21.18) BPU](均P＜0.05);丁酸钠组与烫伤组比较,组织含水率[(66.95±2.26)％vs (78.72±2.07)％]、血Cr[(33.50±6.82) μmol/L vs (50.96±5.15) μmol/L]均显著降低,血流量明显升高[(47.38±7.59) BPU vs (39.18±6.28)BPU](均P＜0.05).烫伤后6h,烫伤组与假烫组比较,血管通透性[(15.63±1.93)μg/ml vs (7.83±0.92) μg/nl]、组织含水率[(84.92±2.19)％ vs (62.78±1.94)％]、血Cr[(87.37 ±10.11) μmol/L vs (24.25 ±2.81) μmol/L]均增高,血流量明显降低[(23.89±7.43) BPU vs(142.40±23.73) BPU](均P＜0.05);丁酸钠组与烫伤组比较,血管通透性[(11.59±1.77)μg/ml vs (15.63±1.93)μg/ml]、组织含水率[(70.55±1.94)％vs (84.92±2.19)％]、血Cr[(46.00±12.35) μmol/L vs (87.37±10.11) μmol/L]均明显降低,血流量明显升高[(61.80±5.75)BPU vs (23.89±7.43) BPU](均P＜0.05).结论丁酸钠能增加严重烫伤后肾血流量,降低肾微血管通透性和组织含水率,对严重烫伤大鼠的肾脏功能损伤有明显的保护作用.【期刊名称】《武警医学》【年(卷),期】2016(027)001【总页数】4页(P8-11)【关键词】丁酸钠;烫伤;肾脏;组蛋白去乙酰化酶抑制剂【作者】唐富波;郭静;郑金光;白晓东【作者单位】100039 北京,武警总医院烧伤整形科;300309 天津,武警后勤学院;100039 北京,武警总医院医务部科训科;100039 北京,武警总医院烧伤整形科;100039 北京,武警总医院烧伤整形科【正文语种】中文【中图分类】R334.1严重烧伤后常发生肾脏功能损伤，是导致多脏器功能障碍，甚至死亡的重要原因。

项目名称：严重创伤重要组织器官修复再生的细胞与分子机制研究首席科学家：付小兵中国人民解放军总医院起止年限：**依托部门：总后勤部卫生部一、关键科学问题及研究内容(一)拟解决的关键科学问题根据严重创伤后损伤组织修复与再生发生的病理生理过程，结合现代细胞与分子生物学的研究进展，本项目拟解决的关键科学问题是“严重创伤后全身与局部内环境改变对重要组织和器官修复与再生的影响及其相关机制”，主要包括以下四个方面（图1）：1、严重创伤全身性损害对局部组织修复与再生影响的细胞与分子机制。

主要从整体了解严重创伤缺血缺氧导致全身内环境改变与平衡失调对局部组织修复与再生影响的细胞与分子机制等；2、严重创伤局部微环境改变对重要组织器官损伤修复与再生的影响与调控机制。

主要阐明严重创伤后局部微环境改变的特征与相关机制，以及这种改变对组织修复细胞（多种成体干细胞）的诱导分化与重编程作用，明确这些作用对修复速度与质量的影响；3、几种代表性组织器官严重创伤后修复与再生关键的细胞与分子机制。

主要从严重创伤后全身与局部改变的共性机制影响个性机制入手，研究皮肤、肺、骨、软骨与外周神经等代表性组织器官修复与再生的“始动”与调控机制；4、重要组织器官完美修复与再生的关键性制约因素。

解决和突破促进组织修复与再生关键技术的瓶颈，为建立创新的治疗技术和方法打下基础。

(二)主要研究内容根据需要解决的关键科学问题，本项目主要研究内容如下（图1）：1、严重创伤缺血缺氧对组织修复与再生的影响与关键机制。

重点解决缺血缺氧的始动因素以及缺血缺氧导致机体内环境改变影响重要组织器官修复与再生的机制；2、严重创伤免疫紊乱和全身炎症对重要器官修复与再生的影响。

重点解决严重创伤免疫失调和全身炎症导致的内环境紊乱对重要器官修复与再生影响的机制；3、严重创伤局部微环境改变对成体干细胞分化的影响及其与组织器官修复和再生的关系。

重点研究创伤局部微环境改变对主要修复细胞分化的调控作用及其与不同修复结局的关系；4、严重创伤后肺损伤修复与再生机制。

IRF1对LPS诱导的小鼠巨噬细胞凋亡和自噬的调节作用及其机制研究一、本文概述本文旨在深入探究干扰素调节因子1（IRF1）对脂多糖（LPS）诱导的小鼠巨噬细胞凋亡和自噬的调节作用及其潜在机制。

通过系统地研究IRF1在LPS刺激下对巨噬细胞生物学行为的影响，本文期望为理解巨噬细胞在炎症和感染过程中的复杂反应提供新的视角，并为相关疾病的预防和治疗提供理论依据。

本文将概述IRF1和LPS的基本生物学特性及其在巨噬细胞中的功能。

随后，通过构建适当的实验模型，观察IRF1在LPS诱导的巨噬细胞凋亡和自噬过程中的表达变化，并探讨其与凋亡和自噬关键分子的相互作用。

本文还将深入剖析IRF1调节LPS诱导的巨噬细胞凋亡和自噬的分子机制，包括但不限于信号转导通路、基因表达调控等方面。

通过本研究的实施，我们期望能够为理解IRF1在巨噬细胞凋亡和自噬调控中的作用提供新的证据，并为未来开发针对相关疾病的干预策略提供理论基础。

本文还将为其他研究者在巨噬细胞生物学及相关领域的研究提供有益的参考和启示。

二、材料与方法本实验使用的小鼠巨噬细胞系（RAW7）购自中国科学院细胞库。

细胞在含有10%胎牛血清（FBS）和1%抗生素（青霉素/链霉素）的RPMI 1640培养基中，于37°C、5% CO2的恒温培养箱中培养。

LPS（脂多糖，来自大肠杆菌O111:B4）、IRF1（干扰素调节因子1）特异性抑制剂、细胞凋亡检测试剂盒（Annexin V-FITC/PI双染法）、自噬检测试剂盒（LC3B抗体）、Western Blot相关试剂（蛋白裂解液、蛋白Marker、PVDF膜等）均购自Sigma-Aldrich公司。

流式细胞仪（BD Biosciences）、Western Blot电泳及转膜设备（Bio-Rad）、倒置显微镜（Olympus）、CO2恒温培养箱（Thermo Fisher Scientific）等。

RAW7细胞以每孔1×10^6个细胞的密度接种于6孔板中，待细胞贴壁后，用不同浓度的LPS（100 ng/ml）刺激细胞，同时加入或不加入IRF1特异性抑制剂。

巨噬细胞自噬在炎症性疾病中的作用研究进展成梦群; 尹健彬; 张旋【期刊名称】《《中国医药导报》》【年(卷),期】2019(016)021【总页数】4页(P35-38)【关键词】巨噬细胞; 自噬; 炎症性疾病; 免疫【作者】成梦群; 尹健彬; 张旋【作者单位】昆明医科大学药学院暨云南省天然药物药理重点实验室云南昆明650500【正文语种】中文【中图分类】R392巨噬细胞是机体重要的固有免疫细胞之一，具有吞噬、抗原呈递、免疫防御和炎症调节等多种功能。

巨噬细胞通过不同的极化类型参与炎症的发生发展和消退过程。

巨噬细胞可分为两种极化类型：经典激活的巨噬细胞（M1型）和替代激活的巨噬细胞（M2型）。

M1型巨噬细胞主要分泌大量促炎因子，发挥促炎作用和免疫防御功能。

M2型巨噬细胞主要分泌抗炎因子，发挥抗炎作用和促进组织修复功能[1-3]。

自噬是细胞降解受损细胞器、错误折叠蛋白质和病原体的一种代谢过程，也是机体维持细胞自稳态、保证细胞正常分化和功能的重要过程。

研究发现[4-5]，自噬在巨噬细胞吞噬、抗原呈递、调节免疫应答和炎性反应过程中起重要作用。

自噬还能调控巨噬细胞的极化方向，参与脓毒症、急性肺损伤、炎症性肝损伤、动脉粥样硬化、类风湿关节炎等炎症性疾病的进程。

本文主要综述了巨噬细胞自噬在炎症性疾病中的作用研究进展，并对其作为潜在治疗靶点进行了分析。

1 自噬与巨噬细胞1.1 自噬调控巨噬细胞吞噬功能巨噬细胞是抗感染免疫应答过程中的关键细胞，具有强大的吞噬功能，能够识别、吞噬、清除病原体。

巨噬细胞主要通过其表达的模式识别受体识别病原体相关分子被激活，从而吞噬病原体。

巨噬细胞自噬功能下降会影响其吞噬功能。

研究发现，结核分枝杆菌可通过抑制或下调自噬来逃逸巨噬细胞免疫识别和吞噬；抑制自噬可减弱巨噬细胞吞噬金黄色葡萄球菌的能力；而激活自噬可增强巨噬细胞识别与吞噬功能[6-7]。

1.2 自噬调控巨噬细胞抗原呈递功能绝大多数抗原进入机体后，都需经巨噬细胞抗原呈递，启动免疫应答，通过主要组织相容性复合体（MHCⅡ）分子，调节抗原呈递，抵抗微生物的感染。

关于细胞⾃噬的相关研究成果关于细胞⾃噬的相关研究成果姓名：陶宗学院：化学化⼯学院专业：化学学号：160106010012016年度诺贝尔⽣理学与医学奖刚揭晓不久，获奖者为⽇本科学家⼤隅良典（Yoshinori Ohsumi），以奖励他在“细胞⾃噬机制⽅⾯的发现”。

⼀、概述细胞⾃噬这是细胞组分降解与再利⽤的基本过程。

“⾃噬”(autophagy)⼀词源于希腊语前缀“auto-”，意为“⾃我”，以及另⼀个希腊语单词“phagein”，意为“吞⾷”。

因此，⾃噬作⽤的意思⾮常明确，那就是“⾃我吞噬”。

“⾃噬”的概念由⽐利时科学家Christian de Duve 在1963年溶酶体国际会议上⾸先提出，是指⼀些需降解的蛋⽩质和细胞器等胞浆成分被包裹，并最终运送⾄溶酶体降解的过程，⾃噬性降解产⽣的氨基酸和其他⼀些⼩分⼦物质可被再利⽤或产⽣能量。

现已明确，⾃噬的主要功能之⼀实际上是在细胞受到应激性的死亡威胁时保持细胞的存活，这是真核细胞维持稳态、实现更新的⼀种重要的进化保守机制。

虽然⼴义上的⾃噬包括巨⾃噬(macroautophagy)、微⾃噬(microautophagy)和分⼦伴侣介导的⾃噬(chapeon-mediated autophagy)三种类型，通常所说的⾃噬即指巨⾃噬，也是⽬前研究最多的。

对这⼀过程开展研究⾮常困难，这也就意味着我们对其知之甚少。

直到上世纪1990年代，在经过⼀系列出⾊的实验之后，⽇本科学家⼤隅良典利⽤⾯包酵母找到了与⾃噬作⽤有关的关键基因。

随后他开始致⼒于阐明酵母菌体内⾃噬作⽤的背后机制，并发现与之相似的复杂过程也同样存在于我们⼈类的细胞内。

⼤隅良典的研究更新了我们关于细胞物质循环的旧有观点，他的研究开启了理解⾃噬作⽤在许多⽣理过程中关键作⽤的崭新道路，如⽣物体对于饥饿的适应或者机体对于感染的反应。

⾃噬基因的突变会导致疾病的发⽣，⾃噬作⽤机制在⼀些类型的疾病，如癌症和神经疾病等病症中也发挥了作⽤。

自噬在心衰小鼠中的时序性变化、机制及干预研究一、内容描述1. 心衰的定义、流行病学特征及其治疗现状心力衰竭（Heart Failure，简称心衰），作为多种心脏疾病的严重阶段或终末表现，是指心脏结构或功能异常导致心室充盈或射血能力受损，进而使得心输出量减少或不能满足机体代谢需求的一种病理生理状态。

在心衰状态下，心脏泵血功能下降，无法满足全身的基础代谢需求，从而导致一系列临床症状的出现，如呼吸困难、体力活动受限以及体液潴留等。

流行病学特征显示，心衰的发病率和患病率随着年龄的增长而显著上升，尤其在70岁以上的老年人群中，心衰的发病率超过10，且其5年死亡率高达50。

心衰的发生与多种因素有关，包括心肌梗死、心肌病、心肌炎等心脏疾病，以及高血压、糖尿病等慢性疾病的长期影响。

心衰的流行不仅给患者带来沉重的身心负担，同时也给社会医疗资源带来巨大的挑战。

在治疗现状方面，心衰的治疗主要依赖于药物干预、生活方式调整以及必要的器械辅助治疗。

药物治疗主要包括利尿剂、ACEIARB、受体阻滞剂等，旨在减轻心衰症状、改善心脏功能并降低死亡率。

药物治疗的效果往往有限，且存在一定的副作用和耐受性问题。

心脏再同步化治疗（CRT）和植入类型心律转复除颤器（ICD）等器械治疗方法的出现，为心衰的治疗提供了新的选择。

这些方法的应用也受到多种因素的限制，如手术风险、费用问题等。

深入研究心衰的发病机制，探索新的治疗策略和方法，对于改善心衰患者的生活质量、降低死亡率具有重要意义。

本研究将聚焦于自噬在心衰小鼠中的时序性变化、机制及干预，以期为心衰的治疗提供新的思路和方向。

2. 自噬在心衰发生发展中的作用及研究意义自噬在心衰的发生与发展过程中扮演着双重角色，既是预防心衰或减轻心衰症状的积极因素，也可能是心衰病理进程的潜在推手。

这种复杂而微妙的关系，使得对自噬的深入研究对于揭示心衰机制及探索新的治疗策略具有极其重要的意义。

在心衰的初期阶段，适应性自噬作用通过清除细胞内老化、损伤或异常的细胞器和蛋白质，维持心肌细胞的稳态和功能，从而预防心衰的发生或减轻心衰的症状。

第36卷第1期Vol.36 No.l 2021年02月Feb. 2021汕头大学学报(自然科学版)Journal of Shantou University (Natural Science)文章编号：1001 - 4217(2021 )01 - 0076 - 06激光共聚焦扫描显微镜观测自噬小体变化的应用张冰娜*,叶丹彦，张丹桂，李璐，杨旅军（汕头大学医学院第二附属医院转化医学研究中心，广东汕头515041）摘要文章探讨激光共聚焦扫描显微镜技术在检测低氧诱导小鼠心肌细胞损伤自噬小体 变化的应用价值.在无菌条件下，取胚胎型小鼠心肌细胞备用.采用低氧环境+缺氧液方法 诱导心肌细胞损伤并发生自噬现象作为实验组，正常环境下培养细胞的方法作为对照组.待 心肌细胞长到一定程度后，分别利用激光共聚焦扫描显微镜和正置荧光显微镜对免疫荧光 染色的自噬小体表达的LC3A/B 蛋白情况进行观测并比较2种检测方法的优缺点.结果显示 利用低氧环境+缺氧液方法诱导小鼠心肌细胞损伤并自噬小体形成是可行的.与正常对照组 比较，低氧缺氧诱导小鼠心肌细胞损伤组（实验组）自噬小体呈高表达状态.与普通型正置荧 光显微镜比较，激光共聚焦扫描显微镜成像速度快，一次可以获得多副图像且图像清晰.激 光共聚焦扫描显微镜技术具有成像速度快、灵敏度高和精确度高等优点，可以实时、准确 观测低氧诱导小鼠心肌细胞损失自噬小体的表达情况,具有重要临床应用价值.关键词激光共聚焦扫描显微镜；正置荧光显微镜；自噬小体中图分类号TN24 文献标识码A心血管疾病是世界范围内危害人体健康的重要疾病，其中心肌梗死是心血管疾病的 最常见疾病之一•在中国，心血管疾病的发病率和死亡率逐年升高，且呈现年轻化趋势, 严重危害着人们的健康，给社会和家庭带来了巨大的经济和精神负担•研究报道叫心 肌细胞损伤时细胞自噬参与疾病的整个过程并发挥着重要作用•细胞自噬（autophagy ）是 指细胞应对外部环境变化时的一种代谢方式，在基础状态下自噬水平较低，用于维持内 环境的稳态和细胞存活；在缺血缺氧条件下，细胞能量或营养供应不足，导致细胞自噬 被显著激活，激活的自噬小体可用于清除损坏的细胞器或侵入的病原体，广泛参与各种 病理生理过程玖然而，其他研究指出缺血再灌注导致的细胞自噬过度激活，不利于心 肌细胞存活网因此，准确观测细胞自噬小体的变化情况对于理解心肌损伤机制并及时 作出正确干预具有重要临床意义•目前,普通型正置荧光显微镜由于其高分辨率被广泛用于对样品结构和组成成分进 行定位和定性检测•然而，正置显微镜技术存在成像速度慢、精确度有限及荧光散射伪收稿日期：2020-09-23作者简介：张冰娜（1988-）,女（汉族），广东汕头人，助理实验师.研究方向：医学生物细胞学.E-mail : 120853641********.基金项目：高水平大学建设计划临床医学重点建设学科专项资金（粤教科函（2018）181号）第1期张冰娜等：激光共聚焦扫描显微镜观测自噬小体变化的应用77影重等不足.激光共聚焦扫描显微镜(laser confocal scanning microscope,LCSM)作为一种先进的细胞分析仪器，具有高精确度、高分辨率、高灵敏性以及高放大倍数等特性,可以在细胞层面对样本进行断层、逐点、逐行和逐面等快速扫描成像，在生物医学中具有广泛应用价值叫因此，本研究旨在利用激光共聚焦扫描显微镜技术检测低氧诱导小鼠心肌细胞损伤自噬小体变化情况.1材料与方法1.1主要仪器和试剂仪器：激光共聚焦扫描显微镜(LeicaTCSSPE),正置荧光显微镜(OLYMPUS BX51).试剂：含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基(美虱Gibco),0.25%胰蛋白酶，1倍的磷酸盐缓冲液(PBS).细胞：胚胎小鼠心肌细胞.1.2低氧缺氧诱导小鼠心肌细胞自噬小体形成将小鼠心肌细胞消化后接种于铺有盖玻片的六孔板中.待细胞长至80%,低氧诱导组换成缺氧液，于1%02和5%CO2三气培养箱培养3h后复氧1h.1.3免疫荧光染色将低氧缺氧诱导组和对照组的培养基去除干净，PBS洗3次，3min/次.加入4%多聚甲醛固定20min,PBS洗3次，3min/次.加入0.1%TritonX-100透化15min,PBS 洗3次，3min/次.加入山羊血清工作液封闭20min,去除血清，加入稀释的LC3A/B 一抗(1:250,Cell Signaling Technology#4180)4°C孵育过夜.用PBS洗3次，3min/次，避光加入稀释的山羊抗兔荧光二抗(1：500,碧云天，Alexa Fluor488标记山羊抗兔IgG (H+L))37WWlh,用PBS洗3次，3min/次，加入DAPI工作液细胞核衬染(碧云天，Irving Blue(0.5%,SIGMA)细胞浆衬染，PBS洗净后，镜检.(见表1)表1免疫荧光染色结果低氧缺氧诱导组对照组低氧缺氧对照组氯唾抑制阳性组正常阴性组诱导组氯唾抑制阳性组正常阴性组一抗+++---二抗+++++4-注：低氧缺氧诱导组为实验组，氯摩抑制组作为阳性对照组，未做任何处理的正常细胞作为阴性对照组；+为加入抗体，_为不加入抗体1.4应用激光共聚焦扫描显微镜和正置荧光显微镜对图片进行采集激光共聚焦扫描显微镜(Leica TCS SPE)采集：Alexa Fluor488激光激发波长：480〜495nm；Irving Blue激光激发波长：543~575nm；DAPI激光激发波长359nm.同时采集绿色、红色、蓝色以及三色叠加图•正戦光显微镜(OLYMPUS BX51)采集：选择荧光滤镜：1-DAPI、2-FITC,3-Rhod,78汕头大学学报（自然科学版）第36卷分别采集蓝色、绿色、红色图像，然后通过软件将3图进行合并.2结果2.1低氧缺氧诱导小鼠心肌细胞自噬小体形成细胞在氯座抑制下出现了明显的自噬小体•利用低氧环境+缺氧液方法诱导小鼠心肌细胞损伤并自噬小体形成是可行的•与正常对照组比较，低氧缺氧诱导小鼠心肌细胞损伤组自噬小体呈高表达状态.2.2正置显微镜和激光共聚焦显微镜检测自噬小体表达情况的差异正置显微镜和激光共聚焦显微镜检测自噬小体表达情况如图1（见封3）.自噬小体分泌的抗原可以与Alexa Fluor488标记的LC3A/B抗体结合，呈现绿色；DAPI衬染细胞核为蓝色；Irving Blue衬染细胞浆呈红色；3者叠加图（Merge）可清晰观察自噬小体在心肌细胞内的位置及表达情况•与正置显微镜比较，激光共聚焦显微镜成像速度快，图像清晰及灵敏度高.3讨论细胞自噬是真核细胞内一种非常重要的生理过程，主要通过亚细胞膜结构的变化并经溶酶体介导对细胞内的细胞器、蛋白质和膜磷脂进行降解，维持细胞合成和代谢的平衡，进而维持细胞内环境的稳定•本实验结果发现低氧缺氧诱导小鼠心肌细胞损失可以引起自噬小体高表达，与既往类似研究适度刺激引起的细胞自噬作用对缺氧心肌细胞具有一定保护作用的结果基本一致旦细胞自噬起始于自噬小体的形成，当细胞自噬被激活时，自噬小体表达的LC3发生膜型转化，主要分布在细胞膜上；细胞自噬未被激活时，LC3仍停留在细胞浆内，呈散在块状分布阿现在普遍观点认为,在心肌病变早期细胞自噬被认为是一种保护性机制•然而，有研究指出过度激活细胞自噬，不利于心肌细胞的存活孔因此，快速准确检测细胞自噬时自噬小体的表达情况对于指导临床干预具有重要应用价值.免疫荧光法是目前检测自噬小体的常用方法，主要仪器包括普通正置荧光显微镜和激光共聚焦扫描显微镜•普通正置荧光显微镜由于操作方便、费用低和仪器比较普遍等特点被广泛应用于实验研究•然而，正置荧光显微镜在使用过程中只能局限于单个波长拍照，之后再合并不同通道的图像，存在成像速度慢等缺点.另外，正置荧光显微镜会随着次级荧光的干扰，使图像清晰度下降，同时也会受曝光时间、增益影响，出现不同荧光染料的交叉干扰，无法在需要高灵敏度的实验中获取精确图像叫除此之外，正置荧光显微镜需要人肉眼观察得出结果，存在主观因素的干扰，无法客观准确地对自噬小体的位置和含量进行评估.激光共聚焦扫描显微镜作为一种先进的荧光成像技术，主要利用激光作为扫描光源，采用光源针孔与检测针孔共辄聚焦技术，对样本进行快速的点、线或二维图像成像R叫由于激光束的波长较短，光束很细，其分辨率大约是普通光学显微镜的3倍.另外，激光共聚焦扫描显微镜不仅可以通过多通道荧光捕获技术同时第1期张冰娜等：激光共聚焦扫描显微镜观测自噬小体变化的应用79获取多标记荧光图像，减少多色荧光之间的波段叠加，抑制图像的模糊；还可以与其他多种先进技术兼容达到联合应用的目的叫总之，激光共聚焦扫描显微镜已成为分子生物学、形态学、细胞学、药理学和遗传学等领域强有力的研究工具.随着科学研究的不断深入，激光共聚焦扫描显微镜在细胞结构㈣、核酸及蛋白质问、细胞内自由基活性四、细胞内钙离子浓度变化问、膜电位网等生命科学研究中发挥重要的作用•近年来，新开发的高速活细胞双转盘式共聚焦系统进一步提高了检测的灵敏度、图像的采集速度，同时降低了光毒性•因此，激光共聚焦扫描显微镜具有检测速度快、灵敏度高、定位精确和多色荧光成像等优点，可以直接探测活细胞在化学因子、细胞因子或激素等作用下所致的离子细微动态变化,是目前检测自噬小体变化的最为先进仪器之一.参考文献[1]李伟愍，自噬增强对缺氧心肌细胞活性的影响[J].中国现代药物应用，2020(15)：242-244.[2]WANGM,LI Y J,DING Y,et al.Silibininprevents autophagic cell death upon oxidative stress in corticalneurons and cerebral ischemia-reperfusion询ury卩].Mol Neurobiol,2016,53:932-943.⑶曹原，沈涛，黎健，应激状态下的心脏自噬：自噬作用是有益还是有害？[J].生理科学进展，2015(4)：309-313.[4]武美娜，李新毅，白玮，等.激光共聚焦扫描显微镜技术在大鼠皮层神经元细胞内钙离子浓度动态测定中的应用[J].中国药物与临床，2008(7)：530-532.[5]浦延鹏，周佳明.当归挥发油对缺氧/复氧损伤大鼠心肌细胞H9C2自噬的调控作用研究[J].中国药房，2020(31)：2492-2497.[6]杨侃，李晓宁，GIDEON O,等.一种优化小鼠成纤维细胞中自噬小体示踪的方法[J].中国组织化学与细胞化学杂志，2017,26(1)：65-71.[7]于湘华，刘超，柏晨，等.光片荧光显微成像技术及应用进展[JJ.激光与光电子学进展，2020(57)：9-23.[8]ADRIANA IM,CONSTANTIN C,MIHAI L,et al.Current and future applications of confocal laserscanning microscopy imaging in skin oncology[J].Oncology letters,2019,17(5)：4102-4111.[9]郑易，楼永良.激光扫描共聚焦显微镜技术在医学院校创新型实验教学中的应用[J].温州医科大学学报，2020,50(10)：859-860.[10]吴伟全，王思捷，李元歌，等.激光扫描共聚焦显微镜及透射电镜观察肺癌A549细胞亚细胞结构溶酶体的对比分析[J].临床医学工程，2013(6)：666-66&[11]杨怡姝，王小利，沈思嗣，等.激光扫描共聚焦显微镜原位检测核酸及蛋白质的实验教学设计[J].实验技术与管理，2011,28(2)：58-60.[12]廖钢陵，吴元德.超氧阴离子自由基对大鼠肝卵圆细胞胞内自由钙浓度的影响[J].基础医学与临床，2000(4)：79-81+90.[13]刘洋，王丽婷，冉海莹，等.激光共聚焦显微镜检测双酚A损伤精母细胞后钙离子的浓度变化[J].科学咨询(科技•管理)，2017(23)：60-61.[14]林元相，徐如祥，姜晓丹，等.激光共聚焦扫描显微镜动态观察体外培养大鼠皮层神经元受氯化亚铁作用时过氧化物水平及膜电位的变化[J].中国临床康复，2006,10(17)：45-48+195.80汕头大学学报（自然科学版）第36卷Application of Laser Confocal ScanningMicroscope in Observing AutophagyZHANG Bingna,YE Danyan,ZHANG Dangui,LI Lu,YANG Lvjun(Research Center of Translational Medicine,Second Affiliated Hospital ofShantou University Medical College,Shantou515041,Guangdong,China)Abstract To investigate the application value of laser confocal scanning microscopy(LSCM)in detecting the changes of autophagy bodies in hypoxic-induced myocardial injury in mice.Under aseptic condition,cardiomyocytes of embryonic type mice were taken for standby.The experimental group was treated with hypoxic environment and hypoxia solution to induce myocardial cell injury and autophagy,and the control group was cultured in normal environment.After the cardiomyocytes grew to a certain extent,the LC3A/B protein expression of autophagosome was observed by laser confocal scanning microscope and forward fluorescence microscope,respectively. The advantages and disadvantages of the two methods were also compared.It is feasible to induce myocardial cell injury and autophagy in mice by hypoxia environment and hypoxia pared with the normal control group,the autophagy of the mice myocardial cell injury group(experimental group)was highly pared with the normal fluorescent microscope,the laser confocal scanning microscope has a fast imaging speed,and can obtain multiple images at a time and the image is ser confocal scanning microscope has the advantages of fast imaging speed,high sensitivity and high accuracy.It can be used to observe the expression of autophagy in mice cardiomyocytes induced by hypoxia in real time and accurately,and has important clinical application value.Keywords laser confocal scanning microscope;fluorescence microscope;autophagosomes8正置荧光显微镜Irving BlueLC3A/BDAPI Merge(A)激光共聚焦显微镜LC3A/B Irving BlueDAPI Merge(B)（A）正置显微镜在（40x10）倍时显示自噬小体欠清晰；（B）激光共聚焦显微镜在（40x10）倍时可清晰显示自噬小体在细胞内的位置及含量变化。

《p62及其互作蛋白Vps34在LPS诱导的小鼠巨噬细胞自噬中的作用》篇一摘要：本文旨在探讨P62及其互作蛋白Vps34在LPS（脂多糖）诱导的小鼠巨噬细胞自噬过程中的作用。

通过实验研究，我们发现P62和Vps34在自噬过程中扮演着关键的角色，并相互协同以促进自噬的发生。

本文将详细介绍实验设计、方法、结果及讨论。

一、引言自噬是一种细胞内降解机制，它能够帮助细胞通过溶酶体消化处理不需要的或损伤的细胞成分。

在炎症反应中，自噬对于维持细胞内环境的稳定和清除有害物质具有重要意义。

P62作为一种重要的自噬相关蛋白，与多种互作蛋白共同参与自噬过程。

Vps34作为自噬关键激酶，其作用也不容忽视。

因此，本研究将关注P62和Vps34在LPS诱导的小鼠巨噬细胞自噬中的作用。

二、材料与方法1. 实验材料本实验使用小鼠巨噬细胞系作为研究对象，LPS作为诱导剂，以及相关抗体用于免疫印迹分析等实验操作。

2. 实验方法（1）细胞培养与处理：小鼠巨噬细胞系在适宜条件下培养，并分别进行LPS刺激处理。

（2）免疫印迹分析：利用特定抗体检测P62和Vps34的表达水平及其互作情况。

（3）自噬检测：通过检测自噬小体的形成和LC3B蛋白的转化来评估自噬水平。

三、实验结果1. P62和Vps34的表达变化LPS刺激后，小鼠巨噬细胞中P62和Vps34的表达水平均有所上升，表明二者在自噬过程中具有重要作用。

2. P62与Vps34的互作关系通过免疫印迹分析发现，P62与Vps34之间存在明显的互作关系，二者可能共同参与自噬过程。

3. 自噬水平的变化LPS刺激后，小鼠巨噬细胞的自噬水平明显升高，表现为自噬小体增多和LC3B蛋白的转化增加。

而当P62或Vps34的表达受到抑制时，自噬水平明显降低。

四、讨论本研究表明，P62和Vps34在LPS诱导的小鼠巨噬细胞自噬过程中发挥着重要作用。

P62作为自噬相关蛋白，参与自噬小体的形成和降解过程；而Vps34作为自噬关键激酶，参与自噬膜的形成和扩展。

细胞自噬与器官功能修复机制研究进展细胞自噬是一种广泛存在于真核生物中的重要细胞代谢途径，通过分解细胞内的有害分子、蛋白质以及损坏的细胞器，维持细胞内的稳态。

细胞自噬在维持细胞内环境稳定、调节细胞发育和适应环境变化等方面发挥着重要的作用。

最近的研究表明，细胞自噬还参与了器官功能修复。

细胞自噬是通过一系列的过程来完成的。

首先，细胞将要分解的细胞器或蛋白质包裹在一个双层的囊泡中，形成自噬体。

接着，自噬体与溶酶体融合，内部的物质被酶降解。

最后，释放出来的营养物质被细胞再利用。

近年来的研究发现，细胞自噬在器官功能修复过程中起到了重要的作用。

例如，肝脏是一个可以自我修复的器官，当肝脏受到损伤时，细胞自噬会被激活。

研究表明，通过促进细胞自噬的活性，可以加速肝脏的修复和再生过程。

另外，心脏、肺脏以及肾脏等器官的修复也与细胞自噬密切相关。

这些研究成果为新治疗方法的开发提供了有力的证据。

细胞自噬在器官功能修复中起作用的机制主要包括以下几个方面。

首先，细胞自噬可以清除损坏的器官细胞以及细胞器。

在细胞自噬过程中，细胞内的有害蛋白质和病理性细胞器被包裹在自噬体中，随后被降解并再利用。

这个过程有助于清除衰老和有损功能的细胞，为修复和再生提供了空间。

其次，细胞自噬可以调控免疫和炎症反应。

在器官损伤后，炎症反应是修复过程中的一个重要环节。

细胞自噬可以调节免疫细胞的活性和炎症反应的程度，从而促进炎症的缓解和修复的进行。

此外，细胞自噬还参与了器官干细胞的活化和功能的修复。

干细胞是一种具有自我更新和分化能力的特殊细胞，可以在受损组织中分化为不同类型的细胞，从而促进器官的修复。

最近的研究表明，细胞自噬可以通过调控干细胞的增殖和分化，参与器官干细胞的活化和功能的修复。

细胞自噬与器官功能修复之间的关系还需要进一步的研究。

目前，细胞自噬在器官功能修复中的作用还不完全清楚，并且有些研究结果相互矛盾。

因此，我们需要更多的实验和临床研究来验证并深入理解细胞自噬与器官功能修复之间的关系。

小鼠皮肤烫伤模型的建立任鹏;官大威;赵锐;马文翔;张书韬【期刊名称】《法医学杂志》【年(卷),期】2012(028)002【摘要】目的建立用于热损伤研究的小鼠皮肤烫伤动物模型. 方法小鼠麻醉后,使用沸水在其背部烫出直径1cm的圆形烫伤区,沸水接触时间分别为10s和25s.烫伤后1、3、5、7和10d处死动物.对不同损伤时间点皮肤取材,进行肉眼和组织学检查. 结果 10s烫伤组,烫伤累及全层皮肤,程度为深Ⅱ°；25 s烫伤组烫伤累及全层皮肤及背部肌肉,程度为Ⅲ°.结论该模型采用简单的方法成功制作出较为稳定的皮肤烫伤模型,为以后的皮肤热损伤研究奠定了一定的基础.【总页数】4页(P92-94,99)【作者】任鹏;官大威;赵锐;马文翔;张书韬【作者单位】中国医科大学法医学院法医病理学教研室,辽宁沈阳110001;中国医科大学法医学院法医病理学教研室,辽宁沈阳110001;中国医科大学法医学院法医病理学教研室,辽宁沈阳110001;中国医科大学法医学院法医病理学教研室,辽宁沈阳110001;大连市中级人民法院,辽宁大连116012;中国医科大学法医学院法医病理学教研室,辽宁沈阳110001;黑龙江省公安厅刑事技术总队,黑龙江哈尔滨150008【正文语种】中文【中图分类】DF795.1【相关文献】1.不同深度皮肤烫伤的动物模型建立 [J], 王宫;程佑民;吴华嵩2.不同深度皮肤烫伤的动物模型建立 [J], 王宫;程佑民;吴华嵩;3.MRSA气溶胶诱导烫伤SKH-1无毛小鼠皮肤感染合并肺炎模型 [J], 刘巧玲;朱萍妹;杨玉琴;刘芳;陈颖;周文江;周光兴4.小鼠皮肤烫伤模型的建立 [J], 康静静;焦哲;苏博威;张金花;李慧平;;;;;5.采用电切法建立小鼠皮肤线形深Ⅱ°烫伤模型 [J], 刘雪来;李龙;李索林;宋岩彪;杜娟;靳晓次;郑颖龙;费川;张永婷因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

诺贝尔⽣理学或医学奖:细胞⾃噬机理2019-06-032016年10⽉3⽇，瑞典卡罗林斯卡医学院诺贝尔⽣理学或医学奖委员会宣布，2016年诺贝尔⽣理学或医学奖授予⽇本科学家⼤隅良典，因为他发现了细胞⾃噬的机理。

⼤隅良典独⾃获得800万瑞典克朗（约合⼈民币625万元）奖⾦。

细胞⾃噬是什么？⾃噬是细胞内的⼀种“⾃⾷”现象。

细胞⾃噬已经被研究⼈员研究了60多年，⽬前的定义是，细胞⾃噬是指⽣物膜（⼤部分表现为双层膜，有时多层或单层）包裹部分细胞质和细胞内需要降解的细胞器、蛋⽩质等形成⾃噬体，并与内涵体形成⾃噬内涵体，最后与溶酶体融合形成⾃噬溶酶体，降解其所包裹的内容物，以实现细胞稳态和细胞器的更新。

通俗地讲，细胞⾃噬就是细胞的⾃我吞噬，通常发⽣在细胞或者机体缺乏能量、或受到环境胁迫，如缺乏氨基酸、缺氧的情况下，细胞⾥会产⽣双层膜结构，包裹⾃⼰的⼀部分细胞器，运送到溶酶体进⾏降解。

⾃噬的出现是因为细胞在新陈代谢过程中会不断产⽣受损伤的细胞器，如受损的线粒体、蛋⽩质聚合体等，这就需要细胞清理它们。

通过⾃噬作⽤，组织和细胞对⾃⾝不断地清理，以保持细胞的稳态平衡。

这个作⽤有点像⼈⽤吸尘器清洁卫⽣，⽤以吸收室内各种脏东西，从⽽保持室内清洁和⼲净。

⾃噬这个单词源于希腊语，希腊语单词前缀auto意为“⾃我”，另⼀个希腊语单词phagein意为“吞⾷”，⼆者组合成⼀个词就是⾃我吞噬。

最早研究细胞⾃噬并提出这⼀概念的并⾮⼤隅良典，⽽是⽐利时科学家杜夫。

他在20世纪50年代通过电镜观察细胞的内部情况时，发现了溶酶体，是细胞内的⼀种细胞器，其功能是处理细胞摄⼊的营养物质并分解较⼤的颗粒。

与此同时，他也发现了⾃噬现象，并且在1963年溶酶体国际会议上⾸先提出了“⾃噬”的概念。

因此，他和他的同事、电⼦显微镜专家克洛德和帕拉迪分享了1974年诺贝尔⽣理学或医学奖。

细胞中有三种类型的⾃噬：⼤⾃噬、⼩⾃噬和伴侣介导的⾃噬。

⼤⾃噬始于杯状双层隔离膜的形成（也称为⾃噬膜或隔离膜）。

细胞自噬的历史与展望自噬研究的历史自噬autophagy一词源自希腊语，在1963年由比利时生物化学家德迪夫（C. de Duve）针对在细胞中观察到的自噬现象而命名。

希腊语里，auto-意为自己，phagein意为吃掉，中文译为自噬。

自噬是指细胞对不必要或受损的细胞器进行吞噬、降解及再利用的过程，自噬过程既能发生在各种极端情况下以确保细胞存活，也存在于细胞的正常状态下，以维持细胞的稳态平衡。

自噬现象最初由洛克菲勒研究所（Rockefeller Institute）的波特（K. R. Porter）和他的学生阿什福德（T. Ashford）于1962年报道，当时他们观察到胰高血糖素刺激后，大鼠肝细胞中的溶酶体（lysosomes）增加，更有意思的是，在移动到细胞中心的一些溶酶体中检测到来自其他细胞器如线粒体的成分。

当时他们错误地以为这个现象只是溶酶体的形成过程，并不认为溶酶体是像线粒体一样存在于细胞质中的细胞器，且将观察到的水解酶理解为是由微体产生的。

1963年，赫鲁班（Z. Hruban）等报道了局部细胞质降解的超微结构，该报道参考了1955年德国科学家的损伤诱导融合模型，观察到了从细胞质融合到生成溶酶体的三个连续步骤，并提出这个过程不仅由损伤阶段诱发，而且在细胞分化的生理阶段，同样的过程也在“细胞器处置”和“细胞成分再利用”中行使功能。

这篇报道引起了当时也在洛克菲勒研究所工作的德迪夫的兴趣，与之前波特的看法不同，德迪夫把这种现象命名为自噬（autophagy），并提出在胰高血糖素引发的肝细胞降解过程中溶酶体发挥了功能。

1967年德迪夫连续发表两篇文章证实胰高血糖素诱发的自噬是由溶酶体介导的，他也由此成为第一位报道溶酶体参与细胞自噬的科学家[1]。

1974年德迪夫因发现细胞结构及功能性器官（溶酶体和过氧物酶体），与另外两位科学家共享了该年度的诺贝尔生理学或医学奖。

尽管自噬现象的命名人德迪夫成为诺奖获得者，但在大隅良典开始他的酵母模型试验之前，自噬并未得到生物学家的特别关注，因而几乎没有研究者再对其进行深入研究。

第２８卷第６期Ｖｏｌ．２８，Ｎｏ．６滨州学院学报Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｎｚｈｏｕ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ２０１２年１２月Ｄｅｃ．，２０１２细胞凋亡、坏死、自噬的检测方法与技术收稿日期：２０１２－０４－２８第一作者简介：卢建美（１９８６—），女，山东滨州人，硕士，主要从事生物化学与分子生物学研究，Ｅ－ｍａｉｌ：ｗａｔｅｒ．１８６０＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｎ．卢建美，赵云峰（曲阜师范大学生命科学学院，山东曲阜２７３１６５） 摘　要：目前普遍认为细胞的死亡途径有细胞凋亡、细胞坏死及自噬３种，其中细胞凋亡一直是医学界为治疗癌症而不懈努力研究的方向，而自噬是近几年研究的热点．现对这３种死亡方式及其各自的检测方法作一简要概述． 关键词：凋亡；坏死；自噬；检测方法 中图分类号：Ｑ　２５５ 文献标识码：Ａ 文章编号：１６７３－２６１８（２０１２）０６－０１１４－０７１　凋亡、坏死及自噬的概述１．１　细胞凋亡细胞凋亡现象由Ｋｅｒｒ在１９６５年首次发现，并在１９７２年首次提出这一概念．细胞凋亡（Ａｐｏｐｔｏ－ｓｉｓ）是一个主动的由基因决定的自动结束生命的过程．在细胞凋亡过程中，细胞膜反折包裹断裂的染色质片段或细胞器与胞体分离，形成众多的凋亡小体，随后凋亡小体被邻近的细胞吞噬，整个过程中细胞膜保持完整，无内容物溢出，从而不会引起炎症反应．细胞凋亡同增殖一样，是维持机体细胞数量动态平衡的基本措施．在胚胎发育阶段通过细胞凋亡清除多余的和已完成使命的细胞，保证了胚胎的正常发育；在成年阶段通过细胞凋亡清除衰老和病变的细胞，保证了机体的健康．细胞凋亡调控紊乱会导致一系列疾病的发生，如自身免疫病，阿尔茨海默病等．对细胞凋亡的研究除了有助于阐明一系列免疫病的病发机制外，还能为肿瘤治疗提供新的疗法，即重建肿瘤细胞的凋亡信号传递系统，抑制肿瘤细胞生存基因的表达，使肿瘤细胞走向凋亡，而不引起炎症反应，从而不会影响机体健康．这也正是细胞凋亡的研究如此受关注的原因．１．２　细胞坏死细胞坏死是极端的物理化学因素或严重的病理性刺激引起的细胞损伤和死亡．坏死过程中细胞器膨胀变形，染色质随机降解，细胞膜发生渗漏，导致细胞内容物释放到胞外，从而引起炎症反应．此外，未得到及时清除的凋亡细胞也会发生胞膜破裂溶解、胞浆外泄并引发炎症反应的现象，即发生继发性坏死，这在体外培养细胞及巨噬细胞发生功能障碍的机体中较为常见．细胞坏死曾被认为是偶然的不能控制的退化，但近期的研究表明，细胞坏死可能是细胞“程序性死亡”的另一种形式，具有包括引发炎症反应在内的重要生理功能．当细胞凋亡不能正常发生而细胞必须死亡时，坏死作为凋亡的“替补”方式被采用．１．３　细胞自噬１９６２年，Ａｓｈｆｏｒｄ和Ｐｏｒｔｅｒ在人肝细胞中首次观察到自噬（ａｕｔｏｐｈａｇｙ）［１］．自噬，即自体吞噬，是一种存在于正常细胞和病态细胞中的非选择性降解机制，是细胞内长寿蛋白降解的主要途径．它的主要作用是在应激状态下为细胞生长代谢提供必要的大分子物质和能量，并清除细胞内过剩或有缺陷的细胞器．在癌症治疗中，自噬是一把双刃剑，既能抑制肿瘤细胞的生存又能产生促生存效应，造第６期卢建美，赵云峰　细胞凋亡、坏死、自噬的检测方法与技术成治疗抵抗［２］．如何调节自噬使其发挥肿瘤抑制活性，成为肿瘤治疗的新靶点，这是近几年研究的热点，所以对于自噬的检测也成了一种迫切需要．１．４　三者之间的关系细胞凋亡、坏死和自噬是３种不同的细胞死亡方式，共同维持着机体的自我平衡，在肿瘤发生发展中起重要的作用．一直以来，自噬被认为是一种细胞生存的机制，随着研究的深入，发现自噬具有双重性，首先是作为细胞的保护机制防止细胞死亡，但是当自噬达到一定水平就会促使细胞走向凋亡［３］．因此自噬通常先于凋亡，进而启动凋亡．而当发生凋亡的细胞未得到及时清除时便会导致继发性坏死，出现胞膜破裂溶解、胞浆外泄并引发炎症反应的现象．研究发现其机制为ｃａｓｐａｓｅ酶能切割与自噬有关的蛋白Ｂｅｃｌｉｎ１、Ａｔｇ５、Ａｔｇ４Ｄ，导致Ｂｅｃｌｉｎ１及Ａｔｇ５失去自噬诱导活性，而发挥促凋亡作用［４］．切割后的Ａｔｇ４Ｄ自噬活性及促凋亡活性均增加［５］．由此细胞从自噬走向凋亡．凋亡可以抑制坏死．坏死与聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（ＰＡＲＰ）导致的ＡＴＰ过度消耗及其产物介导的线粒体凋亡诱导因子释放有关．凋亡时激活的ｃａｓｐａｓｅ面每切割ＰＡＲＰ使其失活，从而抑制ＡＴＰ的过度消耗，防止坏死发生［６］．王晓东等人发现了诱导细胞坏死的关键蛋白ＲＩＰ３［７］，并发现ＲＩＰ３蛋白表达量的高低是控制细胞凋亡或细胞坏死的关键，如果ＲＩＰ３表达量高，细胞则走向坏死；ＲＩＰ３表达量低，细胞则走向凋亡．由此可见，三者之间的关系是比较复杂的，三者之间相互协调，共同维持机体结构及功能的稳定．２　检测方法细胞凋亡、坏死及自噬无论在生化代谢途径，还是形态学方面都有显著的区别，可以根据其各自的特点，运用一定的检测手段将其区分开来．２．１　细胞凋亡检测２．１．１　细胞凋亡的形态学检测方法凋亡细胞会发生形态学上的改变，一般认为凋亡细胞的形态学改变是判断其凋亡的基础．在光学显微镜下可以观察到凋亡细胞大体形态的改变，如贴壁生长的凋亡细胞外形皱缩、圆化，细胞的体积变小，凋亡晚期可以观察到凋亡小体．经吖啶橙或Ｈ３３２５８染色后，在荧光显微镜下可以观察到活细胞核染色质呈现均匀分布的黄绿色或蓝色荧光，而凋亡细胞核染色质的荧光浓聚在核膜内侧，因此凋亡细胞核的特征性形态可以被清晰地辨认．在电子显微镜下可以清晰地观察到凋亡细胞超微结构的改变，如细胞表面微绒毛消失，核染色质凝聚、边缘化，细胞器集中，胞膜起泡．凋亡晚期的细胞可观察到凋亡小体或可见凋亡小体被邻近巨噬细胞吞噬的现象．激光共聚焦显微镜除用于普通形态学观察外，还可以对凋亡细胞内的大分子进行初步定位［８］．实验证实１０μｍｏｌ／Ｌ的ＭＭＰＴ作用于Ｈ１７９２细胞４８ｈ后，倒置相差显微镜下可以观察到凋亡小体及胞膜起泡，荧光显微镜下部分细胞呈现明显的染色质凝集现象［９］．此外利用荧光显微镜还可以定性地观察转染效率的高低［１０］．形态学观察法与其他方法相比更形象、更直观、更容易被接受．一般实验研究的首选是进行形态学检测．电镜形态学观察曾一度被认为是判断凋亡最经典、最可靠的方法，是鉴定细胞凋亡的金标准［１１］．然而形态学检测法也有一定的局限性，如只能定性不能定量，且在判定时存在一定的主观性．另外，扫描电镜及透射电镜的样品处理过程比较繁琐，且价格昂贵．２．１．２　凋亡细胞的ＤＮＡ检测分析细胞凋亡的一个最主要特征是ＤＮＡ发生核小体间的断裂，产生含有不同数量核小体单位的片段，大小为１８０～２００ｂｐ的整数倍，在进行琼脂糖凝胶电泳时就形成了特征性的梯状条带（ＤＮＡｌａｄｄｅｒ）．但是当凋亡细胞数量少无法直接应用琼脂糖电泳观察凋亡细胞核ＤＮＡ的变化时，可以通过连接介导的ＰＣＲ专一性地扩增核小体的梯形片段再进行琼脂糖电泳，从而提高检测的灵敏度．此外，对凋亡细胞ＤＮＡ的检测分析还包括ＤＮＡ末端标记检测：原位切口平移（ＩＳＮＴ）和ＤＮＡ断裂的原位末端标记法（ＴＵＮＥＬ）．其原理都是将标记的核苷酸连接到断裂ＤＮＡ的３’羟基末端，再通过酶联显色或荧光检测定量分析结果．酶联免疫吸附法（ＥＬＩＳＡ）也是常用的检测细胞凋亡的方法，其原理是在吸附有组蛋白抗体的微孔板上加入核小体５１１滨州学院学报第２８卷上清液，核小体组蛋白与抗体结合，当加入过氧化物酶标记的ＤＮＡ抗体后，它们与核小体上的ＤＮＡ结合，并对过氧化物酶底物产生显色反应，再用酶标仪对凋亡细胞进行定量分析．罗迪贤等人证实ＴＯＦＡ和ＤＮＲ处理的细胞经琼脂糖凝胶电泳后，其ＤＮＡ出现特征性的梯状条带［１２］．ＴＵＮＥＬ染色后，经电针刺处理的小鼠大脑皮层变薄并伴有局部神经元丢失［１３］．经ＥＬＩＳＡ法证实，随着ＭＭＰＴ作用时间的延长和药物浓度的增加，肺癌Ｈ１７９２细胞内核小体水平逐渐升高，表明凋亡细胞数逐渐增加［９］．ＤＮＡ检测分析与电镜检测法一样也被认为是判断细胞凋亡的金标准，但是它只能对晚期凋亡细胞进行检测．琼脂糖凝胶电泳法简单易行，但灵敏度不高，且需要的细胞数量较多．ＴＵＮＥＬ荧光素标记法灵敏度高，且可以测定在细胞周期中ＤＮＡ发生断裂的具体时相，但是不能检测只发生ＤＮＡ大片段断裂的凋亡细胞，不能定量，且容易出现坏死细胞的假阳性．ＥＬＩＳＡ法不需要特殊仪器，但不能精确测定凋亡发生的绝对量．２．１．３　细胞凋亡相关基因的表达检测细胞凋亡时有些基因表达异常，这些基因的产物促进或抑制凋亡发生．因此检测这些基因的表达也成了确定细胞是否发生凋亡的手段之一．基因的表达包括转录和翻译两个过程，因此可以分别从转录水平和翻译水平进行检测．（１）相关基因转录水平的检测①ＲＴ－ＰＣＲ检测凋亡相关基因的表达变化细胞发生凋亡时，细胞内如Ｂｃｌ－２家族、Ｃａｓｐａｓｅ家族成员表达异常，可以用ＲＴ－ＰＣＲ对这些基因的表达进行半定量测定．首先提取细胞总ＲＮＡ，并添加要检测基因及内参基因的引物，进行ＲＴ－ＰＣＲ反应，随后通过琼脂糖凝胶电泳进行半定量检测［１４－１５］．②荧光定量ＰＣＲ检测细胞凋亡近年来，实时荧光定量ＰＣＲ作为一种新的技术在检测基因表达水平方面得到了广泛的应用，与ＲＴ－ＰＣＲ相比，其具有操作简单，反应快速，灵敏度高等优点．原理是ＰＣＲ扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针的两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团．探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；ＰＣＲ扩增时，Ｔａｑ酶的５’端～３’端外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，实现荧光信号的累积与ＰＣＲ产物形成完全同步．步骤是提取细胞总ＲＮＡ，设置反转录反应体系反转录成ｃＤＮＡ，取１μＬ　ｃＤＮＡ，加入Ｔａｑ酶等进行实时荧光定量ＰＣＲ扩增，根据得到的ＣＴ值分别与其相对应的内参（一般为β－ａｃｔｉｎ）的ＣＴ值相减进行校正得到校正ＣＴ值，从而相对定量计算ｍＲＮＡ含量［１６］．（２）相关基因翻译水平的检测①酶活检测凋亡有３条信号通路，每条通路都有其特征性酶，如ｃａｓｐａｓｅ４或ｃａｓｐａｓｅ１２是内质网通路特有的酶，而ｃａｓｐａｓｅ９为线粒体途径所特有，因此检测这些特征性的酶对于确定具体的凋亡途径具有重要的意义．对于酶活检测，可以选用特定的试剂盒，如碧云天的ｃａｓｐａｓｅ４试剂盒，原理是ｃａｓｐａｓｅ４能催化底物Ａｃ－ＬＥＶＤ－ｐＮＡ产生黄色的ｐＮＡ，用分光光度计或酶标仪测ｐＮＡ在４０５ｎｍ处的吸光度，根据标准曲线换算成酶活力单位．②Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ检测蛋白表达Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ又称蛋白质印迹，是一种蛋白质的固定和分析技术，现在被广泛用于检测蛋白水平的表达．将已用聚丙烯酰胺凝胶或其他凝胶电泳分离的蛋白质转移到硝酸纤维素滤膜上，固定在滤膜上的蛋白质成分保留抗原活性，第一抗体与特异性抗原决定簇结合，再用荧光标记（用同位素或非同位素）的第二抗体来检测．③免疫组化免疫组化与Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ一样，也是利用了抗原与抗体特异性结合的免疫学原理，它通过化学反应使标记抗体的显色剂显色，以此对组织细胞内抗原其进行定位、定性及定量研究．一般要用到石蜡切片技术．经ＲＴ－ＰＣＲ和ＳＤＳ聚丙烯酰胺凝胶电泳检测显示，二甲胂酸通过调节鼠表皮细胞内Ｂｃｌ－２、Ｂａｄ和ｃａｓｐａｓｅ１２的ｍＲＮＡ水平和蛋白表达水平来诱导凋亡［１７］．而ＰＣＳＫ９ｓｉＲＮＡ通过Ｂｃｌ／Ｂａｘ—ｃａｓｐａｓｅ９—ｃａｓｐａｓｅ３途径抑制ｏｘ－ＬＤＬ诱导的脐静６１１第６期卢建美，赵云峰　细胞凋亡、坏死、自噬的检测方法与技术脉内皮细胞凋亡［１８］．通过检测细胞内特定基因的表达变化可以明确细胞的凋亡途径．荧光定量ＰＣＲ与Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交相比更快更准确，能显著提高检测的特异性和灵敏度，同时，它要求操作也必须非常精确．Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ检测法灵敏度高，但是只能做半定量分析，且部分药品毒性较大．２．１．４　凋亡细胞的流式细胞仪检测流式细胞仪是对细胞进行自动分析和分选的装置，是现代高科技多学科高度发展、综合的结晶，是目前定量测定细胞凋亡的重要方法之一．细胞凋亡时的许多特征性变化都可以用流式细胞仪检测出来．（１）磷脂酰丝氨酸外翻检测用荧光素ＦＩＴＣ标记的Ａｎｎｅｘｉｎ　Ｖ进行磷脂酰丝氨酸外翻检测．Ａｎｎｅｘｉｎ　Ｖ是一种Ｃａ２＋依赖性磷脂结合蛋白，能与磷脂酰丝氨酸特异性结合．正常细胞的磷脂酰丝氨酸位于细胞膜内侧，荧光素ＦＩＴＣ标记的Ａｎｎｅｘｉｎ　Ｖ不能与ＰＳ结合．而凋亡早期，细胞的磷脂酰丝氨酸外翻到细胞膜表面，从而能与Ａｎｎｅｘｉｎ　Ｖ特异性结合．坏死细胞由于胞膜不完整，Ａｎｎｅｘｉｎ　Ｖ也可以与ＰＳ结合．为了将凋亡与坏死区分开来，一般采用Ａｎｎｅｘｉｎ　Ｖ与ＰＩ双染．ＰＩ是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，因此可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来．即正常活细胞为Ａｎｎｅｘｉｎ－／ＰＩ－均低染；凋亡细胞Ａｎｎｅｘｉｎ＋高染、ＰＩ－低染；继发性坏死细胞Ａｎｎｅｘｉｎ＋／ＰＩ＋均高染．（２）凋亡细胞的ＤＮＡ检测ＰＩ虽不能透过完整的细胞膜，但经打孔后可以进入细胞插入到ＤＮＡ碱基对之间，用流式细胞仪检测掺入的ＰＩ荧光强度，即为ＤＮＡ含量．细胞凋亡时，ＤＮＡ发生断裂，膜通透性升高，一部分小分子ＤＮＡ可透出细胞外，使细胞内ＤＮＡ含量低于正常细胞，故在正常的Ｇ０／Ｇ１峰前常有一亚二倍体峰出现［１９］，即为凋亡峰（ＡＰ峰）．根据亚二倍体峰的高低可计算出凋亡细胞百分率．（３）凋亡细胞的周期检测利用流式细胞仪还可以检测出某种药物使细胞周期阻滞于哪个时期，来确认处于什么周期的细胞更易发生凋亡．如盐霉素可以使经辐射处理的癌细胞阻滞于Ｇ２期［２０］，而经表没食子儿茶素没食子酸酯（ＥＧＣＧ）处理的ＨＴ－１０８０细胞停滞于Ｇ０／Ｇ１期［２１］．此外，利用流式细胞仪还可以对细胞进行线粒体膜电位及细胞内氧化还原态的检测等．流式细胞仪检测显示，盐霉素能使经辐射处理的癌细胞阻滞在Ｇ２期，且能引起ＤＮＡ片段化［２０］．通过Ａｎｎｅｘｉｎ　Ｖ／ＰＩ双染显示Ｈ２Ｏ２能有效诱导树突状细胞走向凋亡，为治疗植物抗宿主病及自身免疫病等提供了新的方向［２２］．流式细胞仪常用作细胞凋亡的定量分析，具有简便、快速、特异性好、灵敏度高等特点，可以分别从ＤＮＡ及膜分子水平进行多方位的检测．但是也存在一定的局限性，如检测中漏检率和错检率很高，周期检测时固定过程难控制等．２．２　细胞坏死检测２．２．１　形态学检测方法同凋亡一样，坏死的细胞也有其独特的形态学变化．借助显微镜可以观察到坏死细胞体积及细胞器肿胀，细胞核稀疏成网状，细胞膜破裂引起内容物外溢等现象．２．２．２　ＤＮＡ检测分析细胞坏死的另一特点是染色质随机降解．因此ＤＮＡ电泳条带呈弥散状，而非规则的梯状条带．２．２．３　ＰＩ染色法通常采用Ａｎｎｅｘｉｎ－Ｖ和ＰＩ双标法对凋亡细胞与坏死细胞加以鉴别．凋亡早期，磷脂酰丝氨酸外翻，但膜具有完整性，因此凋亡细胞呈Ａｎｎｅｘｉｎ－Ｖ单标阳性．坏死细胞膜不具完整性，呈Ａｎｎｅｘｉｎ－Ｖ和ＰＩ双染阳性．同凋亡不同，细胞坏死会引发周围组织发生炎症反应，不利于机体健康，因此单独研究坏死的文献较少．根据细胞坏死特征所采用的检测方法可以将细胞坏死与凋亡区分开来．２．３　细胞自噬检测２．３．１　自噬泡的观察透射电子显微镜的超微结构观察一直被认为是检测自噬的金标准［２３］．在透射电子显微镜下，可以观察到自噬的特征性变化即自噬泡及自噬溶酶体形成的全过程．首先在肿胀变形的细胞器周围出现双层膜空泡状结构，继而包裹待降解物质形成自噬体，随后与溶酶体融合形成自噬溶酶体．７１１滨州学院学报第２８卷透射电镜观察显示，暴露在香烟中的部分卵泡上皮细胞发生自体吞噬，细胞内形成许多清晰可见的自噬泡［２４］．而Ｐ５３靶基因ＩＳＧ２０Ｌ１敲除能降低细胞自噬泡水平［２５］．透射电镜观察结果形象、直观，甚至可以观察到自噬的全过程，但是存在一定的主观性，且样品处理过程比较繁琐，价格昂贵．２．３．２　单丹（磺）酰戊二胺染色法单丹（磺）酰戊二胺（ＭＤＣ）染色法是自噬发生过程中分析分子水平机制的一种非特异的检测自噬体方法．ＭＤＣ是自噬囊泡示踪剂，能与自噬囊泡膜上的Ａｔｇ８特异性结合，因此其阳性结构可代表自噬囊泡［２６］，在荧光显微镜下可观察自噬囊泡的数量．顺铂作用于食管鳞状上皮细胞后，用ＭＤＣ对自噬囊泡染色，结果显示实验组自噬泡数量明显高于对照组，而经自噬抑制剂３－ＭＡ诱导后，自噬泡数量照组的５０％左右［２７］．由于ＭＤＣ染色法不具有自噬特异性，且假阳性较高，因此只有当自噬效应得到了肯定后，用此方法分析效应强度才有意义．２．３．３　自噬体膜上标志性蛋白质检测微管相关蛋白１的轻链３（ＬＣ３）是目前检测自噬的唯一标志蛋白［２８］，定位在自噬体分隔膜上，在自噬体形成各阶段的内外膜及自噬溶酶体膜上也可见到．通过与绿色荧光蛋白（ＧＦＰ）结合来示踪自噬形成．在正常细胞中，自噬特异性蛋白ＬＣ３呈低水平表达，且均匀地弥散在胞浆中，在荧光显微镜下呈现均匀的绿色荧光．而细胞发生自噬后，ＬＣ３表达增加并转位至自噬体膜，在荧光显微镜下形成多个明亮的绿色荧光斑点，斑点的个数用来评价自噬活性的高低［２９］．用Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ法可以检测细胞内ＬＣ３的相对含量，评价自噬水平．激光共聚焦显微镜检测显示，低氧条件下内皮细胞内含ＬＣ３－ＧＦＰ颗粒的自噬小体明显增多［３０］．Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ检测显示顺铂作用于食管鳞状上皮细胞后，实验组Ｂｅｃｌｉｎ　１与ＰＩＫⅢ含量明显升高，而加入自噬抑制剂３－ＭＡ诱导后能恰好抵消Ｂｅｃ－ｌｉｎ　１与ＰＩＫⅢ表达的上调，且能降低ＬＣ３－Ⅰ的含量及减少ＬＣ３－Ⅰ向ＬＣ３－Ⅱ的转变［２７］．Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测法特异性强，灵敏度高，但是只能做半定量分析，且部分药品毒性较大．此外还有间接自噬体检测法、吖啶橙染色法等．３　结语由于不同药物触发的细胞死亡途径有多种，而每种检测方法也都有一定的局限性，因此在研究某一药物的作用机制时可以同时采用多种检测方法．例如在测定细胞活力时可采用四唑盐比色实验，也可以采用染料排斥实验进行细胞计数绘制生长曲线．在检测细胞内凋亡蛋白ｃａｓｐａｓｅ酶的表达时，可以用ＲＴ－ＰＣＲ及荧光定量ＰＣＲ半定量测定其ｍＲＮＡ含量，也可以采用试剂盒直接测定该酶的活性或用免疫印迹实验在翻译水平测定其蛋白表达量．在检测细胞核的凋亡变化时，可以通过吖啶橙或Ｈ３３２５８染色对凋亡细胞核进行形态学观察，也可以通过琼脂糖凝胶电泳对ＤＮＡ进行定性分析．总之药物作用机制的检测方法有很多，在实验过程中应该根据具体情况及实验目的进行筛选．细胞是一个复杂的有机体，凋亡、坏死及自噬是细胞自我调控维持机体稳定的３种形式，研究其各自的检测方法有助于为癌症及肿瘤治疗提供可靠的依据．目前对细胞的这３种调控方式已日渐明朗，检测手段也日益成熟，但是对三者之间的相互关联的分子机制还知之甚少．受刺激诱导以后，细胞又是如何特异性地选择了其中之一走向了死亡，还有待进一步研究．参　考　文　献：［１］　Ａｓｈｆｏｒｄ　Ｔ　Ｐ，Ｐｏｒｔｅｒ　Ｋ　Ｒ．Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ　ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ　ｉｎ　ｈｅｐａｔｉｃ　ｃｅｌｌ　ｌｙｓｏｓｏｍｅｓ［Ｊ］．Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９６２，１２：１９８－２０２．［２］　Ｃｈｅｎ　Ｎｉｎｇ，Ｖａｓｓｉｌｉｋｉ　Ｋａｒａｎｔｚａ．Ａｕｔｏｐｈａｇｙ　ａｓ　ａ　ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ　ｔａｒｇｅｔ　ｉｎ　ｃａｎｃｅｒ［Ｊ］．Ｃａｎｃｅｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ＆Ｔｈｅｒａｐｙ，２０１１，１１（２）：１５７－１６８．［３］　Ｖｉｃｅｎｃｉｏ　Ｊ　Ｍ，Ｇａｌｌｕｚｚｉ　Ｌ，Ｔａｊｅｄｄｉｎｅ　Ｎ，ｅｔ　ａｌ．Ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ，ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｏｒ　ａｕｔｏｐｈａｇｙ？Ｗｈｅｎ　ａ　ｄａｍａｇｅｄ８１１第６期卢建美，赵云峰　细胞凋亡、坏死、自噬的检测方法与技术ｃｅｌｌ　ｍｕｓｔ　ｄｅｃｉｄｅ　ｉｔｓ　ｐａｔｈ－ａ　ｍｉｎｉ－ｒｅｖｉｅｗ［Ｊ］．Ｇｅｒｏｎｔｏｌｏｇｙ，２００８，５４（２）：９２－９９．［４］　Ｋａｂｅｙａ　Ｙ，Ｋａｍａｄａ　Ｙ，Ｂａｄａ　Ｍ，ｅｔ　ａｌ．Ａｔｇ１７ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ　ｉｎ　ｃｏｏｐｅｒａｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　ａｔｇ１ａｎｄ　ａｔｇ１３ｉｎ　ｙｅａｓｔａｕｔｏｐｈａｇｙ［Ｊ］．Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ　Ｃｅｌｌ，２００５，１６（５）：２５４４－２５５３．［５］　Ｄｊａｖａｈｅｒｉ－Ｍｅｒｇｎｙ　Ｍ，Ｍａｉｕｒｉ　Ｍ　Ｃ，Ｋｒｏｅｍｅｒ　Ｇ．Ｃｒｏｓｓ　ｔａｌｋ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ａｎｄ　ａｕｔｏｐｈａｇｙ　ｂｙｃａｓｐａｓｅ－ｍｅｄｉｕａｔｅｄ　ｃｌｅａｖａｇｅ　ｏｆ　Ｂｅｃｌｉｎ－１［Ｊ］．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２０１０，２９（１２）：１７１７－１７１９．［６］　Ｚｏｎｇ　Ｗ　Ｘ，Ｔｈｏｍｐｓｏｎ　ＣＢ．Ｎｅｃｒｏｔｉｃ　ｄｅａｔｈ　ａｓ　ａ　ｃｅｌｌ　ｆａｔｅ［Ｊ］．Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ，２００６，２０（１）：１－１５．［７］　Ｈｅ　Ｓｕｄａｎ，Ｗａｎｇ　Ｌａｉ，Ｍｉａｏ　Ｌｉｎ，ｅｔ　ａｌ．Ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｋｉｎａｓｅ－３ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｓ　ｃｅｌｌｕｌａｒ　ｎｅｃ－ｒｏｔｉｃ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｔｏ　ＴＮＦ－α［Ｊ］．Ｃｅｌｌ，２００９，１３７（６）：１１００－１１１１．［８］　Ｓｕｎ　Ｈｏｎｇｘｉａ，Ｘｉａ　Ｑｉａｎｇ，Ｔａｎｇ　ｗｅｎｃｈｅｎｇ，ｅｔ　ａｌ．Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｄｉｅｔａｒｙ　ｎｉｃｋｅｌ　ｏｎ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｏｆ　ｈｅｍｏｃｙｔｅｓｏｆ　Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｌｉｔｕｒａ（Ｆａｂｒｉｃｉｕｓ）ｌａｒｖａｅ［Ｊ］．Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｂｕｌｌｅｔｉｎ，２０１０，５５：３９０－３９７．［９］　Ｚｈａｏ　Ｙｕｎｆｅｎｇ，Ｌｉ　Ｘｉｕｌａｎ，Ｈｕ　Ｚｕｎｌｉ，ｅｔ　ａｌ．ＭＭＰＴ：ａ　ｔｈｉａｚｏｌｉｄｉｎ　ｃｏｍｐｏｕｎｄ　ｉｎｈｉｂｉｔｓ　ｔｈｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｏｆｌｕｎｇ　ｃａｎｃｅｒ　Ｈ１７９２ｃｅｌｌｓ　ｖｉａ　Ｆａｓ－ｍｅｄｉａｔｅｄ　ａｎｄ　ｃａｓｐａｓｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｐａｔｈｗａｙ［Ｊ］．ＩｎｖｅｓｔＮｅｗ　Ｄｒｕｇｓ，２０１０，２８：３１８－３２５．［１０］　孙威，刘宝林．靶向Ｐｌｋ１的ｓｉＲＮＡ对肝癌细胞凋亡的影响［Ｊ］．世界华人消化杂志，２０１１，１９（２７）：２８２２－２８２８．［１１］　Ｃｏｍｐｔｏｎ　Ｍ　Ｍ，Ｃｉｄｌｏｗｓｋｙ　Ｊ　Ａ．Ｒａｐｉｄ　ｉｎ　ｖｉｖｏ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄｓ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ　ｏｆ　ｒａｔ　ｌｙｍ－ｐｈｏｃｙｔｅ　Ｇｅｎｏｍｉｃ　ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄ［Ｊ］．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１９８６，１１８：３８－４５．［１２］　罗迪贤，李波平，高治平．ＴＯＦＡ协同柔红霉素诱导肠癌细胞株ＨＣＴ－８细胞凋亡［Ｊ］．中南医学科学杂志，２０１１，３９（５）：５１４－５２１．［１３］　Ｚｈａｏ　Ｊｉａｎｘｉｎ，Ｔｉａｎ　Ｙｕａｎｘｉａｎｇ，Ｘｉａｏ　Ｈｏｎｇｌｉｎｇ，ｅｔ　ａｌ．Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｅｌｅｃｔｒｏａｃｕｐｕｎｃｔｕｒｅ　ｏｎ　ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌａｎｄ　ｃｏｒｔｉｃａｌ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｉｎ　ａ　ｍｏｕｓｅ　ｍｏｄｅｌ　ｏｆ　ｃｅｒｅｂｒａｌ　ｉｓｃｈｅｍｉａ－ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ　Ｉｎｊｕｒｙ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｔｒａ－ｄｉｔｉｏｎａｌ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２０１１，３１（４）：３４９－３５５．［１４］　胡志坚，江永青．ｓｉＲＮＡ抑制ＮＦＢＤ１基因表达对人肝癌ＨｅｐＧ２细胞凋亡的影响［Ｊ］．中国卫生检验杂志，２０１１，２１（１０）：２３７３－２３７６．［１５］　贾广乐，王众．镉诱导大鼠肾细胞凋亡及其机理的研究［Ｊ］．生态毒理学报，２００８（３）：２６８－２７３．［１６］　郭晓慧，于小玲．实时荧光定量ＰＣＲ法检测卵巢良、恶性肿瘤中Ｉｄ１ｍＲＮＡ的表达［Ｊ］．现代肿瘤医学，２０１１，１９（１１）：２２９９－２３０１．［１７］　Ｋｉｍ　Ｅｕｎｊｕ，Ｋｉｍ　Ｍｉｎｊｅｏｎｇ，Ｓｕｎｇ　Ｋｙｕｎｇｈｗａ，ｅｔ　ａｌ．Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｔｏｐｉｃａｌ　ｄｉｍｅｔｈｙｌａｒｓｉｎｉｃ　ａｃｉｄ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｅｘ－ｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ－ｒｅｌａｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｉｎ　ｍｏｕｓｅ　ｓｋｉｎ［Ｊ］．Ｂｕｌｌｅｔｉｎ　ｏｆ　Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ　Ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎａｎｄ　Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ，２０１２，８８（５）：６７２－６７７．［１８］　Ｗｕ　Ｃｈｕｎｙａｎ，Ｔａｎｇ　Ｚｈｉｈａｎ，Ｊｉａｎｇ　Ｌｕ，ｅｔ　ａｌ．ＰＣＳＫ９ｓｉＲＮＡ　ｉｎｈｉｂｉｔｓ　ＨＵＶＥＣ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｂｙｏｘ－ＬＤＬ　ｖｉａ　Ｂｃｌ／Ｂａｘ—ｃａｓｐａｓｅ９—ｃａｓｐａｓｅ３ｐａｔｈｗａｙ［Ｊ］．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０１２，３５９（１－２）：３４７－３５８．［１９］　Ｎａｄｉａ　Ｚｅｐｅｄａ，Ｓａｎｄｒａ　Ｓｏｌａｎｏ，Ｎａｔａｌｉａ　Ｃｏｐｉｔｉｎ，ｅｔ　ａｌ．Ｄｅｃｒｅａｓｅ　ｏｆ　ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ　ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ　ＣＤ４（＋），ＣＤ８（＋），ＣＤ１９（＋）ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ　ａｎｄ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｏｆ　ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌｓ　ｉｎ　ａ　ｍｕｒｉｎｅ　Ｔａｅｎｉａ　ｃｒａｓｓｉｃｅｐｓ　ｉｎｆｅｃ－ｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｐａｒａｓｉｔｏｌ　Ｒｅｓ，２０１０，１０７：１１２９－１１３５．［２０］　Ｋｉｍ　Ｗｏｎ　Ｋｉ，Ｋｉｍ　Ｊｕｈｗａ，Ｙｏｏｎ　Ｋｙｕｎｇｓｉｌ，ｅｔ　ａｌ．Ｓａｌｉｎｏｍｙｃｉｎ，ａｐ－ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，ｓｅｎｓｉｔｉｚｅｓｒａｄｉａｔｉｏｎ－ｔｒｅａｔｅｄ　ｃａｎｃｅｒ　ｃｅｌｌｓ　ｂｙ　ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ　ＤＮＡ　ｄａｍａｇｅ　ａｎｄ　ｉｎｄｕｃｉｎｇ　Ｇ２ａｒｒｅｓｔ［Ｊ］．Ｉｎｖｅｓｔ　ＮｅｗＤｒｕｇｓ，２０１１，４：４１１－４１９．［２１］　Ｌｅｅ　Ｍｉｈｅｅ，Ｈａｎ　Ｄｏｎｇｗｏｏｋ，Ｈｙｏｎ　Ｓｕｏｎｇｈｙｕ，ｅｔ　ａｌ．Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｆｉｂｒｏｓａｒｃｏｍａ　ＨＴ－１０８０ｃｅｌｌｓ　ｂｙ　ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ－３－Ｏ－ｇａｌｌａｔｅ　ｖｉａ　ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐ５３ａｎｄ　ｃａｓｐａｓｅｓ　ａｓ　ｗｅｌｌ　ａｓ　ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ９１１滨州学院学报第２８卷Ｂｃｌ－２ａｎｄ　ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ　ｎｕｃｌｅａｒ　ｆａｃｔｏｒκＢ［Ｊ］．Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ，２０１１，１６：７５－８５．［２２］　刘鑫，庞铁光，姚闯，等．ＤＣ凋亡的流式细胞术分析［Ｊ］．内蒙古民族大学学报，２０１０，１６（５）：１０９－１１０．［２３］　Ｍａｒｔｉｎｅｔ　Ｗ，ＤｅＭｅｙｅｒ　Ｇ　Ｒ，Ａｎｄｒｉｅｓ　Ｌ，ｅｔ　ａｌ．Ｉｎ　ｓｉｔｕ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｓｔａｒｖａｔｉｏｎ－ｉｎｄｕｃｅｄ　ａｕｔｏｐｈａｇｙ［Ｊ］．Ｊ　Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ　Ｃｙｔｏｃｈｅｍ，２００６，５４（１）：８５－９６．［２４］　Ｓｔｅｐｈａｎｉｅ　Ｖｅｒｓｃｈｕｅｒｅ，Ｌｉｅｓｂｅｔｈ　Ａｌｌａｉｓ，Ｓａｓｋｉａ　Ｌｉｐｐｅｎｓ，ｅｔ　ａｌ．Ｃｉｇａｒｅｔｔｅ　ｓｍｏｋｅ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｔｅｒｍｉｎａｌ　ｉｌｅ－ｕｍ：ｉｎｃｒｅａｓｅｄ　ａｕｔｏｐｈａｇｙ　ｉｎ　ｍｕｒｉｎｅ　ｆｏｌｌｉｃｌｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ　ａｎｄ　Ｐｅｙｅｒ’ｓ　ｐａｔｃｈｅｓ［Ｊ］．Ｈｉｓｔｏ－ｃｈｅｍ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ，２０１２，１３７：２９３－３０１．［２５］　Ｋａｔｈｒｙｎ　Ｇ　Ｅｂｙ，Ｊｅｎｎｉｆｅｒ　Ｍ　Ｒｏｓｅｎｂｌｕｔｈ，Ｄｅｂｏｒａｈ　Ｊ　Ｍａｙｓ，ｅｔ　ａｌ．ＩＳＧ２０Ｌ１ｉｓ　ａ　Ｐ５３ｆａｍｉｌｙ　ｔａｒｇｅｔｇｅｎｅ　ｔｈａｔ　ｍｏｄｕｌａｔｅｓ　ｇｅｎｏｔｏｘｉｃ　ｓｔｒｅｓｓ－ｉｎｄｕｃｅｄ　ａｕｔｏｐｈａｇｙ［Ｊ］．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃａｎｃｅｒ，２０１０，９：２５－２６．［２６］　张石云，段振玲，徐琳，等．顺铂诱导卵巢癌ＳＫＯＶ３细胞自噬和凋亡的研究［Ｊ］．现代妇产科进展，２０１１，２０：４５－４７．［２７］　Ｌｉｕ　Ｄｏｎｇｌｅｉ，Ｙａｎｇ　Ｙａｎｇ，Ｌｉｕ　Ｑｕａｎ．Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｕｔｏｐｈａｇｙ　ｂｙ　３－ＭＡ　ｐｏｔｅｎｔｉａｔｅｓ　ｃｉｓｐｌａｔｉｎ－ｉｎｄｕｃｅｄａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｉｎ　ｅｓｏｐｈａｇｅａｌ　ｓｑｕａｍｏｕｓ　ｃｅｌｌ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ　ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ｍｅｄ　Ｏｎｃｏｌ，２０１１，２８：１０５－１１１．［２８］　齐亚莉，王俊，李岩，等．自噬体的检测及其对肿瘤的作用［Ｊ］．中国实验诊断学，２０１０，１４：７８０－７８２．［２９］　方永奇，刘林．神经细胞自噬的研究进展［Ｊ］．中华中医药学刊，２０１１，２９：４５３－４５５．［３０］　张瑞光．低氧微环境下内皮细胞自噬与凋亡之间作用的研究［Ｄ］．武汉：华中科技大学，２０１１．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ｏｆ　Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ，Ｎｅｃｒｏｓｉｓ　ａｎｄ　ＡｕｔｏｐｈａｇｙＬＵ　Ｊｉａｎ－ｍｅｉ，ＺＨＡＯ　Ｙｕｎ－ｆｅｎｇ（Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｑｕｆｕ　Ｎｏｒｍａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｑｕｆｕ２７３１６５，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｎｏｗａｄａｙｓ，ｉｔ　ｉｓ　ｗｉｄｅｌｙ　ｂｅｌｉｅｖｅｄ　ｔｈａｔ　ｃｅｌｌ　ｄｉｅｓ　ｉｎ　ｔｈｒｅｅ　ｗａｙｓ：ａｐｏｐｔｏｓｉｓ，ｎｅｃｒｏｓｉｓ　ａｎｄ　ａｕｔｏｐｈ－ａｇｙ．Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｈａｓ　ｂｅｅｎ　ｔｈｅ　ｒｅｓｅａｒｃｈ　ｄｉｒｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｍｅｄｉｃａｌ　ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ　ｔｏ　ｍａｋｅ　ｕｎｒｅｍｉｔｔｉｎｇ　ｅｆｆｏｒｔｓ　ｔｏｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｃａｎｃｅｒ，ｗｈｉｌｅ　ａｕｔｏｐｈａｇｙ　ｉｓ　ａｎｏｔｈｅｒ　ｒｅｓｅａｒｃｈ　ｈｏｔｓｐｏｔ　ｓｔａｒｔｅｄ　ｉｎ　ｒｅｃｅｎｔ　ｙｅａｒｓ．Ｔｈｉｓ　ａｒｔｉｃｌｅ　ｇｅｎｅｒ－ａｌｌｙ　ｉｎｔｒｏｄｕｃｅｓ　ｔｈｅｓｅ　ｔｈｒｅｅ　ｆｏｒｍｓ　ｏｆ　ｃｅｌｌ　ｄｅａｔｈ　ａｎｄ　ｔｈｅｉｒ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ａｐｏｐｔｏｓｉｓ；ｎｅｃｒｏｓｉｓ；ａｕｔｏｐｈａｇｙ；ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄｓ（责任编辑：贾晶晶）０２１。

《p62及其互作蛋白Vps34在LPS诱导的小鼠巨噬细胞自噬中的作用》篇一一、引言自噬是细胞内的一种重要生物学过程，参与细胞内物质循环和细胞代谢调节。

近年来，越来越多的研究表明，自噬在免疫反应中也发挥着重要作用。

特别是在巨噬细胞中，自噬不仅参与了细胞内物质的降解和循环，还与炎症反应紧密相关。

P62和Vps34是两个关键的调节蛋白，它们在LPS（脂多糖）诱导的小鼠巨噬细胞自噬中起着重要的作用。

本文旨在探讨P62及Vps34在LPS诱导的巨噬细胞自噬中的作用及其分子机制。

二、文献综述（一）P62与Vps34简介P62是一种自噬相关的多功能蛋白，参与自噬体形成及与溶酶体的融合过程。

Vps34是一种磷酸肌醇激酶，参与自噬体膜的形成过程。

二者在自噬过程中扮演着重要的角色。

（二）LPS诱导的巨噬细胞自噬LPS是革兰氏阴性菌的细胞壁成分，当LPS进入体内时，可以激活巨噬细胞，并诱导其发生自噬反应。

自噬反应可以增强巨噬细胞的抗原提呈能力和对入侵病原体的防御能力。

三、研究内容（一）实验方法本研究采用小鼠巨噬细胞系作为研究对象，通过LPS刺激诱导巨噬细胞自噬，并观察P62和Vps34在自噬过程中的变化。

采用免疫荧光、Western Blot等方法检测P62和Vps34的表达水平及定位变化。

（二）实验结果1. P62的表达及定位变化：LPS刺激后，P62的表达量明显增加，并且定位发生变化，更多地与自噬体相关结构共定位，说明P62参与了自噬过程。

2. Vps34的表达变化：LPS刺激后，Vps34的表达量也有所增加，表明Vps34在自噬过程中发挥了重要作用。

3. P62与Vps34的互作关系：通过免疫共沉淀等实验方法发现，P62与Vps34之间存在互作关系，二者共同参与了自噬过程的调节。

（三）讨论根据实验结果，我们得出以下结论：P62和Vps34在LPS诱导的小鼠巨噬细胞自噬中发挥了重要作用。

P62的增加与自噬体的形成和成熟有关，而Vps34则参与了自噬体膜的形成过程。

小鼠atg5重组蛋白小鼠atg5重组蛋白是一种用于研究细胞自噬过程的重要工具。

细胞自噬是一种细胞内垃圾清除的过程，通过将受损或老化的细胞器、蛋白质等物质包裹在囊泡中，然后将其降解并再利用。

atg5是细胞自噬过程中的一个重要蛋白质，它参与了自噬囊泡的形成和融合。

atg5蛋白是由atg5基因编码的，该基因在小鼠中广泛表达。

为了研究atg5蛋白的功能和机制，科学家通过基因工程技术将atg5基因转移到表达系统中，通过大量表达和纯化得到重组蛋白。

这种重组蛋白可以被用于体外实验，如酶活性测定、结构解析等，也可以用于体内实验，如细胞培养、小鼠模型等。

在细胞自噬过程中，atg5蛋白发挥着重要的作用。

它与atg12蛋白结合形成一个复合物，这个复合物被称为atg5-12。

atg5-12复合物与其他atg蛋白一起参与了自噬囊泡的形成。

具体来说，atg5-12复合物与atg16蛋白结合，形成一个叫做atg5-12-16复合物的大分子结构。

这个复合物能够识别并结合到细胞器上，然后通过一系列的信号传导和蛋白分解过程，将细胞器包裹在自噬囊泡中。

除了参与自噬囊泡的形成，atg5蛋白还参与了自噬囊泡的融合过程。

自噬囊泡在形成后，需要通过与其他囊泡或溶酶体融合来完成降解过程。

atg5蛋白与其他atg蛋白一起，通过调节融合相关蛋白的表达和活性，促进自噬囊泡的融合。

这个过程对于细胞的正常功能和代谢调节至关重要。

研究表明，atg5蛋白在细胞自噬中起着关键的调控作用。

当atg5基因发生突变或表达异常时，会导致自噬过程的异常。

这可能引发一系列的疾病，如肿瘤、神经退行性疾病等。

因此，研究atg5蛋白的功能和机制对于揭示自噬过程的调控机制，以及相关疾病的发生机制具有重要意义。

小鼠atg5重组蛋白的研究不仅可以增进我们对细胞自噬的理解，还可以为相关疾病的治疗提供新的思路和靶点。

通过研究atg5蛋白的结构和功能，可以设计和开发针对atg5蛋白的药物，用于调节细胞自噬过程，从而治疗相关疾病。

烧伤烫伤(TI)小鼠模型具体方法及步骤原型物种人来源烫伤导致模式动物品系SPF级Balb/C小鼠，健康，雄性，4~6W，体重为18g~20g。

实验分组实验分六组：正常对照组、模型组、阳性药组、受试药组三个剂量组。

实验周期4-6 weeks建模方法1. 烧伤造模过程：戊巴比妥钠麻醉小鼠后，用剃毛器剃去小鼠背部毛，并使用硫化钠于背部进行脱毛处理至无毛。

将小鼠四肢和尾部固定于超净台上，间隔排列，将水浸湿的带控制烧伤面积的纸片放在小鼠背部（2.0cm×3.5cm=7.0 cm2，占体表面积10％），用滴管滴加乙醇，浸满皮肤，打火机点燃，启动秒表计时，到时用湿布熄火，将小鼠放回鼠笼。

需进行预实验确定合适的烧伤时间。

2. 烧伤后护理：烧伤后当天，各组小鼠腹腔注射葡萄糖盐水0.3-0.4 mL，第2天灌胃牛奶0.2-0.3 mL。

第3天，正常小鼠与烧伤小鼠各取1只处死，取材。

治疗方式为：A、B组于伤口处涂抹药物，C组于伤口处均匀喷上喷剂。

烧伤后7天内每天早晚各给药一次，厚度为1mm；第8天起每天给药一次。

3.取材：于烧伤后2、7、14、30、45、60天分别处死A、B组各1只小鼠。

处死小鼠之前，记录小鼠体重和创面的变化（拍大体照，尽可能每只鼠拍照的角度一致）。

取材：老鼠麻醉后摘眼球取血，提血清，置于-80度保存。

烧伤创面分2份，一份置于福尔马林保存用于后期病理染色，另一份置于液氮快速冷冻置于-80度保存。

应用疾病模型模型评价皮肤观察：观察伤处愈合情况，记录小鼠体重变化、创面愈合时间、感染情况、愈合后瘢痕情况，创面愈合率等，拍大体照，尽可能每只鼠拍照的角度一致。

染色：对皮肤进行病理检查和观察：将烧伤创面连同周边皮肤约0.5 cm取下，平铺于滤纸上，然后固定于10％福尔马林内，纵向和横向切取宽约3-4 mm皮肤，按常规制备石蜡切片，切片厚度为5 μm，苏木素一伊红(HE)染色，用显微镜观察并照相。

IHC染色：取石蜡切片，进行Ki67染色。