一步法制备大肠杆菌BL21(DE3)菌株感受态细胞及转化条件优化

大肠杆菌感受态细胞的制备
大肠杆菌感受态细胞是一种重要的细菌功能研究模型。

下面是制备大肠杆菌感受态细胞的步骤：
1. 选择适当的大肠杆菌菌株，通常使用DH5α或BL21(DE3)等菌株；
2. 选用适当的质粒载体（例如pET系列），根据需要将目标基因插入载体中；
3. 制备大肠杆菌的化学转化液（例如CaCl2转化法），转化质粒到大肠杆菌细胞中；
4. 通过筛选和鉴定，筛选出带有目标基因的单克隆菌株；
5. 将单克隆菌株培养至对数生长期，然后添加适当浓度的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），诱导目标基因的表达；
6. 培养细胞至感受态状态，通常需要1-2小时的诱导时间；
7. 用适当的方法分离并提取感受态细胞膜，例如超声法或离心法；
8. 在提取的细胞膜中添加目标配体或生理作用物质，检测感受态细胞的响应。

通过这些步骤，我们可以制备出高效的大肠杆菌感受态细胞，用于研究蛋白质的结构和功能、药物筛选等方面的研究。

BL21(DE3)感受态细胞BL21(DE3)感受态细胞简介：BL21（DE3）感受态细胞是采用大肠杆菌BL21（DE3）菌株经特殊工艺处理得到的感受态细胞，可用于DNA的化学转化。

使用pUC19质粒检测，转化效率可达107，-70℃保存几个月转化效率不发生改变。

BL21(DE3)菌株适合表达非毒性蛋白。

该菌株是以T7 RNA 聚合酶为表达系统的外源基因蛋白高效表达的宿主。

T7 噬菌体RNA 聚合酶基因的表达受λ噬菌体DE3区的lacUV5 启动子调控，该区整合在BL21 染色体上。

本产品是大肠杆菌BL21(DE3)菌株经特殊工艺处理得到的感受态细胞，可用于DNA的热击转化。

使用pU19持粒检测，转化效率可达107。

BL21(DE3)感受态细胞产品特点·转化效率可达107。

·可用于非毒性蛋白表达。

·长时间保存于-80 ℃，转化效率不发生改变。

保存条件：-80℃BL21(DE3)感受态细胞基因型F–ompT hsdS(rB– mB–) dcm+ Tet r galλ(DE3) endA Hte [argU proL Cam r] [argU ileY leuW Strep/Spec r]BL21(DE3)感受态细胞说明BL21-CodonPlus(DE3)-RIPL菌株来源于Stratagene公司的BL21-Gold 菌株，缺少Lon蛋白酶和OmpT蛋白酶，从而减少对重组蛋白的降解，补充大肠杆菌缺乏的4种稀有密码子( AGA、AUA、CCC、CUA) 对应的tRNA （argU、ileY、proL、leuW），提高外源基因，尤其是富含AT-或 GC-的真核基因在原核系统中的表达水平。

该菌株染色体整合了λ噬菌体DE3区（DE3区含有T7噬菌体RNA聚合酶），可同时表达T7 RNA聚合酶和大肠杆菌RNA聚合酶，可用于pET系列，pGEX，pMAL等质粒的蛋白表达，同时具有四环素，氯霉素，链霉素，壮观霉素抗性。

第一节概述在自然条件下，很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内，但在人工构建的质粒载体中，一般缺乏此种转移所必需的mob基因，因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。

如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA 。

转化(Transformation)是将外源DNA分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。

转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(Rˉ,Mˉ)，它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。

受体细胞经过一些特殊方法(如电击法，CaCl2，RbCl(KCl)等化学试剂法)的处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞(Compenent cells)。

进入受体细胞的DNA分子通过复制，表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。

将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子(Transformant，即带有异源DNA分子的受体细胞)。

目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2和RbCl(KCl)法，RbCl (KCl)法制备的感受态细胞转化效率较高，但CaCl2法简便易行，且其转化效率完全可以满足一般实验的要求，制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15％的无菌甘油于-70℃保存(半年)，因此CaCl2法为使用更广泛。

为了提高转化效率，实验中要考虑以下几个重要因素：1. 细胞生长状态和密度: 不要用经过多次转接或储于4℃的培养菌，最好从－7 0℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。

细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的OD600来控制。

DH5α菌株的OD600为0.5时，细胞密度在5×107个/ml左右(不同的菌株情况有所不同)，这时比较合适。

⼤肠杆菌BL21感受态的制备和保存⽅法研究⼤肠杆菌BL21感受态的制备和保存⽅法研究焦亮（细胞⽣物学 2009111107000732）[摘要] ⽬的：描述⼀种改良的⼤肠杆菌感受态制备和保藏及质粒的转化⽅法．⽅法：将CaCl2溶液改为TB溶液；其次是将培养基由LB换成NZY，并分别⽐较了不同冷冻保护剂(7%DMSO，10％⽢油)于－20℃、－80℃冰箱保存感受态细胞的效果。

结果：以TB溶液制备感受态细胞，冰浴转化10min后直接涂平板筛选转化⼦，获得与常规转化⽅法相当的转化效率,⽽以7％的DMSO为冷冻保护剂保存感受态细胞可维持107以上的转化率40d以上。

[关键词] ⼤肠杆菌；感受态细胞；制备⽅法；转化率；保存Study on Preparation and Storage of Competent Escherichia coli BL21 CellsJiao Liang[Abstract]Objective: An efficient method was described for the E. coli preparation，storage and plasmid transformation. Methods: Normal conditions were changed, from CaCl2 solution to TB solution, LB medium to NZY medium and compared different conditions for storage of competent cells.Results:High transformation efficiency was achieved by preparing the competent cells with TB solution, transforming for 10 minutes, and then following the direct selection on Amp+ LB plate, and Cells stored with dimethylsulfoxide in -80℃could keep consistently high transformation efficiency at least 40d.[Key words] competent cells; Escherichia coli; Preparation; storage⼤肠杆菌感受态细胞的制备是实验室分⼦克隆的重要试验之⼀，在实际操作中，由于感受态细胞的转化效率受到诸多因素的影响，如离⼦强度、热击参数、培养条件、保存温度及时间等，转化效率很不稳定。

分子生物学实验报告实验名称：大肠杆菌感受态细胞的制备及重组子的转化班级：生工xxxx姓名：xxx学号：xxx日期：xxx大肠杆菌感受态细胞的制备及重组子的转化1 引言在分子生物学日益普及的今天，基因操作已成为一项重要的常规技术。

体外连接的DNA重组体导入合适的受体细胞便能大量地复制、增殖和表达，从而得到大量的重组基因，其中尤以转化为主[1]。

感受态细胞的制备是分子生物学研究中的一个重要环节，其制备质量的好坏直接影响到后续实验工作的进行。

本次实验的目的旨在了解转化的概念，及其在分子生物学研究中的意义，学习氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞的方法。

2 材料和方法2.1 实验原理质粒DNA需经过转化过程（transformation），才能将其导入感受态细胞（competent cell）或者大肠杆菌体中，然后通过寄主细菌的系统来达到复制DNA 的目的。

进行细菌转化作用最常用的一种方法是加入大量的氯化钙（calcium chloride），导致大肠杆菌的细胞壁发生结构上的变化，变成感受态细胞，而有利于质体DNA进入细菌细胞内。

大部分大肠杆菌品系的转化效率在105-108之间，即每μg质粒DNA中成功的转化细胞数目，影响此效率的因子与感受态细胞状況或吸收DNA的能力有关。

而这2项因子又受细菌是否处于对数生长期、处理时是否将细胞保持在4°C以下，以及氯化钙处理细胞的时间影响。

感受态细胞制备完成后，利用热休克处理，使细胞质膜的油脂变性而刺激转化作用，而后给予一段时间恢复后，可用对抗生素之抗性标记，进行筛选工作。

本实验是利用冰冷的氯化钙溶液制备感受态细胞，其转化效率约在105-107之间。

转化（transformation）是将异源DNA分子引入另一细胞品系，使受体细胞获得新的遗传形状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。

本实验以E coli DH5α菌株为受体细胞，用CaCl2处理受体菌使其处于感受态，然后与pMD18-T载体共保温，实现转化。

感受态细胞的制备方法（BL21）1．菌种纯化。

①在LB平板上，用接种环挑取大肠杆菌BL21，在平板上分级划线，以能够出现单菌落为宜。

②将上述划线的平板倒置于恒温培养箱中37℃过夜培养。

2．菌体培养。

①取20 ml LB培养基至100 mL三角烧瓶中，塞上棉塞后高温高压灭菌，然后冷却至室温。

②在划线平板培养基上挑取单菌落，接种到①中。

③ 37℃振荡（约120 rpm）培养。

④测定OD值，当OD值达到0.35～0.5时（培养约5小时）放置冰上停止培养（如果OD600值超出此范围将不能保证感受态细胞的转化效率）。

3．感受态细胞的制备①取上述冰上菌液1 mL于1.5 mL ep管中（根据需要量确定Microtube数量）。

② 1,500×g（微型离心机约4,000 rpm）4℃离心5分钟，弃上清（注意尽量除尽上清）。

③在每个ep管中加入100 μL冰预冷的Solution A，轻轻弹动ep使沉淀悬浮，禁止剧烈振荡。

④ 1,500×g 4℃离心5分钟，弃上清（注意尽量除尽上清）。

⑤在每个ep管中加入100 μL冰预冷的Solution B，轻轻弹动ep管使沉淀悬浮，勿剧烈振荡。

⑥感受态细胞制作完成。

本感受态细胞可以直接用于DNA的转化实验，也可以于-80℃中保存，以备以后使用。

在-80℃保存时，可以有效保存一年以上，但不能反复冻融，一旦融解后，不能再进行-80℃保存。

感受态细胞的DNA转化1．将-80℃保存的感受态细胞置于冰上融化10分钟。

2．向100 μl的感受态细胞中加入0.1 ng～10 ng（3 μl～10 μl，一般连接产物用10 μL，质粒用0.5 μL）的转化用DNA，轻轻混匀后冰中放置30分钟。

3．42℃水浴中放置45秒钟后，立即于冰中放置1～2分钟。

4．加入900 μL培养基。

5．37℃ 140-160 rpm振荡培养45 min。

6. 离心6000rpm，3min，弃上清，留约100 μL，混匀后涂平板。

大肠杆菌电转化感受态细胞制备及转化方法(Jin-Lab)随着基因工程和生物技术的发展，基因克隆和DNA转化技术已经成为生命科学研究的基本技术之一。

大肠杆菌是广泛应用的微生物基因克隆和表达系统，其中电转化是一种常用的DNA转化方法。

在电转化过程中，使用感受态细胞进行DNA 转化可以提高转化效率和获得更多的转化子。

因此，制备感受态细胞及其转化方法研究对开展基因克隆和表达等方面的研究具有非常重要的意义。

感受态细胞制备方法1.大肠杆菌菌株及培养基选择本实验使用大肠杆菌DH5α菌株，培养基为Luria-Bertani（LB）培养基。

2.细胞质壁分离方法将DH5α菌株经过预培养后，用LB培养基洗涤一次，收集菌落后进行以下步骤。

•在含有1mM EDTA的冷0.5M葡萄糖缓冲液中洗涤细胞三次；•加入60mg/mL的亚胺青钾（IPTG）处理4小时取得感受态细胞。

3.细胞计数及保存使用平板计数器计数，将细胞用LB培养基稀释至约1 x 10^9/mL，添加10% v/v的甘油保存在-80℃。

电转化方法1.大肠杆菌菌株及培养基选择本实验使用大肠杆菌DH5α菌株，培养基为SOC培养基（Super Optimal broth with Catabolite repression）。

2.DNA处理方法将所需构建质粒经过酶切和纯化等操作处理后，加入所需菌株中进行转化。

3.转化操作•取感受态细胞保存液用LB培养基洗涤3次；•加入所需DNA，静置30分钟使其与感受态细胞充分结合；•以1mm间隔安置两条电极在电转化仪中；•用微管脚吸取约50μL细胞转移到抗电极侧的铝箔上，用蒸馏水润湿铝箔；•将铝箔上细胞转移到电极之间的空间内，使用脉冲电压脉冲电压 1.8 kV, 25 uF, 200Ω电阻取得转化产物。

以上是大肠杆菌电转化感受态细胞制备及转化的实验步骤。

感受态细胞制备方法和电转化方法的优化将提高转化效率和转化获得率，从而为生命科学研究提供更好的服务。

E.coli BL-21（DE3)感受态细胞的制备Ecoli BL-21来源于B株大肠杆菌，是最早开发的用于原核表达的菌株，为Lon蛋白水解酶、OMPT外膜蛋白水解酶缺陷型菌株，因此表达的外源蛋白在该体系中具有更高的稳定性。

菌株可用于pCold I-IV DNA和pCold TF DNA的蛋白质表达，但不适用于启动子为T7的蛋白质表达体系，如pET系列，因为BL-21宿主不表达T7-RNA聚合酶，该菌株主要用于非毒性蛋白表达。

而BL-21(DE3)是大肠杆菌表达菌株中的一种，是以T7RNA聚合酶为表达系统的高校外源基因的蛋白表达宿主，T7噬菌体RNA聚合酶基因的表达受控于λ噬菌体DE3区的LacUV5启动子，该区整合于BL21的染色体上，该菌株适合于用于启动子为T7的蛋白质表达体系。

一、实验器材与试剂（一）实验器材水浴锅（上海精宏，DK-8D）,生化培养箱（上海智诚，ZXSD-1160),恒温培养箱（上海智诚，ZXSD-B2050）,冷冻离心机（Thermo Micro17R），制冰机：松下SIM-F14OBDL（二）试剂材料0.1M CaCl2、0.1MCaCl2+甘油、LB平板、LB液体培养基、卡那霉素（国药，XW253899405）、PCR管（国产）、1.5ml离心管（国产）、枪头（国产）、玻璃珠（国产）、E.coli BL21（DE3）二、感受态细胞制备步骤（一）平板制备流程1.将超净工作台的紫外灯打开，将平皿、酒精灯、70%酒精、1000uL枪头放入超净工作台内，对超净工作台进行紫外灭菌30分钟。

2.超净工作台灭菌后打开风机至3档并关闭紫外灯，风机运行5分钟后将已灭菌的固体培养基放在超净工作台上。

3.准备进行无菌操作时，将70%的酒精喷洒在手套及袖口上和融化好的固体培养基（以不烫手为宜）、抗生素上，然后放入工作台中，待手套上酒精挥发完全后点燃酒精灯。

4.将平皿的外包装胶袋拆开，将平皿皿底朝下摆放整齐。

分子生物学实验报告实验名称：大肠杆菌感受态细胞的制备及重组子的转化班级：生工xxxx姓名：xxx学号：xxx日期：xxx大肠杆菌感受态细胞的制备及重组子的转化1 引言在分子生物学日益普及的今天，基因操作已成为一项重要的常规技术。

体外连接的DNA重组体导入合适的受体细胞便能大量地复制、增殖和表达，从而得到大量的重组基因，其中尤以转化为主[1]。

感受态细胞的制备是分子生物学研究中的一个重要环节，其制备质量的好坏直接影响到后续实验工作的进行。

本次实验的目的旨在了解转化的概念，及其在分子生物学研究中的意义，学习氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞的方法。

2 材料和方法2.1 实验原理质粒DNA需经过转化过程（transformation），才能将其导入感受态细胞（competent cell）或者大肠杆菌体中，然后通过寄主细菌的系统来达到复制DNA 的目的。

进行细菌转化作用最常用的一种方法是加入大量的氯化钙（calcium chloride），导致大肠杆菌的细胞壁发生结构上的变化，变成感受态细胞，而有利于质体DNA进入细菌细胞内。

大部分大肠杆菌品系的转化效率在105-108之间，即每μg质粒DNA中成功的转化细胞数目，影响此效率的因子与感受态细胞状況或吸收DNA的能力有关。

而这2项因子又受细菌是否处于对数生长期、处理时是否将细胞保持在4°C以下，以及氯化钙处理细胞的时间影响。

感受态细胞制备完成后，利用热休克处理，使细胞质膜的油脂变性而刺激转化作用，而后给予一段时间恢复后，可用对抗生素之抗性标记，进行筛选工作。

本实验是利用冰冷的氯化钙溶液制备感受态细胞，其转化效率约在105-107之间。

转化（transformation）是将异源DNA分子引入另一细胞品系，使受体细胞获得新的遗传形状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。

本实验以E coli DH5α菌株为受体细胞，用CaCl2处理受体菌使其处于感受态，然后与pMD18-T载体共保温，实现转化。

大肠杆菌BL21(DE3)生产β-环状糊精转移酶发酵条件的优化宋拓;李俊俊;唐湘华;谢振荣;张学林;王秋云;许波;周峻沛;慕跃林【期刊名称】《中国酿造》【年(卷),期】2013(032)004【摘要】采用正交试验确定大肠杆菌BL21 (DE3)产β-环糊精转移酶的发酵条件.结果表明,生产β-环状糊精转移酶的最适条件为:接种量1％,100mL三角瓶装液量15mL,初始pH值为7.0,Ca2+浓度为1.25mmol/L,Mg2+浓度为2.50mmol/L,温度控制在37℃,转速控制为150r/min.当OD600达到1.4时,加入终浓度5.0g/L 的α-乳糖,转速提高至170r/min,37℃诱导12h后过滤,β-CGTase酶活最高可达16.3μ/mL.【总页数】6页(P52-57)【作者】宋拓;李俊俊;唐湘华;谢振荣;张学林;王秋云;许波;周峻沛;慕跃林【作者单位】生物能源持续开发利用教育部工程研究中心云南省酶资源开发与应用工程研究中心云南省生物质能与环境生物技术重点实验室云南师范大学酶工程重点实验室云南师范大学生命科学学院,云南昆明 650500;生物能源持续开发利用教育部工程研究中心云南省酶资源开发与应用工程研究中心云南省生物质能与环境生物技术重点实验室云南师范大学酶工程重点实验室云南师范大学生命科学学院,云南昆明 650500;生物能源持续开发利用教育部工程研究中心云南省酶资源开发与应用工程研究中心云南省生物质能与环境生物技术重点实验室云南师范大学酶工程重点实验室云南师范大学生命科学学院,云南昆明 650500;生物能源持续开发利用教育部工程研究中心云南省酶资源开发与应用工程研究中心云南省生物质能与环境生物技术重点实验室云南师范大学酶工程重点实验室云南师范大学生命科学学院,云南昆明 650500;生物能源持续开发利用教育部工程研究中心云南省酶资源开发与应用工程研究中心云南省生物质能与环境生物技术重点实验室云南师范大学酶工程重点实验室云南师范大学生命科学学院,云南昆明 650500;生物能源持续开发利用教育部工程研究中心云南省酶资源开发与应用工程研究中心云南省生物质能与环境生物技术重点实验室云南师范大学酶工程重点实验室云南师范大学生命科学学院,云南昆明 650500;生物能源持续开发利用教育部工程研究中心云南省酶资源开发与应用工程研究中心云南省生物质能与环境生物技术重点实验室云南师范大学酶工程重点实验室云南师范大学生命科学学院,云南昆明 650500;生物能源持续开发利用教育部工程研究中心云南省酶资源开发与应用工程研究中心云南省生物质能与环境生物技术重点实验室云南师范大学酶工程重点实验室云南师范大学生命科学学院,云南昆明 650500;生物能源持续开发利用教育部工程研究中心云南省酶资源开发与应用工程研究中心云南省生物质能与环境生物技术重点实验室云南师范大学酶工程重点实验室云南师范大学生命科学学院,云南昆明650500【正文语种】中文【中图分类】TS05【相关文献】1.一步法制备大肠杆菌BL21（DE3）菌株感受态细胞及转化条件优化 [J], 张迹;李智;张宇;袁巧云2.重组大肠杆菌BL21(DE3)-pET28a(+)-bgl诱导表达β-葡聚糖酶的条件优化 [J], 李永仙;郑飞云;李崎;顾国贤3.重组大肠杆菌BL21(DE3)/rbLF-N高密度培养条件优化 [J], 罗红霞;林少华;任发政;陈历水;陈雅松;田寒友4.转氨酶ATA117基因在大肠杆菌BL21（DE3）中的重组表达及产酶条件优化[J], 王璐;徐刚;吴坚平;杨立荣5.重组大肠杆菌BL21（DE3）/pET-S12表达头孢菌素酰化酶的诱导条件优化 [J], 任羽;张建安;朱玉山因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

实验一大肠杆菌感受态细胞的制备及转化一、实验目的通过本实验，掌握大肠杆菌感受态细胞的制备及转化的方法和技术。

二、实验原理细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。

转化是指质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。

其原理是细菌处于0℃，CaCl2低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形。

转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热击处理，促进细胞吸收DNA复合物。

将细胞放置在非选择性培养基中保温一段时间，促使在转化过程中获得的新的表型（如Ampr 等）得到表达，然后将此细菌培养物涂在含有氨苄青霉素的选择性培养基上。

三、实验仪器、材料与试剂（一）、实验仪器超净工作台；低温离心机；恒温摇床；恒温箱；-70℃冰箱；恒温水浴器（二）、实验材料氯化钙（CaCl2）；胰蛋白胨；酵母提取物；氯化钠（NaCl）；氨苄青霉素；大肠杆菌DH5α；pUC19质粒；50mL离心管；吸头、试管、培养皿、锥形瓶等。

（三）、试剂1、0.1mol/L CaCl2溶液2、LB液体培养基3、氨苄青霉素（Amp），用无菌水配制成100mg/mL溶液，置-20℃冰箱保存。

四、实验步骤1、从E. coli DH5α平板上挑取1个单菌落于2 ml LB试管中，37℃，振荡，O/N；2、取500 μl菌液转到含50 ml LB三角瓶中，37℃振荡，2.5 hrs；3、将菌液转到50 ml离心管中，10 min on ice；4、离心，4 krpm，10 min，4℃，→回收细胞；5、用冰冷的10 ml的0.1 M CaCl2悬浮沉淀，30 min on ice→离心，4 krpm，10 min，4℃，→回收细胞；6、用冰冷的2 ml的0.1 M CaCl2悬浮细胞，即为感受态细胞；7、取200 μl感受态细胞，加2 μl pUC19 DNA（50 ng）混匀，30 min on ice；另设两对照：受体菌，200 μl感受态细胞+ 2 μl无菌水；质粒，200 μl 0.1 M CaCl2溶液+ 2 μl质粒DNA溶液；8、置于42℃，90 s，→2 min on ice→各加800 μl LB，37℃轻轻摇动，1 hr；9、取100 μl上述转化的感受态细胞，涂皿（含100 μg/ml Amp）→倒置平皿，37℃，O/N，出现菌落。

大肠杆菌BL21(DE3)pLysS感受态细胞的DNA热击的具体步骤及方法本产品是大肠杆菌BL21(DE3) pLysS菌株经特殊工艺处理得到的感受态细胞，可用于DNA的热击转化。

该菌株携带pLysS质粒，具有氯霉素抗性，适合表达毒性蛋白和非毒性蛋白。

PLysS含有表达T7溶菌酶的基因，能够降低目的基因的背景表达水平，但不干扰目的蛋白的表达。

使用pUC19质粒检测，转化效率可达10^7 。

操作方法：1．取感受态细胞置于冰浴中。

一次转化感受态细胞的建议用量为50-100 μl，可以根据实际情况分装使用。

以下实验以50 μl感受态细胞为例。

2．待感受态细胞融化后，向感受态细胞悬液中加入目的DNA（根据实际情况加入适量的DNA，通常100 μl感受态细胞能够被1 ng 超螺旋质粒DNA所饱和），用移液器轻轻吹打混匀，冰浴30分钟。

3．42℃热击45秒，迅速将离心管转移到冰浴中，冰上静置2-3分钟。

4．向每个离心管中加入450 μl无菌的SOC或LB培养基（不含抗生素），混匀后置于37℃摇床，150 rpm振荡培养45分钟使菌体复苏。

5．根据实验需求，取适量已转化的感受态细胞，加到含相应抗生素的SOC或LB固体琼脂培养基上，用无菌的涂布棒将细胞均匀涂开，将平板置于37℃直至液体被吸收，倒置培养，37℃培养12-16小时。

注意事项:1）涂布用量可根据具体实验调整。

若转化的DNA总量较多，可取少量转化产物涂布平板；若转化的DNA总量较少，可取200-300 μl转化产物涂布平板。

若预计的克隆数较少，可通过离心（4,000 rpm，2分钟）后吸除部分培养液，悬浮菌体后将其涂布于平板中。

2）新制备的固体培养基不易涂干，可将平板正置于37℃直至液体被吸收后再倒置培养。

3）涂布剩余的菌液可置于4℃保存，如果次日的转化菌落数过少，可以将剩下的菌液再涂布新培养基进行培养。

BL21(DE3)感受态细胞操作步骤及注意事项货号：C1400规格：10×100ul/20×100ul保存：-70℃保存，运输为干冰包装。

自收货之日起液氮保存至少一年，-70℃保存至少6个月。

产品简介：BL21（DE3）感受态细胞是采用大肠杆菌BL21（DE3）菌株经特殊工艺处理得到的感受态细胞，可用于DNA的化学转化。

使用pUC19质粒检测，转化效率可达107，-70℃保存6个月转化效率不改变。

基因型：F_ompT hsdSB（rB_mB_）dcm gal（DE3）特点：该菌株用于高效表达克隆于含有噬菌体T7启动子的表达载体（如pET系列）的基因。

T7噬菌体RNA聚合酶位于λ噬菌体DE3区，该区整合于BL21的染色体上。

该菌适合表达非毒性蛋白。

操作方法：（以下各步骤均为无菌操作）1、将感受态细胞置于冰上融化，以下实验以100ul感受态细胞为例。

2、向感受态细胞悬液中加入需转化的目的DNA，注意目的DNA的体积不要超过感受态细胞悬液体积的十分之一，轻轻旋转离心管以混匀内容物，冰浴放置30分钟。

3、将离心管置于42℃水浴中放置60-90秒，然后快速转移到冰浴中放置2-3分钟，注意不要摇动离心管。

4、向离心管中加入500ul无菌无抗的SOC或LB培养基，37℃180rpm振荡培养1小时。

目的是使质粒上相关的抗性标记基因表达，使菌体复苏。

5、取适量已转化的感受态细胞涂布含相应抗生素的SOC或LB平板，37℃倒置培养12-16小时。

涂布用量可根据具体实验来调整，如转化的DNA 总量较多，可取100ul左右的转化产物涂板；反之，如转化的DNA总量较少，可取200-300ul的转化产物涂板。

过多菌液可以抑制细菌生长。

如果预计的克隆较少，可通过离心后吸除部分培养液，悬浮菌体后将其涂布于一个平板中。

涂布剩余的菌液可4℃保存，如果次日的转化菌落数过少可以将剩下的菌液再涂布新的平板。

注意事项：1、感受态细胞应保存在-70℃，不可反复冻融，否则其转化效率将会降低。

基于重组工程法高转化效率的大肠杆菌BL21(DE3)表达菌株构建张飞飞;石牡丹;尚广东【摘要】[目的]提高最常用的异源蛋白表达宿主菌E.coli BL21(DE3)的转化效率.[方法]利用基于质粒的重组工程系统和双链断裂修复功能.[结果]敲除了编码降解外源DNA的Ⅰ型限制性内切酶的ksdR基因,获得了高转化效率以及其他功能与BI21(DE3)仍保持一致的LS1928菌株.[结论]获得的LS1928菌株可能会作为获得催化用酶的关键材料,进而在蛋白质工程等研究领域有着重要的作用.【期刊名称】《安徽农业科学》【年(卷),期】2015(000)020【总页数】4页(P29-31,72)【关键词】重组工程;基因敲除;双链断裂修复;大肠杆菌BL21(DE3)【作者】张飞飞;石牡丹;尚广东【作者单位】徐州医学院江苏省麻醉学重点实验室,江苏徐州221004;江苏省微生物工程技术研究中心,江苏省微生物与功能基因组学重点实验室,南京师范大学生命科学学院,江苏南京210023;江苏省微生物工程技术研究中心,江苏省微生物与功能基因组学重点实验室,南京师范大学生命科学学院,江苏南京210023【正文语种】中文【中图分类】S188酶是工业化生产的关键材料，也是现代绿色经济和工业生物技术的基础。

野生型的酶常常难以具有人们所期望的最佳活性。

高催化活性以及高催化专一性酶的获得常常依赖于基因突变，由于突变的随机性，目标突变只占最终突变的极小比例，一般在百万分之一的级别，因此高转化效率的菌株是获得高覆盖率蛋白突变体库的基础之一。

突变体库也是研究基因或蛋白结构和功能的关键手段。

常规的得到蛋白突变体的试验步骤是将通过特定方法(如 DNA shuffling［1］和易错 PCR［2］)所获得的突变体基因库以限制性内切酶进行酶切后所得的DNA片段和同样酶切的载体在T4连接酶的作用下相连，连接液转化至克隆宿主菌大肠杆菌(Escherichia coli)如DH10B或JM109，培养所得抗性菌株，从中提取质粒后，再转化至异源蛋白表达宿主菌。

科技创新导报 Science and Technology Innovation Herald学术论坛头孢菌素是应用广泛的β-内酰胺类抗生素,是7-氨基头孢烷酸(7-aminocepha losporanic acid,以下简称7-ACA)的衍生物,通过7-ACA来生产的半合成头孢菌素占世界抗生素市场40％以上的份额。

因此作为合成半合成头孢菌素的重要中间体,7-ACA的研究生产至关重要。

目前化学和酶法都可以用来从头孢菌素C(以下简称CPC)生产7-ACA。

化学法通过利用亚硝酰氯法或者硅酯裂解法从CP C化学脱酰而得,因为使用硅保护基团保护氨基和羧基,所以产量可以达到90％以上。

但是,化学法操作复杂,对条件要求苛刻,造成生产上的严重浪费且产生的副产品对环境有害,这些昂贵的步骤和对有毒废料的处理都造成了生产成本的提高。

为了克服化学法的缺点,有人提出了两步酶法。

如今,化学方法基本已被两步酶法取代。

头孢菌素酰化酶就是CPC 在酶法脱酰成为7-ACA过程中起到关键作用的酶。

现已报道的具有头孢菌素酰化酶活力的菌株通常都从土壤或污水中筛选得到。

与常规方法比较,利用基因工程菌发酵生产具有周期短、成本低、过程易于规范控制等诸多优点,且由于发酵培养基成分简单、酰化酶基因可受启动子基因调控,使其具备易纯化、可诱导和产量高的特点。

因此利用基因工程菌发酵生产头孢菌素酰化酶成为国内外学者研究的热点。

Matsuda从Pseudomonas sp．SE83中克隆了可以催化CPC脱酰为7-ACA的acyⅡ酰化酶基因,Shin通过定向进化的方法,筛选得到一株6个氨基酸位点发生突变的突变体,酶活提高到突变前的8倍,命名为S12。

本实验室通过基因合成获得全长目的基因,将其构建到pET-28a表达载体上,即pET-28a-S12,在 BL21(DE3)中诱导表达,表达产物经SDS-PAGE凝胶电泳检测后,确定蛋白是由58kDa和25kDa大小2个亚基组成,与文献报导一致。