Western Blot操作步骤

Western Blot技术详细步骤蛋白质印记（Western Blot）是一种常用的生物技术，用于检测特定蛋白质在细胞提取物中的存在。

Western Blot基本步骤如下：1. 准备样品和设备：收集细胞或组织样品，然后使用适当的细胞裂解缓冲液将细胞破碎。

前处理样本并测定蛋白质浓度。

准备凝胶电泳设备，包括聚丙烯酰胺凝胶和Tris-glycine SDS运行缓冲液。

2. 凝胶电泳：将处理好的样品与样品缓冲液混合并加热，然后将其加载到凝胶孔中。

接着将预染蛋白质分子量标记也加载至凝胶中。

开始分子量依赖的电泳，使蛋白质在凝胶中分离。

3. 转印：将蛋白质从凝胶转移到结构更加稳定的膜载体，如聚偏氟乙烯 （PVDF）或者硝酸纤维素膜。

使用电转印或半干转印设备进行转移。

4. 封闭：为防止非特异性结合，使用5%无脂奶粉或BSA溶于TBST （Tris-缓冲的盐水加Tween 20）在膜上进行封闭。

一般封闭时间约为1小时，根据实验需求可调整。

5. 第一抗体孵育：将特异性的一抗稀释 （通常为多克隆或单克隆抗体），然后在封闭液中孵育膜。

根据抗体浓度与孵育时间进行相应优化。

6. 清洗：使用TBST清洗膜，以去除未结合的一抗。

通常需要清洗3次，每次5-10分钟不等，避免一抗非特异性结合。

7. 第二抗体孵育：将标记有荧光或酶的二抗稀释后，再次孵育膜。

封闭液中的二抗通常是与一抗长在不同宿主动物中的特异性抗体。

孵育时间需要优化。

8. 清洗：再次清洗膜，以去除未结合的二抗。

重复步骤6的清洗方法。

9. 检测：将膜放入检测设备中，如化学发光仪、荧光扫描仪等。

等待信号产生并记录结果。

测定蛋白质相对表达量的强度并进行定量分析。

10.数据分析：使用图像处理软件进行定量分析，如ImageJ等软件，并进行归一化处理，一般以内参蛋白（如β-actin, GAPDH等）数据为基准。

以上就是蛋白印记的基本操作步骤，具体细节及操作条件可能因实验室环境和试剂不同而有所差异。

Western Blot目录Western Blot (1)一、所需试剂 (2)1、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒 (2)2、电泳液（可回收使用2次）:配方见三 (2)3、电转液：配方见三 (2)4、TBST（4℃避光保存）：配方见三 (2)5、4X Laemmli样品缓冲液（-20℃保存） (2)6、10-180kda 蛋白marker（-20℃保存1年，4℃3个月） (2)7、转印 (2)8、封闭和孵育（均可用5%脱脂牛奶） (2)9、HRP发光液： (2)10、抗体： (2)11、蛋白印迹膜再生液 (2)12、其他： (2)二、具体步骤 (2)第一天： (2)1、灌胶 (2)2、配制电泳液、电转液各2L，配制TBST 1L（Tween 在需要使用时加入） (3)3、6孔板培养处理细胞（按处理细胞所需时间提前准备），提取蛋白 (3)第二天 (3)1、对蛋白样品进行定量以及配制上样量（包括marker直接20μl），将一抗复温。

(3)2、安装跑胶装置，去除梳子，上样，设置参数（根据目的蛋白大小确定）： (3)3、电转膜： (3)4、免疫杂交反应 (3)第三天： (3)5、显影（1cm2膜使用0.1mlHPR发光液） (3)三、各种配方及注意事项 (4)1、不同浓度的SDS-PAGE分离胶的最佳分离范围： (4)2、不同浓度分离胶配方（其他见说明书）： (4)3、浓缩胶(也称堆积胶、积层胶或上层胶)配方： (5)4、电泳缓冲液配方： (5)5、电转缓冲液配方 (5)6、TBST配方 (5)7、试剂使用注意事项： (5)8、发光液的原理： (5)9、再生液注意事项 (5)一、所需试剂1、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒（1）30% Acr-Bis (29:1)（4℃避光保存）：Acr丙烯酰胺；Bis亚甲基双丙烯酰胺，两者人工聚合成聚丙烯酰胺。

（2）1M Tris-HCl, pH8.8（室温保存）：缓冲溶液，Cl-可作为前导界面，用于配制分离胶（3）10% SDS（室温保存）：十二烷基硫酸钠，是一种阴离子去污剂，带有大量负电荷，可以使蛋白非共价键打开，并结合在蛋白质分子上掩盖蛋白间的电荷差异（4）Ammonium persulfate (过硫酸铵AP)（配成10%溶液分装20℃保存）：该系统的引发剂，可以释放硫酸根自由基，使丙烯酰胺单体等断裂聚合城聚丙烯酰胺（5）四甲基乙二胺（TEMED）（4℃避光保存）：该系统的加速剂，在光照下裂解成自由基，加速聚合。

1.组织中总蛋白的提取；①将少量组织块置于1～2 ml 匀浆器中球状部位，用干净的剪刀将组织块尽量剪碎。

②加400微升去污剂裂解液裂（含PMSF）于匀浆器中，进行匀浆。

然后置于冰上。

③几分钟后再碾一会儿再置于冰上，要重复碾几次使组织尽量碾碎。

④裂解30 min后，即可用移液器将裂解液移至1.5 ml 离心管中，然后在4℃下12000 rpm离心5 min 取上清分装于0.5 ml 离心管中并置于-20℃保存。

2.蛋白含量的测定3.SDS－PAGE电泳（1）清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。

两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。

（2）灌胶与上样①玻璃板对齐后放入夹中卡紧。

然后垂直卡在架子上准备灌胶。

（操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。

）②按前面方法配10%分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。

灌胶时，可用10 ml 枪吸取5 ml 胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。

然后胶上加一层水，液封后的胶凝的更快。

（灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度。

操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。

加水液封时要很慢，否则胶会被冲变型。

）③当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了。

再等3 min 使胶充分凝固就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。

④按前面方法配4%的浓缩胶,加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。

将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。

灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。

插梳子时要使梳子保持水平。

由于胶凝固时体积会收缩减小，从而使加样孔的上样体积减小，所以在浓缩胶凝固的过程中要经常在两边补胶。

待到浓缩胶凝固后，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出。

⑤用水冲洗一下浓缩胶，将其放入电泳槽中。

（小玻璃板面向内，大玻璃板面向外。

若只跑一块胶，那槽另一边要垫一块塑料板且有字的一面面向外。

）⑥测完蛋白含量后，计算含50 μg蛋白的溶液体积即为上样量。

W e s t e r n b l o t基本操作步骤Last updated on the afternoon of January 3, 2021W e s t e r n b l o t基本操作步骤一、细胞蛋白的提取弃去培养基，加入预冷的PBS洗一遍，加入的RIPA裂解液（含1mMPMSF(100×)，每10ml加蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂各一片，六孔板每孔150-250μl，60mm×15mm培养皿300-400μl，），于冰上裂解约5分钟，裂解总液12000rpm离心10min。

取上清，用BCA法测定蛋白浓度。

用于westernblot的蛋白样品取一定量加4×loadingbuffer，10×reducing，再用裂解液补齐到所需上样体积。

离心，使蛋白沉底。

将EP管于沸水中煮5min，变性，之后再离心后准备上样。

二、BCA法测蛋白浓度操作步骤将蛋白标准配制溶液溶解蛋白标准（BSA），配制成5mg/ml的蛋白标准溶液，10μl分装，-20℃冷冻保存。

完全溶解蛋白标准品，取10μl用PBS稀释至100μl，使终浓度为ml。

据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50:1)配制适量BCA 工作液，充分混匀。

BCA工作液室温24小时内稳定。

将标准品按0,1,2,4,8,12,16,20μl加到96孔板的标准品孔中，加稀释标准品的溶液补足到20μl。

加适当体积样品到96孔板的样品孔中（可以通过预实验摸索稀释倍数），加PBS到20μl。

各孔加入100μlBCA工作液，37℃放置30分钟。

测定580nm条件下吸光度。

根据标准曲线计算出蛋白浓度。

三、Westernblot基本操作步骤1、溶液配制：①RunnigBuffer(1×)：SDSRunnigBuffer（20×）50mL，加MiliQ水至1L；②TransferBuffer(1×):TransferBuffer(10×)100mL,甲醇200mL（20%，v/v），加MiliQ 水至1L；③TBST缓冲液1MTris·HCl（）：60.5gTris-base，加入约30ml浓盐酸，调PH至，加MiliQ水至500ml。

Westernblot实验操作详细步骤1.样本制备：a.收集细胞或组织样本并加入提取缓冲液，破碎细胞或组织以释放蛋白质。

b.用超声波破碎机或搅拌器处理样本，使其彻底破碎。

c.避免加入蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂以防止蛋白质的降解。

2.蛋白质分离：a.将样本加入离心管中，并用高速离心分离细胞碎片和细胞核。

b.收集上清液，其中包含溶解的蛋白质。

3.蛋白质浓度测定：a. 使用BCA或Bradford等方法测定提取的蛋白质浓度。

b.根据需要调整蛋白质浓度，以确保每个样本使用相同的蛋白质量。

4.准备SDS-凝胶：a.准备解聚凝胶和浓缩凝胶以进行垂直电泳。

b.根据需要选择合适的胶百分比和凝胶组装器。

c.制备足够的凝胶和凝胶缓冲液。

5.蛋白质电泳：a.将蛋白质样本加入加载缓冲液，并在煮沸过程中使其变性。

b.将蛋白质样本加载至凝胶槽中。

c.根据需要在凝胶中加入预定分子量标记物，以便于蛋白质分子量的确定。

d.以恒定电流进行电泳，直到预定分子量标记物到达所需位置。

6.蛋白质转膜：a.选择合适的膜材料（例如聚偏氟乙烯或硝酸纤维素）。

b.用蛋白质转膜装置将凝胶上的蛋白质转移到膜上。

c.确保膜与凝胶完全贴合，并尽量避免气泡的产生。

7.阻塞和抗体孵育：a.将膜放入含有5%非脂奶粉或1%牛血清蛋白的TBST缓冲液中进行阻塞。

b.在蛋白质靶向抗体中稀释贮存液，并使用适当的稀释倍数进行孵育。

c.将膜和抗体一起放入摇床或孵育箱中，在适当的温度下进行孵育。

8.洗涤：a.用TBST缓冲液洗涤膜以去除未结合的抗体。

b.进行3至5次洗涤，每次洗涤持续5到10分钟。

9.二次抗体孵育：a.将膜放入稀释过的二抗溶液中进行孵育。

b.孵育时间和温度根据抗体种类和需求进行调整。

10.再洗涤：a.用TBST缓冲液进行大约3至5次洗涤。

b.确保彻底洗涤以去除未结合的二抗。

11.信号检测：a.使用化学发光或荧光探针对膜上的蛋白质进行检测。

b.按照探针供应商的说明进行操作。

随着生物学领域的不断发展，Western blot（蛋白质印迹）实验技术已成为研究蛋白质表达和相互作用的重要手段。

本文将为大家提供一份Western blot实验技术全攻略，附详细操作步骤，希望对大家的科研工作有所帮助。

Western blot实验技术全攻略第一步：制备样品Western blot实验需要使用蛋白质样品，因此首先需要制备样品。

一般来说，可以从细胞、组织或生物液中提取蛋白质。

提取蛋白质的方法有很多种，例如细胞裂解、超声波破碎、切片法等。

提取后的样品需要通过蛋白质定量方法确定蛋白质的浓度。

第二步：电泳分离蛋白质将制备好的样品经过蛋白质电泳分离，将蛋白质分离成不同的带状条带。

电泳分离可以采用SDS-PAGE或非变性PAGE方法。

SDS-PAGE适用于大多数蛋白质，这种方法可以将蛋白质分离成不同的分子量带状条带。

非变性PAGE则适用于大分子蛋白质和蛋白质复合物的分离。

第三步：转移蛋白质将分离好的蛋白质转移到聚丙烯酰胺凝胶膜（PVDF）或硝酸纤维素膜（NC）上。

转移蛋白质可以采用湿式电转移或半干式电转移方法。

湿式电转移适用于小分子蛋白质的转移，而半干式电转移则适用于大分子蛋白质的转移。

第四步：阻断和孵育将转移膜放入含有牛血清白蛋白（BSA）或非脂类干奶粉的TBST中，进行阻断。

然后将膜孵育于含有一定浓度的一抗体的TBST中，以便与目标蛋白结合。

第五步：检测和成像将膜孵育于含有适量的二抗体的TBST中，以便与一抗体结合。

二抗体通常被标记为辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AP）。

在使用HRP的情况下，将膜浸泡在ECL底物中，然后用射线或荧光成像系统观察蛋白质的信号。

在使用AP的情况下，将膜浸泡在BCIP 和NBT底物中，然后用射线或荧光成像系统观察蛋白质的信号。

下面是Western blot实验的详细操作步骤：1. 蛋白质提取：将待测样品（如细胞、组织等）进行裂解，以获得蛋白质样品。

2. SDS-PAGE电泳：将蛋白质样品进行电泳分离，以分离不同大小的蛋白质。

Western Blot操作步骤一、 Western blot 实验步骤概述1. 组织取材：组织块称重2. 利用液氮、研钵粉碎组织块3. 加入RIPA缓冲液(每克组织3 ml RIPA)，PMSF(每克组织30μl，10 mg/ml PMSF)，利用Polytron进一步匀浆(15,000转/分*1分钟)维持4℃4. 加入PMSF(每克组织30μl，10 mg/ml PMSF)，冰上孵育30分钟5. 移入离心管4℃约20,000 g(约15,000转)15分钟6. 上清液为细胞裂解液可分装-20℃保存7. 进行Bradford比色法测定蛋白质浓度8. 取相同质量的细胞裂解液(体积*蛋白质浓度)，并加等体积的2×电泳加样缓冲液9. 沸水浴中3分钟10. 上样11. 电泳(浓缩胶20mA，分离胶35mA)12. 电转膜仪转膜(100mA 40分钟)13. 膜用丽春红染色，胶用考马斯亮蓝染色14. Westernblot 试剂盒显色15. 分析比较记录二、 Western具体实验步骤Western，也称Western blot、Western blotting、Western印迹，是用抗体检测蛋白的重要方法之一。

Western可以参考如下步骤进行操作。

1.收集蛋白样品(Protein sample preparation):可以使用适当的裂解液裂解贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品。

对于某些特定的亚细胞组份蛋白，例如细胞核蛋白、细胞浆蛋白、线粒体蛋白等，可以参考相关文献提取这些亚细胞组份蛋白，也可以使用试剂盒进行抽提。

收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。

根据所使用的裂解液的不同，需要采用适当的蛋白浓度测定方法。

因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。

如果使用北京博奥森生物技术公司生产的WIP细胞裂解液，可以使用BCA蛋白浓度测定试剂盒。

Western blot（蛋白印迹法）详细步骤一、组织的研磨准备：研钵、研磨棒、EP管、药匙、液氮、液氮匙、自封袋、一次性手套、棉手套步骤：①用研磨棒将装有冻存组织的EP管敲碎，取出组织，在研钵中盛满液氮，用力敲碎组织，研磨。

②研磨过程中一旦液氮干了，立即加入液氮，保持研磨在液氮中进行，直至组织呈干粉状。

③用在液氮中浸泡过的药匙将研磨好的粉末盛入新的EP管中。

④装有组织粉末的EP管现在液氮中保存，待所有组织都研磨结束后装入自封袋，于-80℃保存。

注意：1.研钵使用前要用锡纸包口、研磨棒用锡纸包头，在烘箱中烘烤180℃至少3h 以上。

2.组织研磨成粉末后待液氮全部挥发后再将组织粉末装管。

3.每种样品都最好留有副管，备用。

二、裂解提蛋白准备：裂解液配制比例RIPA:PMSF=1000：10=100：1若需要加入蛋白酶抑制剂，则比例一般为1:1000（即1ml裂解液加1μl蛋白酶抑制剂）步骤：①将RIPA和PMSF按比例混匀，加入到装有组织粉末的EP管中，一般加入300~500μl左右（浓度尽量高点）。

②盖好盖子，在冰上裂解30~40min.③到时间后于4℃，12000rpm离心10min，取上清液转移到新的离心管中，于-20℃保存。

注意：1.裂解液加入后用手指弹一下混匀，当加入量很少时，成粘稠状，有必要时应用枪头混匀。

三、BCA法测定蛋白浓度（BCA试剂盒）准备：BCA试剂盒（BCA试剂A、BCA试剂B、蛋白标准液）、酶标板、酶标仪、摇床步骤：①按1:15或1:30稀释待测样品，即取1μl样品+14μl水。

③按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B（50:1）根据样品数量配制BCA工作液。

④每个标准品孔加入200μl BCA工作液，样品孔加入待测样品10μl和200μlBCA工作液，充分混匀，在摇床上震荡30s，37℃放置30min，于492nm下测定OD值。

⑤标准曲线以蛋白含量（μg）为横坐标，吸光度为纵坐标，根据样品的吸光度可以在标准曲线上查得相应的蛋白含量。

Western blot protocol一. sample preparation:1．收细胞: 将4˚c 离心机首先预冷至4˚c ，10cm盘用15ml管，15cm盘用50ml 管，1000rpmx5min,弃细胞medium，以少量预冷PBS洗去残留medium，加入相应体积的PBS, 分两次刮下细胞 (optional: 此时细胞可以置于-80˚c store);2．2000rpmx5min，4˚c；3．去上清，每个样品加入裂解液500-600ul（10cm盘）裂解液（lysis buffer 同western blot, -20˚c store, add protein inhibitor freshly），transfer到1.5ml的EP管中，冰上30min；4． 12000rpm，15min，4˚c；5．收集上清，测浓度：在Cuvett 中加入4ul样品+1ml protein assay solution（5×，用水稀释成1×），OD595nm测蛋白浓度，二. SDS-PAGE制胶及电泳（1st day）将大小玻璃板洗净，并用70% ethanol喷淋，以彻底洗净油渍；将2块玻璃板擦净后，之间放置塑胶垫片，底部对齐，安装于固定架上，并将固定螺丝对称扭紧（越紧越好，这样胶才不会漏）；将固定好的玻板架置于底座，下方放置垫片，并将两侧固定旋钮卡紧；适当倾斜玻板架，以100% ethanol 注入2块玻板间，观察5-10分钟，是否漏胶；确定不漏后，开始配制10%分离胶，其他浓度见分子克隆：10%分离胶1块胶2块胶H2O 11.9 23.830% Acrydelamide 10 20pH 8.8 Tris-cl 7.5 1510% SDS 0.3 0.610%AP(-20°c) 0.3 0.6TEMED 0.012 0.024Total Vol. 30 60最后加入AP和TEMED，一旦加入TEMED，混匀后，迅速倒入玻板间，并用70%乙醇封闭，以使界面平整；等待半小时凝胶聚合；并立即以Marker笔标记界面的位置，以便观察是否漏胶；待分离胶凝固后(约需30min)，可以看到一条明显的界线，此时可以倒出70%乙醇，倾斜放置胶架, 等待70%乙醇彻底挥发，可用干净打印纸在两块玻璃板之间拭干残留液滴；配制浓缩胶：1块胶(ml) 2块胶(ml)H2O 5.5 1130% Acrydelamide 1.3 2.6pH 8.8 Tris-cl 1.0 2.010% SDS 0.08 0.1610%AP(-20°c) 0.08 0.16TEMED 0.008 0.016Total Vol. 8 16将浓缩胶迅速倒入槽内，并45度倾斜缓慢插入梳齿，一边插入，一边注意梳子底部是否有气泡，如果有，就把所在气泡的梳齿小心拔出少许，以消除气泡，此动作快速又小心，以防止胶凝固；于上样前检测蛋白浓度，确定上样量，如下图1，其后将样品总蛋白浓度与每天所需检测的蛋白分子名称根据分子量列表（列于同一页，作为实验记录，便于随时阅读和保存，见excel 文件）将梳齿缓慢取出（这样可以避免将加样孔拔变形），以刀片移去碎胶，用dd H2O冲洗，准备电泳槽，将凝胶架置于槽内，上槽加满new running buffer, 下槽加入used running buffer，至淹没下方导线;接通电极，注意电极方向，70-85v, Overnight, or 200v, daytime.电泳结束后取出胶架，润湿后再把胶取出。

wb的简化步骤
WB即Western blot，是一种综合性的免疫学检测技术。

其简化步骤如下：
1. 提取膜蛋白或者总蛋白（主要使用RIPA蛋白裂解液和蛋白酶抑制剂，低温操作）。

2. 制胶（玻璃要洗干净，缓慢铺胶）。

3. 跑电泳（电泳液可以使用干粉直接加双蒸水的，也可以使用SDS、甘氨酸和Tris配制。

上层胶80V+30min，下层胶120V+90min）。

4. 转膜（转膜使用的纤维膜价格较贵，一般分为0.22um、0.47um两种。

小分子蛋白要求孔径小一些，一般300mA+70min，但若发现蛋白在胶上有残留，可适当延长时间）。

5. 封闭（2h BSA或者5%脱脂奶粉，用PBST或TBST配制）。

6. 孵育抗体（4°C过夜，一抗二抗，二抗2h）。

7. 显影（使用ECL）。

WB操作复杂，实验过程中需要严格按照操作步骤进行，同时注意细节和条件的优化，以确保实验结果的准确性。

如果有需要更详细的步骤，可以查询相关的实验手册或者咨询相关的实验技术人员。

Western Blotting SOP一、SDS-PAGE1清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗涤剂轻轻擦洗。

两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。

用前用酒精干燥。

2灌胶与上样：(1)、玻璃板对齐，放好胶条，然后垂直卡在架子上准备灌胶。

（操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。

）(2)、配分离胶：加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。

灌胶时，可用枪吸取胶沿玻璃注入，待胶面升到中间线偏高时即可。

然后胶上加一层水，液封后的胶凝的更快。

（灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度。

操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。

加水液封时要很慢，否则胶会被冲变型。

）(3)、当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了（约30min）。

胶充分凝固就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。

(4)、配5％的浓缩胶,加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。

将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。

灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。

插梳子时要使梳子保持水平。

由于胶凝固时体积会收缩减小，从而使加样孔的上样体积减小，所以在浓缩胶凝固的过程中要经常在两边补胶。

待到浓缩胶凝固后，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出。

(5)、去掉胶条并用水冲洗一下加样孔和胶底部，以去除未聚合的丙烯酰胺，将其放入电泳槽中。

（小玻璃板面向内，大玻璃板面向外。

若只跑一块胶，那槽另一边要垫一块玻璃板。

）(6)、蛋白的溶液体积即为上样量。

取出上样样品至0.5ml离心管中，加入一份4×SDS和3份蛋白样品。

上样前要将样品于沸水中煮5min使蛋白变性。

（在缓冲液中加样。

）(7)、加足够的电泳液后开始准备上样。

（电泳液至少要漫过内测的小玻璃板。

）用微量进样器贴壁吸取样品，将样品吸出不要吸进气泡。

将加样器针头插至加样孔中缓慢加入样品。

（加样太快可使样品冲出加样孔，若有气泡也可能使样品溢出。

加入下一个样品时要换枪头以免交叉污染。

WesternBlot操作步骤1.样品处理：-收集样品：从细胞培养物中收集细胞或从组织中收集组织样品。

-破碎细胞：使用合适的细胞破碎缓冲液将细胞破碎并释放蛋白质。

-甲醇沉淀：向破碎细胞中加入冷甲醇，以沉淀蛋白质，并将混合液冷冻在-20℃或-80℃下，使形成沉淀物。

-洗涤：使用冷丙酮洗涤蛋白质沉淀物，去除甲醇等杂质。

-干燥：在室温下或低真空下干燥蛋白质沉淀物，以去除水分。

2.SDS-：-制备凝胶：根据待分离蛋白的大小范围选择合适的凝胶浓度，如8%-12%聚丙烯酰胺凝胶。

- 制备样品：将样品加入样品缓冲液，如Laemmli缓冲液，并将其煮沸，以使蛋白质样品被变性和解聚。

-样品加载：将样品以适当的体积加载到凝胶孔中。

-电泳：将凝胶浸泡在预冷的电泳缓冲液中，并进行电泳（通常为100-200V），直到样品达到所需的分离程度。

-目视观察：在电泳结束后，可以通过染色或蛋白质染色来可视化分离的蛋白质带。

3.电转印：-制备膜和垫纸：将两张蛋白质转移膜和一片垫纸切割成与分离凝胶相同大小的形状。

-准备电转印池：将电转印池中的电转印缓冲液注满，并将蛋白质转移膜、垫纸和凝胶按顺序放入电转印池中，保持它们之间的紧密接触。

-转印：应用恒定的电流（通常为300mA）进行电转印，以将蛋白质从凝胶转移到膜上，通常需要1-2小时。

-验证电转印的效果：将凝胶和膜进行一致性染色或蛋白质染色，以判断蛋白质是否转移到膜上，是否均匀。

4.膜上抗体反应：-阻断：将膜放在牛血清蛋白（如5%脱脂奶粉）或胶原蛋白（如2%BSA）的阻断缓冲液中，以阻止非特异性的抗体结合。

-一次抗体：加入适当稀释的一次抗体，针对待检测蛋白的抗体。

将膜和一次抗体一起在冰箱中孵育，使二者结合。

-洗涤：用洗涤缓冲液洗涤膜，以去除非特异性结合的抗体。

-二次抗体：添加适当稀释的二次抗体，该抗体与一次抗体结合，并标记有辅助酶或荧光标记物。

-洗涤：用洗涤缓冲液洗涤膜，以去除未结合的二次抗体。

Western blot操作步骤(一)BCA法测定蛋白质含量1.按照BCA方法，利用酶标仪建立蛋白标准曲线；2.测试样品蛋白含量，以计算出合理的上样量。

(二)SDS-PAGE凝胶电泳1.按装模具：取两块玻璃板（1.5 mm厚度），洗净风干后，安装玻璃板，确保下端对齐，不漏液。

2.制备分离胶，分离胶浓度依据所测蛋白分子量来确定。

3.分离胶的灌注：凝胶混匀后，灌入已安装好的玻璃板中，至玻璃板上缘约2cm左右止，缓缓加入超纯水，覆盖在分离胶顶部，防止因氧气扩散进入凝胶而抑制聚合反应，室温聚合。

4.配制浓缩胶，待分离胶聚合后，倒去超纯水，并用滤纸吸干残留的液体，灌制浓缩胶。

5.浓缩胶灌到已聚合的分离胶之上，保持短玻璃板齐平，并立即在浓缩胶溶液中插入干净的梳子，在此过程中应避免气泡的产生，室温聚合。

6.浓缩胶完全聚合后，小心拔出梳子，凝胶玻璃板固定于电泳装置上，放入电泳槽内。

在内外槽内加入1×SDS电泳缓冲液，使电泳装置底部的电极丝完全浸入缓冲液中。

7.样品准备：样品中加相应的上样缓冲液，放入沸水中加热3-5min，然后上样。

8.电泳：上样完成后，接通电源。

浓缩胶部分保持恒压80 V，分离胶保持120V，电泳至溴酚蓝到达分离胶的底部时停止。

(三)Western blot (免疫印迹法检)1.电泳结束后，从电泳装置上卸下玻璃板，取出凝胶。

去除上层的浓缩胶，将凝胶置于转移缓冲液中浸泡30 min；2.准备与胶同样形状、大小的PVDF膜和2张滤纸，将膜和滤纸置于转移缓冲液中浸泡20 min。

(PVDF膜必须先在甲醇溶液中浸泡激发)；3.湿转：将凝胶、PVDF膜、滤纸、棉垫在转移缓冲液中充分浸泡后进行三明治叠板（由负极到正极依次为，棉垫-滤纸-凝胶-PVDF膜-滤纸-棉垫）；4.接通电源，所转膜蛋白的分子量设置电压，开始转膜（转膜过程在冰浴环境中）。

(四)免疫检测1.将转好的PVDF膜放入培养皿中，加入适量的封闭液，在4℃冰箱中过夜（或室温封闭2 h）；2.按抗体的效价用5%的BSA（或封闭液）稀释抗靶蛋白特异性抗体(一抗)。

一、细胞蛋白的抽提6孔细胞培养板中细胞培养液弃去，加入80ul 1×loading buffer，置冰上用刮刀刮匀，吸入EP管煮沸5min。

冷却后12000rpm低温离心5min，上清分装冻存（27ul/支）。

二、Western blot 试剂配方（一）母液1、1 mol/L Tris.HCl pH HCl mlTris 30.29g 7.4 17水200ml * 7.5 16 浓盐酸调pH，完后加H2O定容至250ml. 7.6 158.0 102、10% SDSSDS 10g水100ml 50℃水浴溶解3、10% 过硫酸胺（AP）过硫酸胺0.1g水 1.0ml 4.℃保存,1周内使用.4、1.5mol/L Tris.HCl（pH 8.8）Tris 45.43g水200ml浓盐酸调pH.至8.8，完后加H2O定容至250ml.5、1.0mol/L Tris.HCl（pH 6.8）Tris 30.29g水200ml浓盐酸调pH.至6.8，完后加H2O定容至250ml.6、30%聚丙烯酰胺丙烯酰胺14.55g甲叉双丙烯酰胺0.45g水20ml搅拌后加水到50ml 、棕色瓶４℃保存（１个月／更久）7、20%Tween 20Tween 20 20ml加水至100ml，４℃保存.8、TEMED 直接取用9、G250 考马斯亮蓝溶液（测蛋白含量专用）考马斯亮蓝G250 100mg95%乙醇50ml磷酸100ml加水至1000ml注：乙醇先溶解，再加磷酸、水，混匀后过滤，４℃保存。

（二）胶的配制（现配）10% 12%（常用）分离胶（μl）5% 浓缩胶（μl）水4000 3300 270030%丙烯烯酰胺3300 4000 6701.5M Tris.HCl（pH 8.8）2500 1M Tris.HCl（pH 6.8）50010% SDS 100 4010% AP（最后加）100 40TEMED（最后加） 4 4步骤：1、分离胶灌胶至离梳子下缘1cm左右，上覆水100~200μl，30~60min聚合；2、用滤纸吸去水，配浓缩胶，灌入，插入梳子，注意赶净气泡，约30min聚合；3、放入电泳液中，拔去梳子。

Western Blot 步骤：1、样品处理（细胞样品的处理）：1）培养细胞或药物处理2）弃上清，1*PBS漂洗细胞2遍，去尽残留培养基3）加入1*SDS电泳缓冲液，刮落细胞，转移到EP管中（注意冰上操作）4）4摄氏度下搅拌30分钟5）4摄氏度离心，转速和时间根据细胞不同进行改变，一般是12000转/分，20min。

6）离心管取出，置于冰上，吸取上清，其余丢弃。

7）测定蛋白浓度（BSA、BCA、Lowry、Bradford法），-20摄氏度或-70摄氏度冻存备用。

8）加入Loading Buffer， 95~100摄氏度煮沸5min，若测多种蛋白时，70摄氏度加热5~10分钟更为合适。

2、配胶：将两块玻璃清洗干净，先用洗洁精，再用70%乙醇，最后用ddH20，有Bio-Bad字样朝上，完成后加入H2O，约10分钟，确认无漏水后倒出H20，残留的用滤纸吸干（不要伸到里面去，倾斜后在边缘吸）。

3、根据分子量大小配分离胶:在干净的15mL离心管内配制（过硫酸铵APS最后加入，且需分装），混匀，用1mL枪加至绿线下方1~2mm处，注意不要将液体全打出来，防止气泡产生，从一边到另一边缓缓加入无水乙醇，ddH20溢出后，室温放置25~30分钟，可看到分离胶与ddH20之间有一条清晰的分界线，倒出上层的乙醇，并用ddH2O洗涤两遍，用滤纸吸去残留的水。

（Tris pH：8.8，配制10mL的量）4、配制浓缩胶：APS最后加入，快速加至液体溢出，将清洗干净的梳子水平插入，擦干外面，静置60分钟后应用于下一步试验；或4摄氏度冰箱过夜。

（Tris pH：6.8，一般配制4mL的量）分离胶与浓缩胶的pH一定要调准，否则严重影响实验结果。

APS1周内使用。

5、加样：将配制好胶的玻璃板轻轻取出，不可分离，放入电泳仪，矮面朝内，放平加紧，倒入1*电泳缓冲液，最好内外液面基本持平，或外液面稍矮，放置检查有无漏电泳液，电泳液配制约1000mL，如果电泳仪有漏液情况，则配制1200mL，使内外液面基本持平。

一、提取总蛋白1.将皿中上清吸光后，用外用PBS将皿洗3遍，最后一遍将皿内液体吸光（否则会降低蛋白浓度）。

（亦可先将带有PBS的细胞刮入1.5ml EP管，离心后弃去上清）2.配制裂解液:1ml RIPA裂解液（4度冰箱棕瓶）(0.5M Tris-HCl pH7.5, 150mM NaCl, 1%NP40, 0.5% 去氧胆酸钠, 0.1%SDS)加入5μl PMSF（-20度冰柜内矩形盒小管内）(蛋白酶抑制剂，防蛋白降解).根据皿中细胞团块大小加入100-300μl裂解液, 4℃摇床30min3.皿中液体吸至1.5mlEP管，离心机预冷后， 4℃，12000×g（RCF），离心15min后取上清(装于500μlEP管)（可分装后-20℃保存）。

二、BCA蛋白浓度测定1.按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B（50:1）配制适量BCA工作液，充分混匀；2.完全溶解蛋白标准品（存于-20℃冰箱第一抽屉），取10微升稀释至100微升，使终浓度为0.5mg/ml；3.将标准品按0, 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20微升加到96孔板的标准品孔中，用专用生理盐水补足到20微升;4.加1μL样品到96孔板的样品空中，加生理盐水19微升;5.各孔加入200微升BCA工作液，37℃孵箱放置30分钟;6. 570nm波长测定蛋白。

根据标准曲线计算出蛋白浓度EXCEL详细过程：标曲：上一行吸光度，下一行浓度（0，0.5，1，2，4，6，8，10），以此作标曲，标曲相关系数须达两个9，以这次的样品为例，算得两样品浓度分别为4.09和5.26 因为须上样100μg，所以算得须上样的蛋白体积=100/4.09=24.5μL所以上样须补水30-24.5=5.5μL及βme：6×SDS（2：3）为10μL现此样品蛋白体积足够煮10份，即按照245μL蛋白样品+55μL水+100μLβme：SDS（2：3）来配注意：SDS很粘，须涡旋再低速离心，使用枪时须慢吸三、煮蛋白：加样配制: 总体积:40μL（含蛋白液与dH2O混合物30μL+β-meSDS10μL）1.β-巯基乙醇（β-me）：6×SDS（2：3）样品缓冲液10μL2.蛋白取量取一组蛋白中,样品蛋白加的体积=蛋白浓度最低的浓度*30μL/每个样品浓度3.剩余的体积即30μL-样品蛋白加的体积，即为各管需补加水的体积4.多加一点防煮时蒸发部分混和后file22-start100℃煮沸5 min。

Western blot protocol第一部分：样品制备（一）、所需试剂：1. Western及IP细胞裂解液(KGP701)：Western及IP细胞裂解液分装后存于-20℃冰箱中，避免反复冻融；2. PMSF（100mM）：sigma；3. PBS（二）、所需耗材：离心管、细胞刮、各种规格的枪头（三）、所需仪器：各种量程的移液器、4℃高速离心机（四）、操作步骤：1．在每mL 冷Western及IP细胞裂解液加入10μL 100mM PMSF，混匀。

冰上保存数分钟待用；2. 倒掉已处理好的细胞的培养液，预冷的PBS冲洗两次，每次振摇数次以尽量去除培养液，将培养瓶置于冰上；3. 加入上述适量配制好的Western及IP细胞裂解液（107个细胞加入Western及IP细胞裂解液1 mL～2 mL），用枪吹打数下，使裂解液和细胞充分接触；4. 裂解完毕后，迅速用细胞刮将细胞刮于培养瓶一侧（动作须块），然后用枪将细胞碎片和裂解液转移至1.5ml EP管中（操作在冰上进行），10000转/分，4℃离心5 min（离心机需要预冷）；5. 取上清转移至新的预冷的离心管中，蛋白定量（BCA法）；第二部分：测定蛋白浓度（一）、所需试剂：凯基BCA蛋白含量检测试剂盒（KGPBCA），分装后存于-20℃冰箱中，避免反复冻融。

（二）、所需耗材：Ep管、96孔板、离心管、细胞刮、各种规格的枪头（三）、所需仪器：各种量程的移液器、振荡器、37℃烤箱、酶标仪（四）、操作步骤：1. 根据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50:1)配制适量BCA工作液，充分混匀；2. 取一块96孔板，按照下表加入试剂：3. 把96孔板放在振荡器上振荡30sec，37℃放置30min，然后在562nm下比色测定。

以蛋白含量（μg）为横坐标，吸光值为纵坐标，绘出标准曲线；4. 稀释待测样品至合适浓度，使样品稀释液总体积为20μL，以标准曲线0号管做参比，在562nm波长下比色，记录吸光值；5. 根据标准曲线计算样品实际浓度（单位：μg/μl），将所有样品浓度用裂解液调至4μg/μl；6. 分装保存于-80℃,避免反复冻融。

westernblot操作流程Western blot 操作流程1、取⼀⽣长状态良好的培养⽫（10cm），胰酶消化传代，以1：4传代2、培养24后换液（或第⼆天更换培养液）3、观察细胞的⽣长状态，取在对数⽣长期细胞，占满70%-80%⽫4、⽤PBS洗涤⼀次后，更换新培养液5、加⼊BBR预处理半⼩时后，加⼊H2O2致凋亡处理6、共培养4⼩时后，⽤不含EDTA的胰酶消化收集细胞7、PBS洗涤细胞2次（1200rpm，5-8min）附：BBR计算公式：500µM/L*XµL=10µM/L*10000µL X=200µLH2O2计算公式：200µM/L *10000µL=ρV/34*10 moL ρ=1.11g/mlV=68000/ρ*10-3（µL）V’=68/ρ（µL）=61.3（µL）BBR上调哪些信号通路蛋⽩磷酸化（AKt/p-AKt、ERK/p-ERK、p38/p-p38、JNK/p-JNK）1、选取对照组、1uM BBR、5uM BBR、10uM BBR、20uM BBR2、制作6孔板培养细胞24~48⼩时3、更换培养液后四⼩时，加⼊BBR共培养1⼩时4、准备：碎冰、蛋⽩提取试剂盒、PBS、1.5ml EP管5~8只、1ml EP 管5~8只。

5、配置蛋⽩裂解液，每1ml+1uL+10uLPMSF+5uL配置，预冷离⼼机4度6、在超净台操作，弃培养液，PBS洗涤三次7、将培养⽫置于冰上，每⼗分钟震荡⼀下，共计30分钟8、⽤1ml的枪头吹打细胞呈悬液，收集⾄1.5ml EP管9、置于预冷的离⼼机，离⼼：12000~14000转，5min10、吸取上清液⾄1ml EP管，-80度保存BBR上调哪些信号通路蛋⽩磷酸化（caspase-3、Bcl、Bax、β-actin）1、选取对照组、模型组、1uMBBR、5uM BBR、10uM BBR、20uM BBR2、制作6孔板培养细胞24~48⼩时3、更换培养液后四⼩时，加⼊BBR共培养1⼩时4、准备：碎冰、蛋⽩提取试剂盒、PBS、1.5ml EP管5~8只、1ml EP 管5~8只。