生物化学实验报告
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组别：
生物化学与分子生物学实验教学中心
实验名称质粒DNA的提取、定量、酶切与PCR鉴定
实验日期实验地点
合作者指导老师
评分教师签名批改日期
一、实验目的
1、掌握PCR基因扩增的原理和操作方法。
2、掌握碱裂解法提取质粒的方法。
3、了解紫外吸收法检测DNA浓度与纯度的原理、方法。
4、学习水平式琼脂糖凝胶电泳操作。
二、实验原理
1.PCR：
PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链式反应，是指在DNA聚合酶催化下，以DNA为模板，特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，在体外复制DNA的过程。
包括：
（1）退火：降低溶液温度，使合成引物在低温（35－70℃,一般低于模板Tm值的5℃左右），与模板DNA互补退火形成部分双链；
（2）变性：加热使模板DNA在高温下90℃-95变性，双链解链；
（3）延伸：溶液反应温度升至中温72℃，在 Taq酶作用下，以dNTP为原料，引物为复制起点，模板DNA的一条单链在解链和退火之后延伸为一条双链。
2.质粒DNA的提取与定量：
（1）碱裂解法：
①基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异；
②高碱性条件下，染色体DNA和质粒DNA变性；
③当以高盐缓冲液调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA复性并保存在溶液中，染
色体 DNA不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心形成沉沉淀去除。
（2）离心层析柱：
①硅基质膜在高盐、低pH值状态下选择性地结合溶液中的质粒DNA，不吸附蛋白质、
多糖等物质；
②通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除；
③低盐，高pH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱。
原理示意图
3、质粒DNA的定量测定——紫外分光光度法
（1）物质在光的照射下会产生对光的吸收效应；
（2）物质对光的吸收是具有选择性的；
（3）各种不同的物质都具有其各自的吸收光谱。
因此不同波长的单色光通过溶液时其光的能量就会被不同程度的吸收，光能量被吸收的程度和物质的浓度有一定的比例关系。
因为组成核酸的碱基(G,A,T,C）在260nm处具有强吸收峰，所以通过测定260nm 的吸收峰即可对DNA进行定量。
记录OD260值，通过计算确定DNA浓度，公式如下:
质粒DNA浓度（μg/mL）=50×A
260
×稀释倍数
根据在260nm以及在280nm的读数比值估计核酸的纯度（Ratio=A
260/A
280
）
则：Ratio=1.8 DNA样品较纯,符合实验要求
Ratio <1.6 有蛋白质或其它杂质的污染
Ratio >1.9 RNA污染
4、酶切鉴定：
（1）限制性核酸内切酶是一类能识别双链DNA分子特异性核酸序列的DNA水解酶，是体外剪切基因片段的重要工具酶,可分为型。
其中，II型识别和切割的核苷酸序列专一限制性核酸内切酶识别序列，其识别位点长度为4～6个核苷酸的回文序列。
本实验中用到的两种酶类：EcoRⅠ和HindⅢ就是II型限制性核酸内切酶，可将质粒DNA割成不用大小片段。
（2）不同质粒DNA有不同的核苷酸序列，因而其酶切位点和数量也不同。
水浴酶切后，对其产物进行凝胶电泳的鉴定，根据在电泳凝胶中的区带数和片段的迁移率与已知的DNA为对照，判断酶切片段的大小，从而进行质粒的鉴定。
5.琼脂糖凝胶电泳：
（1）琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度；
（2）DNA分子在碱性环境中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动；
（3）DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。
不同的DNA，分子量
大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带(迁移速度与分子量的对数值成反比关系)。
三、材料与方法：
1.实验材料
（1）实验样品：
菌液：DNA模板(含靶基因片段)；质粒DNA
（2）实验试剂：
①2*Premix Tap酶（50g/ml）
②引物1-SO100 (10mol/L)
③引物2-SO101 (10mol/L)
④灭菌去离子水；
⑤溶液 P1（S1)：50mmol/L 葡萄糖+25mmol/L Tris·Cl(pH8.0)+10 mmol/L EDTA
(pH8.0)
溶液 P2 (S2）：0.2 mol/ L NaOH+1%SDS
溶液 P3（S3）：5mol/L 乙酸钠60ml+冰乙酸11.5ml+水28.5ml
⑥去蛋白液 PE（W1)、漂洗液 WB(W2）、洗脱液 EB（Eluent)；无菌水、10×M酶
切缓冲液、Hind III (15U/ul)、EcoR I (12U/ul)、DNA Marker
（3）实验主要仪器和器材：
PCR仪(BioRad MJ mini)、台式离心机、灭菌的薄壁离心管、紫外分光光度计、凝胶电泳系统、恒温培养箱、比色杯
2.实验步骤
（1）实验流程：
（2）操作步骤: 1) PCR 反应:
① 菌体煮沸10分钟，冷冻，室温下解冻后离心，取上清液。
② 取PCR 反应管，用加样枪加入下列各试剂。
试剂
体积
灭菌去离子水 6ul 2*Premix Tap 12ul 引物1-SO100 (10 mol/L) 1ul 引物2-SO101 (10 mol/L)
1ul 菌液 5ul 总体积
25ul
③ 按照以下顺序操作PCR 仪进行基因扩增 高温变性
低温退火 延伸 Ⅰ 94℃预变性5分钟后开始以下循环 Ⅱ 94℃ 30 秒
55℃ 30 秒 25循环 72℃ 40秒 Ⅲ 72℃ 4 分钟 Ⅳ 4 ℃ 保温
实验过程约1小时30分钟。
2)质粒DNA 的提取与定量：
①养细菌增加质粒 收集、裂解细菌 分离、纯化质粒DNA
②用紫外分光光度计分析测定提取的质粒DNA的浓度和纯度，测定三次，记录数据。
3)酶切分析：
在洁净的离心管中加入以下试剂混匀
试剂名称体积（ul）
无菌水9.0
质粒DNA 7.0(约500ng)
10×R+BSA酶切缓冲液 2.0
HindIII(15U/ul) 1.0
EcoRI(12U/ul) 1.0
总体积20.0
用移液枪轻轻混匀(避免产生气泡),37℃水浴1.5h。
4)琼脂凝胶电泳：
④电泳结束后，切断电源，取出凝胶；
⑤电泳结果分析：用紫外检测仪和凝胶成像
仪观察电泳条带并拍照记录。
四、结果与讨论：
1.实验现象：
（1）碱裂解法提取质粒DNA
加入中和液S3之后，管内出现絮状白色沉淀。
离心后沉淀与底部，上清液呈无色透明。
无色透明的上清液
絮状白色沉淀
图1 碱裂解法提取质粒DNA
（2）用紫外分光光度计分析测定提取的质粒DNA的浓度和纯度，测定三次，记录数据。
结果如下图所示：
图2 紫外分光光度计显示屏
（3）琼脂凝胶电泳，在紫外检测仪条件下，可以观察到不同的物质出现不同的电泳带。
如图所示（注；图3中红色框内为本组实验结果）： M 1 2 3
图3 重组质粒pMD-18T 酶切产物琼脂糖凝胶电泳图
100bp 250bp 500bp 750bp 1000bp 1500bp 2000bp 3000bp 5000bp
M: DL5000 DNA Marker
1:PCR目的条带
2:质粒
3:酶切片段
2.数据分析：
（1）紫外分光光度仪检测质粒DNA的浓度和纯度
测量次数质粒DNA浓度(μg/ml)Ratio值(A
260/A
280
)
1 130.8 1.71
2 130.7 1.75
3 142.2 1.61
平均值134.6 1.69 记录A260值，通过计算确定DNA浓度。
公式如下：
质粒DNA(ug /ml)=50 × A
260
×稀释倍数
用紫外分光光度计可直接测出浓度，其平均值为134.6ug/ml。
根据Ratio=A
260/A
280
的比值估计核酸的纯度.
由分光光度计得出平均值Ratio=1.69小于1.8大于1.6，推测溶液中可能还有少量蛋白质或者其他杂质的污染。
（2）将凝胶电泳图片中实验组与DNA Marker对比，可得出溶液中的片段长度约为：PCR产物：400bp
质粒DNA:3500bp、5000bp
酶切产物：400bp、3000bp
3.结果与分析：
（1）质粒DNA中出现三条带，超螺旋质粒DNA、线性DNA和开环状质粒DNA,这三种
不同构型的分子有不同的迁移率，在一般情况下，超螺旋型迁移速度最快，其次为线性分子，最慢的为开环状分子，所以条带从上到下分别为：开环状质粒DNA、线性质粒DNA、超螺旋质粒DNA。
（2）A
260/A
280
的比值可以反应DNA的纯度
A 260/A
280
=1.8 DNA样品较纯,符合实验要求
A 260/A
280
<1.6 有蛋白质或者其他杂质的污染
A 260/A
280
>1.9 RNA污染
本实验中A
260/A
280
=1.69(在本次实验所要求的范围1.6~1.9),说明DNA样品基本较纯,
符合实验要求
（3）误差分析：
①操作过程中有所失误，由于提供试剂的量较少，可能导致添加试剂的剂量不准
确。
②在溶液混合的过程中，没有等到溶液充分混匀、静置就直接测定了DNA的浓度，
使得比值偏低。
③比色皿的光学面使用过度，存在老化，或有杂质、水珠贴在壁上，影响了测量
的精度。
4.结论：
通过PCR多聚酶链式反应，可以使DNA成倍扩增；质粒DNA有三中不同的构型，含有少量的RNA杂质；限制性核酸内切酶能识别双链DNA分子特异性序列，进行基因片段的剪切，产生不同的酶切图谱。
本次实验测定质粒DNA的浓度是134.6μg/mL ，A
260/A
280
比值为1.69。
溶液中有
少量蛋白质或者其他杂质的污染。
5.思考题：
（1）碱法提质粒中溶液I、II、III的作用？
答：①溶液I中葡萄糖可悬浮细胞，EDTA鳌合金属离子使DNase失活。
②溶液II为NaOH-SDS液，细胞壁肽聚糖在碱性下水解，核酸和蛋白质变性。
③溶液III为3mol/L KAc或NaAc溶液，酸性条件下质粒DNA复性，变性蛋白
-SDS＋线性DNA沉淀，Na＋可中和DNA
（2）结合实验情况，如何提高限制性酶切的反应效率？
答：①提高DNA的浓度，尽量将其中的蛋白质及其他杂质除尽。
②调节到适宜的温度，一般在37度左右。
③尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶。
④选择合适的离子强度可以激发酶切反应。
⑤酶量的选择任何时候2种酶的总量都不超过反应体系的1/10体积，而且最大
反应体系最好不要小于20 ul。
⑥DNA分子构型对核酸内切限制酶的活性有很大影响，如消化超螺旋的DNA比消
化线性DNA用酶量要高出许多倍，可以改变DNA的构象，使其简单化。
