中文摘要
目的：Viperin是一个广谱抗DNA和RNA病毒的重要抗病毒蛋白。本课题发现病毒在诱导Viperin表达的同时促进Viperin发生泛素化和降解，因此，为增强Viperin在病毒感染过程中的表达，本课题拟鉴定调控Viperin泛素化的泛素连接酶和去泛素化酶，以及进一步探讨该泛素连接酶和去泛素化酶如何通过调控Viperin 表达进而影响病毒感染的具体信号机制。本项目通过探索蛋白质泛素化调控宿主抗病毒信号的新机制，旨在为临床抗病毒治疗提供潜在的分子靶标。
方法：
（1）利用Viperin过表达质粒或Viperin knockdown质粒转染肺癌细胞系，然后感染VSV或SeV或H1N1病毒，采用Realtime qPCR或Western Blot方法分析Viperin在细胞水平的抗病毒能力；分析病毒在侵染肺组织或者细胞过程中Viperin 蛋白表达水平；探究病毒对Viperin蛋白泛素化修饰和蛋白水平影响。
（2）利用Flag-Viperin过表达质粒转染细胞，免疫共沉淀Flag，然后质谱分析与Viperin相互作用蛋白，筛选鉴定与其相互作用的E3泛素连接酶；探究E3泛素连接酶UBE4A对Viperin泛素水平和蛋白水平的调控；探究病毒感染过程中UBE4A对Viperin蛋白具体调控机制；分析UBE4A在IFNs介导的抗病毒功能中的作用；分析UBE4A调控Viperin泛素化的具体位点和泛素化类型。
（3）利用蛋白-蛋白相互作用干扰肽设计原理，合成特异性针对UBE4A-Viperin相互作用的小分子干扰肽；探究干扰肽对Viperin与UBE4A相互作用的影响；分析干扰肽对Viperin泛素化水平和蛋白水平的影响。进一步，小鼠体内分析干扰肽对宿主抗病毒能力的影响。
（4）利用实验室去泛素化酶过表达文库，采用Western Blot方法并结合质谱数据鉴定调控Viperin泛素化的去泛素化酶USP33；探究USP33对Viperin蛋白稳定性以及泛素化水平的影响；分析USP33在IFNs介导的抗病毒功能中的作用。
（5）采用Western Blot对常见离子化合物进行初步筛选，鉴定出NaCl调控USP33蛋白水平；采用免疫共沉淀和Western Blot方法，分析NaCl对USP33蛋白
水平以及对Viperin泛素化水平和蛋白水平的影响。小鼠体内实验：探究高盐饮食对宿主抗病毒能力影响。
结果：
（1）Realtime qPCR和Western Blot结果均显示，病毒在诱导Viperin蛋白表达的同时促进了Viperin蛋白泛素化降解。
（2）质谱结果显示E3泛素连接酶UBE4A和能与Viperin相互作用。结果显示UBE4A通过上调Viperin泛素化水平促进蛋白降解；病毒通过上调UBE4A进而限制Viperin蛋白表达；深入分析发现，UBE4A通过Viperin206赖氨酸位点促进其K6类型的泛素化增加。
（3）成功设计合成并筛选出抑制UBE4A-Viperin相互作用的干扰肽。干扰肽能够明显抑制UBE4A与Viperin相互作用，并抑制Viperin蛋白泛素化修饰进而稳定Viperin蛋白。体内实验结果显示，干扰肽促进宿主体内天然抗病毒能力。
（4）实验结果显示，去泛素化酶USP33通过抑制Viperin蛋白的泛素化稳定其蛋白水平；USP33促进IFN介导的抗病毒功能。
（5）筛选结果发现，NaCl通过下调USP33的蛋白水平促进Viperin蛋白的泛素化修饰，进而抑制Viperin蛋白表达；小鼠体内实验结果显示，NaCl通过调控USP33来抑制宿主的抗病毒能力。
研究结论：
Viperin蛋白表达受泛素化修饰的显著影响；病毒通过上调UBE4A促进Viperin 蛋白泛素化修饰进而抑制宿主的抗病毒能力；NaCl能通过下调USP33蛋白水平促进Viperin蛋白泛素化修饰，进而抑制宿主抗病毒功能。
关键词：泛素化；Viperin；泛素连接酶；去泛素化酶；干扰肽
作者：袁玉康
指导教师：郑慧