土槿皮乙酸通过P53和caspase蛋白抑制人乳腺癌细胞MCF-7生长机制研究

土槿皮乙酸通过P53和caspase蛋白抑制人乳腺癌细胞
MCF-7生长机制研究
田杰;任配友;李锐;刘春禹
【摘要】MCF-7细胞是caspase 3功能缺失的乳腺癌细胞,本研究结果发现土槿皮乙酸(PAB)可激活caspase 3的上游蛋白caspase 8和caspase 9来诱导细胞凋亡,同时PAB通过P53蛋白诱导人乳腺癌细胞MCF-7凋亡.本试验结果为进一步阐明PAB抗乳腺癌奠定了基础.
【期刊名称】《中国畜牧兽医》
【年(卷),期】2014(041)005
【总页数】4页(P155-158)
【关键词】土槿皮乙酸;P53蛋白;caspase 8;caspase 9;MCF-7细胞;凋亡
【作者】田杰;任配友;李锐;刘春禹
【作者单位】长春医学高等专科学校,吉林长春130031;吉林大学白求恩第一医院甲状腺外科,吉林长春130000;吉林大学白求恩第一医院甲状腺外科,吉林长春130000;长春中医药大学附属医院针灸科,吉林长春130000
【正文语种】中文
【中图分类】Q344+.14
土槿皮为松科植物金钱松的干燥根皮或近根树皮，土槿皮乙酸（pseudolaric acid B，PAB）是从土槿皮中分离得到的新型二萜酸化合物。

研究结果表明PAB具有
抗真菌（Li等，1995）、抗肿瘤（Yu等，2007；于静华等，2011）、抗血管生成（Tan等，2004）、抗微管（Tong等，2006）等药理作用。

本试验旨在研究PAB诱导人乳腺癌细胞MCF-7凋亡的模型中P53蛋白和caspase家族蛋白的活化，以期为进一步探讨PAB的抗肿瘤作用机制提供依据。

1.1 材料
1.1.1 试剂 PAB购于中国药品生物制品检定所，应用时用二甲基亚砜（DMSO）溶解，并使DMSO的终浓度低于0.1%；DMSO和P53抑制剂（pifithrin）均购自Sigma公司；caspase 8和caspase 9抑制剂均购自Calbiochem公司；RPMI 1640培养基购自Gibco公司；胎牛血清购自北京元亨圣马生物试剂公司；P53、caspase 8、caspase 9、tubulin抗体及辣根过氧化物酶标记的二抗均购自Santa Cruz公司。

1.1.2 细胞 MCF-7细胞购自American Type Culture Collection（ATCC）。

1.2 方法
1.2.1 细胞培养及MTT分析抑制率 MCF-7细胞单层接种在含10%胎牛血清、20 g/L谷氨酰胺的RPMI 1640培养液中，在37℃、5%二氧化碳培养箱中培养。

取处于对数生长期的MCF-7细胞接种于96孔培养板中，1×104/孔，100μL/孔，培养12 h后，加入1.25、2.5、10μmol/L PAB分别作用12、24、36、48 h后测定其抑制率。

每个浓度设3个平行孔，于37℃、5%二氧化碳培养箱中继续培养36 h，每孔加入5 g/L MTT 20μL，继续培养3 h后，加入150μL DMSO溶解，于酶标仪492 nm处检测，计算药物的体外生长抑制率。

1.2.2 形态学观察以每孔1×105个细胞接种于6孔板中，培养12 h后，6孔分别加入空白培养液、4μmol/L PAB、1μmol/L P53抑制剂、1μmol/L P53抑制剂+4μmol/L PAB、20μmol/L caspase 8抑制剂、20μmol/L caspase 8抑制剂
+4μmol/L PAB、20μmol/L caspase 9抑制剂、20μmol/L caspase 9抑制剂
+4μmol/L PAB，作用36 h后，用倒置光学显微镜观察并记录形态学变化。

1.2.3 Western blotting分析蛋白表达收集5× 106个以上细胞，3000 r/min离心10 min，PBS洗2次，80μL细胞裂解液（50 mmol/L HEPES、1% Triton X-100、100 mmol/L NaF、1 mmol/L EDTA、1 mmol/L EGTA、2 mmol/L正钒酸钠、1 mmol/L PMSF、10 g/L pepstatin A）于冰上裂解1 h，10000 r/min 离心5 min，收集上清。

加入20μL 5×上样缓冲液（250 mmol/L Tris-HCl（p H 6.8），100 g/L SDS，50%甘油，5 g/L溴酚兰，5%二巯基乙醇），沸水中煮3 min，使蛋白变性。

每个点样孔加20μL样品液；12%SDS-聚丙烯酰胺凝胶分离蛋白；凝胶上的蛋白带转移到硝酸纤维素膜上；封闭液封闭膜上的蛋白结合位点2 h；加入抗P53、caspase 8和caspase 9的抗体（一抗）及辣根过氧化物酶标记的二抗；显色。

1.2.4 数据分析所有试验结果均得自3次独立试验，数据以平均值±标准差表示。

2.1 PAB对MCF-7细胞增殖的影响 1.25、2.5和10μmol/L PAB分别作用12、24、36、48 h后，其抑制率结果见图1。

由图1可知，12 h不同浓度PAB的作用效果并不是很明显，但从24 h开始，PAB的抑制率明显增加，并呈时间剂量依赖性。

2.2 P53、caspase 8和caspase 9抑制剂对PAB诱导的细胞凋亡的影响
4μmol/L PAB作用36 h，细胞浮起变圆，凋亡小体出现。

但加入P53抑制剂及caspase 8和caspase 9抑制剂后，浮起变圆细胞数目减少（图2）。

结果表明PAB激活P53、caspase 8和caspase 9蛋白以诱导细胞凋亡。

2.3 PAB对P53、caspase 8和caspase 9蛋白表达的调节作用4μmol/L PAB作用不同时间点后，细胞内P53蛋白的表达逐渐增加，在36 h时细胞内P53蛋白表达最高，而细胞内caspase 8的前体（procaspase 8）和caspase 9的前体（procaspase 9）的表达逐渐减少（图3），结果表明其被裂解为活性形式。

PAB诱导多种肿瘤细胞凋亡，其作用机制涉及到死亡受体途径、线粒体途径及有
丝分裂原活化的蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases）途径。

但
MCF-7细胞是caspase 3功能缺失的细胞（Yu等，2007），而caspase 3是凋
亡的执行蛋白，主要促进DNA的剪切及DNA片段化，研究结果发现没有caspase 3的活化细胞不易凋亡（Fu等，2013）。

在本研究中PAB时间剂量依
赖的抑制MCF-7细胞生长，表明其对caspase 3缺失的乳腺癌细胞具有抗肿瘤效果。

caspase的前体procaspase被剪切为caspase后执行功能，caspase 3的上游蛋白是caspase 8和caspase 9，caspase 8参与死亡受体途径，而caspase 9参与线粒体途径（Chinnaiyan等，1995；Wajant，2002；Nagata等，1995），不同的应激诱导不同通路的激活。

尽管前期研究已确定PAB诱导细胞凋亡，但PAB作用后，其上游蛋白caspase 8和caspase 9是否活化仍未知。

本研究结果
发现PAB作用12 h后，细胞内procaspase 8和procaspase 9表达降低，表明其前体在PAB作用后被剪切为活性的caspase 8和caspase 9，证明caspase 8
和caspase 9参与细胞凋亡，即线粒体途径和死亡受体途径均参与PAB诱导的细胞凋亡。

但caspase 8和caspase 9下游蛋白caspase 3在MCF-7细胞中是缺
失的，说明caspase 8和caspase 9可能绕过caspase 3直接执行凋亡功能，或
通过其他蛋白诱导细胞凋亡，这需进一步的试验验证。

P53是细胞内的主要蛋白，其参与多种细胞功能，如凋亡和细胞周期阻滞等（Caroline等，1998；May等，1999）。

P53抑癌基因在许多肿瘤细胞中已确实，本研究结果发现MCF-7细胞
中有P53蛋白的表达，抑制P53蛋白后，细胞凋亡减少，而P53蛋白在PAB作
用后表达上调，表明P53参与细胞凋亡。

本研究结果为进一步探讨PAB抗肿瘤机制奠定基础，证明在没有caspase 3的人乳腺癌细胞中上游蛋白可被活化的事实，这为开发抗乳腺癌药物奠定基础。

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