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血红蛋白的提取和分离 ppt课件
血红蛋白的提取和分离 ppt课件
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3.纯化:通过凝胶色谱柱将相对分子质量较大的
杂质蛋白除去。操作如下: (1)凝胶色谱柱的制作。 (2)凝胶色谱柱的装填
①材料:本实验使用的是交联葡聚糖凝胶。 ②方法:凝胶用_蒸__馏__水__充分溶胀后,配成凝胶悬 浮液,一次性缓慢倒入色谱柱内。不能有__气__泡__存
在;不能发生洗脱液流干露出凝胶颗粒的现象。 (3)样品的加入和洗脱 ①a.准备:加样前,打开流出口,使柱内凝胶面上 的缓冲液缓慢下降到与__凝__胶__面__平齐,关闭出口。
2.配制:由1~2种缓冲剂溶解于水中配制而成, 通过调节缓冲剂的_使__用__比__例_就可以得到不同pH范
围内使用的缓冲液。
三、电泳 1.概念:指_带__电__粒__子_在电场的作用下发生迁移的
过程。 2.原理:在一定的pH下,多肽、核酸等生物大分
子的可解离基团会带上正电或负电,在电场的作 用下,这些带电分子会向着与其所带电荷_相__反__的
b.加样:用吸管小心地将1 mL透析后的样品加到
色谱柱的顶端,注意不要破坏凝胶面。 c.加样后:打开下端出口,使样品渗入凝胶床内. ②洗脱:加入_磷__酸__缓__冲__液___,打开下端出口,进行
洗脱。 4.纯度鉴定:在鉴定的方法中,使用最多的是 SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳。
五、操作提示 1.红细胞的洗涤:洗涤次数、离__心__速__度__与离心时
基础自主梳理
一、凝胶色谱法 1.概念:也称作分配色谱法,是根据_相__对__分__子___ 质量的大小分离蛋白质的有效方法。 2.原理 (1)由微小的多孔球体构成的凝胶,内部有许多贯 穿的通道。
(2)由相对分子质量不同的蛋白质通过凝胶时,相对 分子质量_较__小__的蛋白质容易进入凝胶内部的通道, 路程较长,移动速度较慢,而相对分子质量较大的 蛋 白 质 无 法 进 入 凝 胶 内 部 的 通 道 , 只 能凝在胶__外__部____ 移动,路程较短,移动速度较快,从而使相对分子 质量不同的蛋白质分子得以分离。 二、缓冲溶液 1.作用:在一定范围内,抵制外界的__酸__和__碱__对溶 液pH的影响,维持pH基本不变。
间十分重要。洗涤次数过少,无法除去血浆蛋白: 离心速度过高和时间过长会使_白__细__胞__等一同沉淀, 达不到分离效果。
2.色谱柱填料的处理:商品凝胶使用前需直接 放在洗脱液中膨胀,可以将加入其中的湿凝胶用 __沸__水__浴__加热,加速膨胀。 3.凝胶色谱柱的装填:在装填凝胶柱时,不得 有气泡存在。气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱 次序,降低分离效果。 4.蛋白质的分离:如果红色区带__均__匀__一__致__地 移动,说明色谱柱制作成功。
思考感悟 1.洗涤红细胞时为什么不能用蒸馏水代替生理盐 水? 【提示】 生理盐水能保持红细胞的渗透压稳定 而不至于破裂。在未洗净血浆中的杂质蛋白前, 红细胞如果提前破裂,就可能使血红蛋白与杂质 血浆蛋白混在一起,加大了分离的难度。
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(2)血红蛋白的释放:在蒸馏水和__甲__苯____的作 用下,红细胞破裂,释放出血红蛋白。
电极移动。
3.作用:电泳利用了待分离样品中各种分子带电 性质的差异及分子本身的大小、形__状__的不同,使带 电分子产生不同的__迁__移__速__度____,从而实现样品中 各种分子的分离。 4.方法:常用的电泳方法有琼脂糖凝胶电泳和聚 丙烯酰胺凝胶电泳。
四、实验操作 1.样品处理:通过_红__细__胞__的__洗__涤____、 _血__红__蛋__白__的__释__放_______、分离血红蛋白溶液等操作 收集血红蛋白溶液。 (1)红细胞的洗涤:目的是去除杂蛋白。分离时采取 低速短时间离心,直至上清液中没有黄色,表明红 细胞已洗涤干净。
核心要点突破
解读实验原理
1.蛋白质分子在凝胶中的运动情况分析
直径大小
运动方式 运动速度 运动路程
洗脱次序
相对分子质量大
相对分子质量小
大于凝胶颗粒空隙直 小于凝胶颗粒空隙直
径
径
垂直向下运动
无规则的扩散运动
较快
较慢
较短
较长
先从凝胶柱中洗脱出 来
后从凝柱中洗脱出来
2.电泳方法
琼脂糖凝胶电泳
由于琼脂糖本身不带电 荷,各种分子在电场中 迁移速率决定于所带电 荷性质的差异及分子的
大小、形状不同
聚丙烯酰胺凝胶电泳 在凝胶中加入SDS,使 蛋白质解聚成单链,与
各种蛋白质形成蛋白 质—SDS复合物,使其 迁移速率完全取决于分
子的大小
例1 (2011年聊城高二检测)有关凝胶色谱法和电 泳法的说法正确的是( ) A.它们都是分离蛋白质的重要方法 B.它们的原理相同 C.使用凝胶色谱法需要使用缓冲溶液而电泳不 需要 D.以上说法都正确 【尝试解答】 __A__
课题3 血红蛋白的提取和分离
课标领航
1.概述凝胶色谱法、电泳法等分离大分子 的基本原理。 2.能根据凝胶色谱过程中的现象和结果, 评价实验操作的过程是否规范,分析实验结 果。 3.尝试对血液中血红蛋白的提取和分离, 体验从复杂的体系中提取生物大分子的基本 过程和方法。 【重点】 凝胶色谱法、电泳法基本原理。 【难点】 实验操作的过程及分析。
于分液漏斗中静置片刻后,分离出下层的红色透
明液体。 2.粗分离:即透析 (1)方法:将血红蛋白溶液装入透析袋,将透析袋 放入一定量适宜浓度的_磷__酸__缓__冲__液__中,透析12 h. (2)目的:将样品中分子较小的杂质除去。 (3)原理:透析袋能使小分子自由进出,而将大分 子物质保留在袋内。
思考感悟 2.在血红蛋白释放过程中,加入蒸馏水和甲苯的 目的是什么? 【提示】 (1)加入蒸馏水使红细胞吸水涨破。 (2)细胞膜的主要成分为磷脂,易溶于甲苯等有机 溶剂,加入甲苯能加速红细胞破裂并释放出血红 蛋白。
(3)分离血红蛋白溶液:把搅拌好的混合液离心后, 将试管中的液体用滤纸过滤,除去脂溶性沉淀层,
情境导引
为年老多病的人注射丙种 球蛋白,可以在一定程度上增强 其身体的抵抗力。在动物体内, 丙种球蛋白和许多蛋白质混合 在一起。要获得纯净的丙种球蛋 白制品,就必须进行提取和分离。 电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差 异以及分子本身的大小、形状的不同,使带电分 子产生不同的迁移速度,从而实现了样品中各种 分子的分离。
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