大鼠胚胎成纤维细胞的分离培养及生物学特性
商爱民;吴靖芳;薛刚;张静;张耕
【摘要】目的:探讨影响大鼠胚胎成纤维细胞(REF)分离和培养的一些因素,以建立稳定的REF培养体系.方法:取SD大鼠胚胎分离成纤维细胞,利用体外培养体系,对REF的生长形态、生长曲线进行观察,以探讨不同胚胎日龄以及不同胰酶作用时间对REF分离及培养的影响,并对其进行免疫细胞化学鉴定.结果:13.5d 胎龄鼠胚的REF分离效果优于10.5d、18.5d 胎龄鼠胚;REF在体外为贴壁生长型细胞,第三代细胞增殖旺盛;并表达波形蛋白(vimentin)、层黏连蛋白(laminin,LN)和纤维连接蛋白(fibronectin,FN)蛋白.结论:13.5d 胎龄SD大鼠REF以H-DMEM做培养基,在第3代增殖旺盛,合成多种细胞外基质,最适宜作胚胎干细胞或其它悬浮培养细胞的饲养层.
【期刊名称】《神经药理学报》
【年(卷),期】2010(027)003
【总页数】4页(P17-20)
【关键词】大鼠;胚胎;成纤维细胞;层黏连蛋白;纤维连接蛋白
【作者】商爱民;吴靖芳;薛刚;张静;张耕
【作者单位】河北北方学院教务处,河北,张家口,075000;河北北方学院基础医学院组织学与胚胎学教研室,河北,张家口,075000;河北北方学院附属第一医院耳鼻咽喉-头颈外科,河北,张家口,075000;河北北方学院基础医学院组织学与胚胎学教研室,河北,张家口,075000;河北北方学院基础医学院组织学与胚胎学教研室,河北,张家口,075000
【正文语种】中文
【中图分类】R329.2;Q256
胚胎成纤维细胞饲养层是体外成功培养人胚胎干细胞(embryonic stem cells,ES)
细胞的必要条件。
主要分泌某些细胞因子如成纤维细胞生长因子、白血病抑制因子[1],以促进 ES细胞增殖以及抑制分化。
同时又能分泌细胞外基质,如纤维连接蛋白(fibronectin,FN)、层黏连蛋白(laminin,LN)等。
胰岛细胞从它们自然的细胞外基
质中分离出来将可能经历一种奇特的凋亡死亡过程[2]。
为分离的胰岛移植前提供
合适的微环境,许多学者采用小肠粘膜细胞、肝细胞、垂体前叶细胞、Sertoli细胞与胰岛共同培养均可使“目的细胞”的存活和功能情况明显改善[3-5]。
本研究对
影响大鼠胚胎成纤维细胞(REF)分离和培养的一些因素和方法进行探索,旨在建立稳定的REF培养体系。
1.1 材料
1.1.1 实验动物成年SD大鼠孕鼠(12～14d)5只,由军事医学科学院动物中心提供。
1.1.2 实验试剂 H-DMEM、胰蛋白酶(Gibco公司)、胎牛血清(Hyclone公司);青
霉素、链霉素(华北制药)、台盼兰、MTT(Sigma公司);Vimentin、细胞角蛋白
18(Cytokeratin 18,CK18)单克隆抗体、FN、LN多克隆抗体、生物素标记的羊抗
鼠试剂盒、生物素标记的羊抗兔试剂盒、生物素标记的羊抗兔试剂盒(中杉公司);DAB显色试剂盒。
1.1.3 实验仪器手术器械、相差显微镜(NikonTE2000)、普通光学显微镜(Olympus BH-2)、CO2培养箱(Forma公司)、酶标仪。
1.2 方法
1.2.1 原代REF的制备[6]将性成熟雌鼠(6～8周龄)与雄鼠(8周龄)按2∶1比例合笼,每天早上观察雌鼠阴道口,有乳白色或淡黄色胶冻状物(阴道栓)者即认定为怀孕
0.5d。
取妊娠10.5～18.5d的孕鼠,按薛庆善[7]的方法制备上清液。
重复其消化过程,直至上清澄清为止。
合并各次上清,1000r/min离心5min,弃上清,以完全培养液吹吸悬浮沉淀成单细胞悬液,加入75cm2培养瓶,37℃,5%CO2培养。
1.2.2 台盼兰排斥实验检测原代REF细胞存活率
将REFs单细胞悬液细胞密度调整为106细胞/ mL。
取9滴细胞悬液滴到载波片上,加1滴0.4%的台盼兰溶液,混匀。
3min之内用血球计数板分别记数活细胞数和死细胞数(注:镜下观察,死细胞被染成淡蓝色,而活细胞拒染)。
根据公式:活细胞率(%)=活细胞总数/(活细胞总数+死细胞总数)×100。
1.2.3 二代REF培养原代REF生长铺满培养瓶后消化传代,消化液为0.25%胰酶,在显微镜下观察消化过程,见细胞变圆后立即以完全培养液(含10% FBS、100U/mL 青霉素和80U/mL链霉素的DMEM低糖培养液)终止消化。
1.2.4 细胞的冻存与复苏冻存液为1份二甲基亚砜(DMSO)与9份完全培养液混合,冻存与复苏按常规进行。
1.2.5 细胞生长曲线测定
①将接种前的一部分均匀REF单细胞悬液接种于96孔板,每孔加样200μL,接种9排,每排5孔,测定1排/d;②将96孔板置于37℃孵箱里培养1d;③培养终止前4h 向所测排的每孔加入MTT 20μL;④置于37℃孵箱继续培养4h;⑤4h后吸去上清,加入150μL DMSO终止;⑥将 96孔板置于酶标仪上, 490nm测定吸光度。
1.2.6 REF细胞爬片
将P0、P1、P2、P3代REF接种后留少许均匀REF单细胞悬液接种于铺有盖玻片的6孔板,每孔加样2～3mL(铺满每孔底部即可)。
37℃孵箱培养1～2d。
盖玻片上细胞密度适中,可以终止培养。
细胞爬片用PBS清洗3次;95%的酒精固定
15min。
PBS清洗3次。
晾干后以中性树胶将无细胞侧贴于载玻片,待用。
1.2.7 爬片染色
固定后的爬片以蒸馏水洗涤,PBS洗3次。
常规HE染色:苏木素中染色2～5min。
流水清洗,1%盐酸溶液分色。
1%氨水蓝化;流动自来水清洗爬片3次。
0.5%伊红水溶液中1～5min。
爬片进入蒸馏水中清洗。
梯度酒精脱水、二甲苯透明。
中性树胶封片。
免疫细胞化学染色按试剂盒说明书进行,苏木精复染细胞核。
阴性对照略去一抗其余步骤不变。
2.1 细胞生长曲线
由图1可见第3代REF在培养至第3d时进入对数生长期,细胞快速增加,至6d时细胞数达高峰,未经明显的平台期,便进入衰退期,细胞数量下降,可见有细胞漂浮。
2.2 生长形态观察
胚胎组织经胰酶消化解聚后呈球形。
REF在体外为贴壁生长型细胞,大小不均,异质性较大,原代培养约4～12 h开始贴壁,胞质向外伸出伪足而形成梭形、多边形或不规则异形等形状,中间有卵圆形核。
原代REF细胞中有时杂细胞较多,可能混杂有上皮样等细胞(图2)。
传两代后(P3)细胞才较纯,第五代(P5)以后,细胞开始老化。
可见细胞伪足增多,并有分叉,细胞内颗粒增多,细胞之间空隙较大(图3、4)。
2.3 原代消化后细胞存活率台盼兰染色后计细胞总数共1 800个,其中着色细胞(死细胞)106个,未着色细胞(活细胞)1 694个,细胞存活率94.11%。
2.4 胚胎日龄胎鼠对REF的影响
10.5 d、13.5d、18.5d龄小鼠胚胎均可分离得到成纤维细胞,但10.5d鼠胚太小,不利操作,分离所得细胞数量少;18.5d鼠胚有骨细胞的混杂,分离所得成纤维细胞中杂细胞较多,且易老化;13.5d胎鼠分离所得细胞数量多,杂细胞较18.5d胎鼠少,细胞增殖能力强。
2.5 冻存对REF的影响
我们对冻存的P1和P2代细胞复苏后的培养情况观察发现P1代细胞复苏后形态要优于P2代,且复苏细胞传代后与未经冻存的细胞相似,不影响其活性和功能。
2.6 爬片染色结果
REF经 HE染色后(图5～图8)细胞呈梭形或多边形。
染为粉红色。
核圆或椭圆形居中,着紫蓝色,核仁明显。
免疫细胞化学结果显示:原代REF中绝大部分细胞vimentin和fibrinectin免疫反应阳性,有少部细胞呈ck18阳性。
免疫反应产物位于胞质,呈棕黄色颗粒或纤维状。
细胞核呈篮色居中,核仁明显。
3.1 胰酶消化时间
在原代分离REF用胰酶消化组织细胞时,既要离散细胞间质,又要防止胰酶对细胞的损害,减少细胞因消化过度而死亡。
条件控制适当可提高原代细胞的活性。
我们的体会是:以0.25%的胰酶消化时,分次消化效果最好。
首次加入少量胰酶以吸管轻吹打,不要吹起泡沫,1min即为糊状。
难于吸取消化好的细胞。
此时可加入培养液稀释粘稠的糊状组织,不断吸取上清加入事先准备的血清终止消化。
未消化的组织块自然沉于瓶底。
继续加入胰酶消化,反复数次直至组织块基本消失为止。
这样克服了部分细胞消化过度或消化不全的问题,得到活性好产量高的原代细胞。
传代时以0.25%胰酶消化时为避免细胞受损,最可靠的方法是在显微镜下进行消化,90%细胞变圆后立即加入培养液终止消化,这种观察消化法既达到离散细胞又尽量少损伤细胞的目的。
3.2 REF生长状况
从图2中可以清晰地看到,如文献所述,MEF细胞多呈棱形或条带状有少数呈不规则的三角形、星形。
原代细胞形态多样且免疫细胞化学证实混有CK18阳性细胞(上皮特异的标志),说明此时细胞纯度不是很高。
随传代的增加第二代和第三代几乎无CK18阳性细胞混杂说明纯度随传代而增加。
但传到5代以后,可见细胞伪足伸长形成明显突起并呈多极化。
不少细胞不再是正常的棱形或条带状,出现细胞形态增大、细胞边缘弯曲卷曲的,说明细胞出现老化现象。
如作为饲养层应以3、4代细胞为宜。
结合冻存对REF的影响结果,我们认为若将其作为饲养层,可以将原代分离的
细胞冻存。
复苏后直接扩增使用第三代细胞作为饲养层。
3.3 染色结果的意义
虽然倒置显微镜可清晰看到细胞轮廓,比较适合动态观察细胞的生长增殖情况。
但毕竟不能染色。
通过HE和免疫细胞化学染色观察了REF的特点。
根据文献报道[8],选定抗Vimentin抗体、抗Fibronection抗体、抗CK18-细胞角蛋白
18(Cytokeratin 18)抗体作为一抗。
一方面鉴定分离培养的细胞的来源,另一方面对其合成的基质功能进行鉴定。
Vimentin作为间叶组织来源组织的标记物,可以作为滋养层细胞特异性分子标志。
图5免疫反应阳性反应部位呈棕黄色,位于胞质,细胞核呈淡蓝色。
说明细胞来自于间叶组织。
上皮细胞是分离滋养层细胞时较容易混杂的一种细胞。
文献报道,细胞角蛋白18在上皮细胞中表达阳性,在滋养层细胞中表达阴性,可以作为鉴定滋养层细胞纯度的特异性分子标志。
通过检测,由图8可以看出,在10倍镜下,CK18免疫组化染色没有观察到任何阳性反应产物,说明分离得到的滋养层细胞纯度较高,无上皮细胞混杂其中。
结合CK18免疫反应阴性结果说明该细胞并非上皮源性的细胞。
而其他细胞成分传代之后逐渐消失。
图6、7显示的层粘连蛋白和纤维粘连蛋白免疫阳性产物定位于胞质。
证明REF可合成细胞外基质层粘连蛋白和纤维粘连蛋白。
可见我们分离的P3代REF,纯度高,活性好,可用于饲养层制备。
【相关文献】
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