ＭＩＴＦ基因在Ｂ１６－Ｆ１０细胞中的表达分析

试验研究ＬＩＶＥＳＴＯＣＫＡＮＤＰＯＵＬＴＲＹＩＮＤＵＳＴＲＹＮｏ．５，２０２３
基金项目：重庆市自然科学基金面上项目（ｃｓｔｃ２０１９ｊｃｙｊ－ｍｓｘｍＸ００６３）；重庆市科研机构绩效引导专项（２１５２９）；重庆
市技术创新与应用发展专项重点项目（
２２２１２Ｆ）ＭＩＴＦ基因在Ｂ１６－Ｆ１０细胞中的表达分析
赵金红１，２，孙晓燕１，３，蒋　婧１
，３通信作者１．重庆市畜牧科学院，重庆４０２４６０２．重庆市草业工程技术研究中心，重庆４０２４６０３．重庆市山羊工程技术研究中心，重庆４０２４６０
摘　要　实验研究Ｂ１６－Ｆ１０细胞增殖、分化过程中ＭＩＴＦ基因的表达情况，探究小眼畸形相关转录因子（ＭＩＴＦ）对黑色素细胞增殖、分化的影响。

结果显示：在增殖阶段前期，Ｂ１６－Ｆ１０细胞快速生长，ＭＩＴＦ基因相对表达量也快速增加，在３ｄ、５ｄ、７ｄ的表达量极显著高于１ｄ（Ｐ＜０．０１）；在分化阶段，Ｂ１６－Ｆ１０细胞的数量越来越少，黑色素分泌越来越多，ＭＩＴＦ基因相对表达量先下降后上升，５ｄ时极显著低于１ｄ和３ｄ（Ｐ＜０．０１），显著低于７ｄ（Ｐ＜０．０５）。

推测Ｍ
ＩＴＦ基因高表达对黑色素细胞的增殖和分化均有促进作用。

关键词　ＭＩＴＦ基因；Ｂ１６－Ｆ１０细胞；表达ｄｏｉ：１０．１９５６７／ｊ．ｃｎｋｉ．１００８－０４１４．２０２３．０５．００２
　引言
动物的毛色和肤色变异主要受黑色素细胞的增殖、分化、迁移，以及黑色素的合成与运输等生物过程
调控［
１］。

黑色素的合成是一个由酶催化的复杂过程［
２］，由多个基因位点编码产物共同调控。

黑色素细胞的增殖分化亦受多种相关基因表达和酶活性的
影响，它们形成了１个复杂的调控网络［
３］。

小眼畸形相关转录因子（
ＭＩＴＦ）是神经嵴细胞定向分化发育成黑色素细胞过程中出现的最早标记基因之一，对黑色素细胞的存活、迁移、增殖和分化起着重要的作
用［４］。

此外，ＭＩＴＦ处于黑色素合成调控网络中心位
置，一方面同时受上游ｃＡＭＰ、Ｗｎｔ、Ｋｉｔ信号通路的调控，另一方面调控下游酪氨酸基因家族（ＴＹＲ、ＴＹＲＰ１、ＤＣＴ）基因的表达，进而影响黑色素的生
成［５］。

本研究分析ＭＩＴＦ基因在黑色素细胞（Ｂ１６－
Ｆ１０）增殖和分化过程中的表达规律，探寻其是否参与了黑色素细胞行为学的调控，为ＭＩＴＦ基因在皮肤色素沉积方面的分子机制提供理论依据。

材料与方法１．１　主要材料与试剂
实验使用的主要试剂与材料如表１所示。

表１　主要试剂与材料
试剂／材料
名称来源
黑色素瘤细胞
Ｂ１６－Ｆ１０
生科院上海细胞库培养基增殖培养基ＲＰＭＩ１６４０、分化培养基ＤＭＥＭ、胎牛血清、马血清
Ｇｉｂｃｏ公司（美国）ＲＮＡ抽提试剂ＴＲＩｚｏｌＲｅａｇｅｎｔ
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司（美国）第一链合成与荧光定量试剂盒
ＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｒＦｉｒｓｔＳｔｒａｎｄｃＤＮＡＳｙｎｔｈｅｓｉｓ、ＦａｓｔＳｔａｒｔＵｎｉｖｅｒｓａｌＳＹＢＲＧｒｅｅｎＭａｓｔｅｒ（ＲＯＸ）
Ｒｏｃｈｅ公司（瑞士）其他试剂０．２５％胰蛋白酶、青链霉素双抗、ＰＢＳ缓冲液
ＨｙＣｌｏｎｅ公司（美国）主要耗材
细胞培养皿、６孔板、离心管
Ｃｏｒｎｉｎｇ公司（美国）
１．２　Ｂ１６－Ｆ１０细胞培养
细胞培养的步骤如下：在３７℃水浴中复苏Ｂ１６－Ｆ１０细胞，离心３ｍｉｎ去除细胞冻存液，用ＲＰＭＩ１６４０培养基重悬细胞，放入１０ｃｍ培养皿中，置于培
养箱中培养（５％ＣＯ２，３７℃条件）；观察细胞，待融合度达到９
０％左右时除去培养液，加入０．２５％胰蛋白酶进行消化，１０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ；弃上清液，
用完全培养基Ｒ
ＰＭＩ１６４０重悬后，按照１．０×１０５
个／ｍＬ的密度接种于１０个６孔板中，每板重复３次。

其中５个六孔板置培养箱中继续培养（５％ＣＯ２，３７℃条件），每２ｄ更换１次培养基，在接种后的６ｈ、２４ｈ、
６
２０２３年第５期（总第４０８期）畜禽业
试验研究
７２ｈ、１２０ｈ、１６８ｈ观察细胞生长状态并拍照记录，并
在对应的各个时间收集细胞，用于提取总ＲＮＡ备用；另外５个六孔培养板，
当其融合度达到８０％左右时除去培养基，用含２％马血清的ＤＭＥＭ培养基诱导分化，每２ｄ更换１次培养基，分别在分化的６ｈ、２４ｈ、７２ｈ、１２０ｈ、１６８ｈ观察细胞生长状态，分别收集对应时间点的细胞，用于提取总ＲＮＡ。

１．３　荧光定量ＰＣＲ与结果分析
用ＴＲＩｚｏｌＲｅａｇｅｎｔ提取Ｂ１６－Ｆ１０细胞的总
ＲＮＡ，用ＮａｎｏＤｒｏｐ２０００分光光度计检测总ＲＮＡ浓度和质量。

按照反转录试剂盒说明书合成ｃＤＮＡ。

所用引物信息见表２
，以β－ａｃｔｉｎ为内参基因，采用ＡＢＩｓｔｅｐｏｎｅ实时荧光定量ＰＣＲ仪，按照ＦａｓｔＳｔａｒｔＵｎｉｖｅｒ ｓａｌＳＹＢＲＧｒｅｅｎＭａｓｔｅｒ（ＲＯＸ）试剂盒说明书中的体系与条件进行操作。

结果使用Ｓ
ＰＳＳ１８．０进行单因素方差分析，结果以“平均值±标准误”表示。

表２　引物序列信息
基因名称引物序列
序列号预期扩增片段长度／ｂｐ
β－ａｃｔｉｎＦ５′－ＣＣＴＧＣＧＧＣＡＴＴＣＡＣＧＡＡＡＣＴＡＣ－３′
Ｒ５′－ＡＣＡＧＣＡＣＣＧＴＧＴＴＧＧＣＧＴＡＧＡＧ－３′ＨＭ＿７６８３０９．１８７ＭＩＴＦ
Ｆ５′－ＴＧＧＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＴＴＣＡＡＣＡ－３′Ｒ５′－ＣＣＡＡＣＡＧＧＡＧＡＡＡＧＧＧＴＡＴＣ－３′
ＸＭ＿０１８０６７１５７．１
１２３
　结果与分析
２．１　ＭＩＴＦ基因在Ｂ１６－Ｆ１０增殖阶段的动态表达
为了探究ＭＩＴＦ基因是否参与了对黑色素细胞行为的调控，本研究检测了它们在Ｂ１６－Ｆ１０增殖期过程中（１ｄ、３ｄ、５ｄ、７ｄ）的表达量。

如图１所示，Ｂ１６－Ｆ１０细胞增殖培养１ｄ和３ｄ时，细胞结构清晰，随着培养时间的延长，细胞数量不断增加，结构越来越模糊，到７ｄ时，细胞已完全铺满整个六孔板，无
法辨清单个细胞。

图１　Ｂ１６－Ｆ１０细胞不同时间的增殖培养结果
（标尺＝２００μｍ）
表达量检测结果发现，ＭＩＴＦ基因相对表达量在Ｂ１６－Ｆ１０细胞增殖阶段前期快速增加，随后进入一个稳定状态，在３ｄ、５ｄ、７ｄ的表达量极显著高于１ｄ（Ｐ＜０．０１），在７ｄ的相对表达量显著低于３ｄ和５ｄ（Ｐ＜０．０５），如图２
所示。

图２　Ｂ１６－Ｆ１０细胞增殖阶段ＭＩＴＦ基因的
ｍＲＮＡ相对表达量
２．２　ＭＩＴＦ基因在Ｂ１６－Ｆ１０分化阶段的动态表达
进一步分析ＭＩＴＦ等基因在Ｂ１６－Ｆ１０分化过程中（１ｄ、３ｄ、５ｄ、７ｄ）的表达规律，Ｂ１６－Ｆ１０细胞随着分化培养时间的延长，细胞数量越来越少，细胞突触增多、变长、相互交联，细胞核周围出现越来越多黑素体，黑色素分泌增多（见图３）。

ｍＲＮＡ相对表达量
结果显示，ＭＩＴＦ基因相对表达量先下降后上升，在５ｄ的相对表达量最低，极显著低于１ｄ和３ｄ（Ｐ＜０ ０１），显著低于７ｄ（Ｐ＜０．０５），如图４所示。

７
试验研究ＬＩＶＥＳＴＯＣＫＡＮＤＰＯＵＬＴＲＹＩＮＤＵＳＴＲＹＮｏ．５，２０２
３
图３　Ｂ１６－Ｆ１０细胞不同时间分化培养结果
（标尺＝２００μｍ
）
图４　Ｂ１６－Ｆ１０细胞分化阶段ＭＩＴＦ基因的
ｍＲＮＡ相对表达量
　讨论与分析
动物皮肤中黑色素沉积情况影响着动物的毛色和肤色，黑色素的生物合成受多个信号通路的调控，并且不同的通路之间可发生交叉作用，体现了黑色素
生成调控网络的复杂性［３］
，ＭＩＴＦ基因是该网络的枢
纽因子，在上游同时受ｃＡＭＰ、Ｗｎｔ、Ｋｉｔ３条信号通路和ＴＮＦ－α、ＰＡＸ３、ＳＯＸ１０、ＢＲＮ－２等基因的调控，在下游则通过调控起关键限速作用的酪氨酸酶，来影响黑色素的生物合成［５］。

干扰Ｂ１６－Ｆ１０细胞中ＭＩＴＦ
基因表达
［６－７］
或转染ＭＩＴＦ优势负性突变［８］
能够抑
制色素合成有关基因ＴＹＲ、ＴＹＲＰ１的表达量和活性，在绵羊黑素细胞中过表达ＭＩＴＦ基因能增加ＴＹＲ、ＴＹＲＰ１和ＤＣＴ的表达量
［９］。

大量研究表明［４，１０－１１］
，ＭＩＴＦ基因能直接调控黑
色素细胞生存、增殖周期、分化过程相关的基因，从而参与这些生物过程。

在葡萄膜黑色素瘤细胞中下调ＭＩＴＦ的表达水平可以抑制瘤细胞的增殖，促使细胞发生凋亡，说明ＭＩＴＦ在葡萄膜黑色素瘤细胞的增殖
过程中发挥重要作用［
１２］。

本研究发现，ＭＩＴＦ基因在Ｂ１６－Ｆ１０细胞增殖前期的ｍＲＮＡ相对表达量快速上升，随后进入一个稳定状态，最后略有降低，这一结果与项目组前期研究ＤＣＴ基因在Ｂ１６－Ｆ１０细胞增殖
过程中的表达趋势一致［１３］。

该基因在小鼠皮肤黑色
素瘤细胞快速增殖时期高表达，而当细胞增殖速度慢下来后，它的相对表达量也趋于稳定，表明ＭＩＴＦ基因高表达与黑色素瘤细胞的快速增殖有一定的正向关系。

在黑色素瘤细胞分化过程中干扰ＭＩＴＦ基因
表达能抑制黑色素的合成与分泌，说明Ｍ
ＩＴＦ基因对黑色素瘤细胞的分化功能造成直接的影响［
６］。

本研究发现ＭＩＴＦ基因相对表达量在Ｂ１６－Ｆ１０细胞分化前期呈下降趋势，可能跟Ｂ１６－Ｆ１０细胞分化前期，细胞数量急剧下降有关，但在后期又显著上升，可能是由于分化后期，细胞内、外黑色素大量分泌导致的。

这一结果再次说明，
ＭＩＴＦ基因高表达对黑色素细胞的增殖和分化均有促进作用。

结论
ＭＩＴＦ基因的高表达对黑色素合成的限速酶活性有促进作用，同时促进黑色素的合成与分泌，从而促
进动物皮肤黑色素的沉积，进而调控动物的毛色和肤色表型。

ＭＩＴＦ基因对黑色素瘤细胞的增殖和分化均有一定的促进作用。

这些结果为ＭＩＴＦ基因在皮肤色素沉积分子机制研究方面提供了理论依据。

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作者简介：
赵金红（１９７９—），女，内蒙古赤峰人，硕士，副研究员，研究方向：细胞与分子生物学。

蒋婧（１９８６—），女，重庆大足人，硕士，副研究员，研究方向：动物遗传繁育。

（上接第５页）
［８］　ＫＩＴＣＨＩＮＧＲ，ＢＨＡＴＰ，ＢＬＡＣＫＤ．Ｔｈｅｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆａｆｒｉｃａｎｓｔｒａｉｎｓｏｆｃａｐｒｉｐｏｘｖｉｒｕｓ［Ｊ］．Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙａｎｄ
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ｇｙｆｏｒｒａｐｉｄ，ｌｏｗ－ｒｅｓｏｕｒｃｅｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ［Ｊ］．Ｅｘｐｅｒｔｒｅｖｉｅｗ
ｏｆｍｏｌｅｃｕｌａｒｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，２０１５，１５（１１）：１４７５－１４８９．［１１］ＹＡＮＧＹ，ＱＩＮＸＤ，ＷＡＮＧＧＸ，ｅｔａｌ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆａｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｂｅ ｂａｓｅｄｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅａｍｐｌｉｆｉ
ｃａｔｉｏｎａｓｓａｙｆｏｒｒａｐｉｄｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＯｒｆｖｉｒｕｓ［Ｊ］．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ
ｊｏｕｒｎａｌ，２０１５，１２（１）：２０６．
［１２］ＹＡＮＧＹ，ＱＩＮＸＤ，ＷＡＮＧＧＸ，ｅｔａｌ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆａｎｉｓｏｔｈｅｒｍｏａｌａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｂａｓｅｄａｓｓａｙｆｏｒｒａｐｉｄｖｉｓｕａｌ
ｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆａｎＯｒｆｖｉｒｕｓ［Ｊ］．Ｖｉｒｏｌｏｇｙｊｏｕｒｎａｌ，２０１６，１３
（１）：４６．
［１３］ＹＡＮＧＹ，ＱＩＮＸＤ，ＺＨＡＮＧＷ，ｅｔａｌ．Ｒａｐｉｄａｎｄｓｐｅｃｉｆｉｃｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｐｏｒｃｉｎｅｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｂｙｉｓｏｔｈｅｒｍａｌｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ
ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎａｓｓａｙｓ［Ｊ］．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒａｎｄｃｅｌｌｕ
ｌａｒｐｒｏｂｅｓ，２０１６，３０（５）：３００－３０５．
［１４］ＹＡＮＧＹ，ＱＩＮＸＤ，ＺＨＡＮＧＸＬ，ｅｔａｌ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｒｅａｌ ｔｉｍｅａｎｄｌａｔｅｒａｌｆｌｏｗｄｉｐｓｔｉｃｋｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅｐｏｌｙｍｅｒ
ａｓｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎａｓｓａｙｓｆｏｒｒａｐｉｄｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｇｏａｔｐｏｘｖｉ
ｒｕｓａｎｄｓｈｅｅｐｐｏｘｖｉｒｕｓ［Ｊ］．Ｖｉｒｏｌｏｇｙｊｏｕｒｎａｌ，２０１７，１４
（１）：１３１．
［１５］ＹＡＮＧＹ，ＱＩＮＸＤ，ＳＵＮＹＪ，ｅｔａｌ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｉｓｏ ｔｈｅｒｍａｌｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎａｓｓａｙｆｏｒ
ｒａｐｉｄｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｐｏｒｃｉｎｅｃｉｒｃｏｖｉｒｕｓｔｙｐｅ２［Ｊ］．ＢｉｏＭｅｄ
ｒｅｓｅａｒｃｈｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，２０１７：８４０３６４２．
［１６］ＹＡＮＧＹ，ＱＩＮＸＤ，ＺＨＡＮＧＷ，ｅｔａｌ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆａｎｉｓｏｔｈｅｒｍａｌｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎａｓｓａｙ
ｆｏｒｒａｐｉｄｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓｖｉｒｕｓ［Ｊ］．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
ａｎｄｃｅｌｌｕｌａｒｐｒｏｂｅｓ，２０１７（３３）：３２－３５．
作者简介：
谭小雨（１９９６—），女，四川自贡人，硕士研究生，研究方向：动物疫病感染与免疫。

张志东（１９６２—），男，云南保山人，博士，教授，研究方向：动物疫病感染与免疫。

９。