牛Myf5基因克隆及蛋白质生物学特性分析

牛Myf5基因克隆及蛋白质生物学特性分析
杜连群;张燕欣;聂永伟;任汉林
【摘要】本试验旨在扩增牛My f5基因,并对其蛋白质生物学特性进行分析.根据GenBank中已公布的牛Myf5基因序列设计1对引物,利用RT-PCR方法从牛背腰最长肌组织扩增牛Myf5基因,连接PUCm T载体,进行酶切和测序鉴定,同时利用在线工具对牛Myf5蛋白的基本性质、二级结构和磷酸化位点进行预测.获得的牛My f5基因编码区序列长度为768 bp,编码255个氨基酸.蛋白质生物学特性分析结果表明,Myf5具有该家族基因典型的碱性螺旋环螺旋结构域,氨基酸组成上丝氨酸(Ser)含量最高,其磷酸化位点分别位于丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)和酪氨酸(Tyr)残
基上.%The aim of this paper was to amplify bovine Myf5 gene, and analyzed the protein biological characteristics. A pair of primers were designed according to bovine Myf5 gene sequences published in GenBank. Myf5 gene was amplified by RT-PCR from bovine back waist longest muscle, then linked to PUCm-T vector, restriction digested and sequenced. At the same time, we predicted the basic properties, the secondary structure and phosphorylated sites of Myf5 protein by the online tools. Having amplified coding areas sequence was 768 bp in length, encoded 255 amino acids. Protein biological characteristics analysis showed that Myf5 had the family genes typical basic helix-loop-helix domain. Serine(Ser) content was the highest in amino acid composition, and the phosphorylation site located in serine(Ser), threonine(Thr) and tyrosine(Tyr) residue.
【期刊名称】《中国畜牧兽医》
【年(卷),期】2013(040)003
【总页数】4页(P50-53)
【关键词】Myf5基因;克隆;蛋白质结构;磷酸化位点
【作者】杜连群;张燕欣;聂永伟;任汉林
【作者单位】军事医学科学院卫生学环境医学研究所,天津300050
【正文语种】中文
【中图分类】Q78
Myf5基因是肌肉调节因子（MRFs）基因家族的一员，与肌纤维的数量和大小均
有关系，对畜禽的产肉力、肉质及风味的改善具有十分重要的作用。

MRFs基因家族又叫生肌决定因子（MyoD）基因家族，基本功能是促进成肌细胞的增殖和分化，该家族编码4种肌肉特异性转录因子，分别是MyoD、MyoG、Myf5和Myf6，
它们是控制骨骼肌生成的关键调节因子，共同控制肌肉的生成（杨明娟等，2010；Akihito等，2010；韦宏伟等，2011）。

而 Myf5是在胚胎发育时肌细胞中最早
被诱导表达的因子（Hasty等，1993），且和MyoD共同决定着肌卫星细胞是否能启动成为具有成肌特性的肌肉干细胞（钟茂春等，2010）。

自从1987年
Devis首次发现并获得MyoD基因cDNA以来，对生肌调节因子的研究越来越受
到人们的重视，迄今已成功克隆获得包括人、鼠、猪、牛、斑马鱼等多种脊椎动物在内的MyoD基因。

目前，国外对MyoD所做的研究多集中在结构、组织表达和功能关系上，而国内多见于羊、猪MyoG和MyoD基因多态性的研究（朱砺等，
2005），而对于牛Myf5基因的研究报道并不多（陈玉红等，2007）。

本研究对西门塔尔牛Myf5基因进行了扩增、TA克隆和序列测定，并采用生物信息学方法对该基因氨基酸序列、蛋白质结构和磷酸化位点进行了分析，以期为该基因肌肉发育调控机理及肉质改良研究奠定基础。

1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 试验动物试验动物西门塔尔牛1头，屠宰后立即采背腰最长肌组织置于液氮中备用。

1．1．2 主要试剂 DNA Marker购于Fermantas公司；PUCm－T快速连接试剂盒、Trizol试剂购于上海生工生物工程技术有限公司；DNA胶回收试剂盒、DEPC 购于天津鼎国生物有限公司；RNA酶抑制剂（RNasin）、鼠源反转录酶M－MLV购于大连宝生物工程（TaKaRa）有限公司；2×Taq Master DNA聚合酶购于康为世纪；其他常规试剂均为国产分析纯。

1．2 方法
1．2．1 肌肉总RNA的提取按照传统提取RNA的方法提取牛背腰最长肌的总RNA，用1．2%琼脂糖电泳检测提取的RNA。

1．2．2 引物设计引物设计参照GenBank中牛Myf5基因序列（GenBank登录号：BC146221），用Primer 5．0设计软件设计引物。

引物序列为：上游引物：5′－CCAGGCTCCGGTTTCTCCCCT－3′；下游引物：5′－GCTTTGGGGTTTTTGGTACCTCCTT－3′。

引物由北京六合华大基因科技股份有限公司合成，去离子水溶解，－20℃保存备用。

1．2．3 PCR扩增按照以下反应体系对上述所得RNA进行反转录，反转录体系总体积20μL：总RNA 5μL，引物1μL，DEPC水7．8μL混匀，65℃水浴
10min，随后冰浴2min。

再依次加入M－MLV Buffer（5×）4μL、Rnasin
（40U／μL）0．5μL、dNTP各0．3μL、M－MLV（50U／μL）0．5μL混匀，25℃温育10min，42℃合成1h，最后95℃5min灭活反转录酶。

PCR扩增体系50μL：2×ES Taq Master Mix 25μL，10pmol／L上、下游引物各2μL，DNA模板1μL，灭菌超纯水20μL。

PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环；72℃延伸10min，4℃保存。

产物用1．2%琼脂糖凝胶电泳，按胶回试剂盒说明书进行切胶纯化。

1．2．4 牛Myf5cDNA克隆与测序将PUCm－T与回收产物进行16℃过夜连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂平板，挑取单个菌落，接种到含100mg／L Amp＋的LB液体培养基，37℃过夜，用菌落PCR方法鉴定阳性克隆，制备重组
质粒DNA，最后用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切重组质粒DNA，酶切鉴定结果说明
重组质粒中有插入片段，可以用来进行测序分析。

1．2．5 蛋白质结构分析
1．2．5．1 牛Myf5基因编码蛋白质的基本性质分析利用 ExPaSy （http：／／us．expasy．org／tools／）软件包（焦传珍，2009）中的ProtParam Computer pI／MW和ProtScale软件对牛Myf5基因编码的蛋白质进行氨基酸
组成、分子质量、等电点及疏水性分析。

1．2．5．2 牛Myf5基因编码蛋白质的结构分析利用 ExPaSy TMHMM（http：／／www．cbs．dtu．dk／servi－Ces／TMHMM－2．0）工具和 ExPaSy 的SOPMA（http：／／npsapbil．ibcp．fr／cgi－bin／secpred＿sopma．pl）
工具预测牛Myf5基因编码蛋白质的二级结构。

1．2．5．3 牛Myf5基因磷酸化位点的预测利用在线工具 Scansitee（http：／／scansite．mit．edu／）和Netphos 2．0（http：／／www．cbs．dtu．dk ／services／NetPhos／），分析牛Myf5基因编码蛋白质的功能结构域及磷酸化位点。

2 结果与分析
2．1 RNA提取结果牛背腰最长肌组织RNA，经1．2%琼脂糖电泳检测，观察到28S、18S和5S3条带，其中28S和18S条带清晰，说明RNA样品完整（图1）。

2．2 牛Myf5基因的克隆牛总RNA经反转录，用上述引物以cDNA为模板进行扩增，获得约为946bp的特异条带，与预期结果一致，说明扩增特异性好且没有基因组污染。

将所获得的PCR产物经琼脂糖凝胶电泳回收后连接到PUCm－T载体上，筛选阳性克隆，用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切重组质粒，获得PUCm－T条带和Myf5CDS条带（图2）。

图1 牛背腰最长肌组织RNA电泳图
图2 PCR扩增和质粒酶切电泳图注：M，DL2000DNA Marker；1，反转录获得的cDNA；2，基因组DNA；3，阴性对照；4，酶切PUCm－T空载体；5，双酶切重组质粒获得PUCm－T条带和Myf5CDS条带。

2．3 序列分析及蛋白质结构的分析
2．3．1 牛Myf5基因的基本结构和编码蛋白质的基本性质经ExPASy软件在线分析，牛Myf5基因的开放阅读框长768bp，编码255个氨基酸。

利用ExPaSy 软件包中的ProtParam Computer pI／MW工具对牛Myf5基因编码的蛋白质进行氨基酸组成、分子质量、等电点的分析，结果见表1。

由表1可知，牛Myf5基因编码蛋白质的氨基酸总数为255个，分子式为C1207H1898N350o397S18，原子总数为3870，分子质量为28241．5u，理论等电点为5．71，在氨基酸组成上含34个Ser，含量最高，占13．3%，不含有Pyl和Sec。

2．3．2 牛Myf5基因编码蛋白质的结构利用ExPaSy的TMHMM工具预测牛Myf5蛋白的跨膜区，结果显示，全部蛋白质均位于膜外区域，即此蛋白不是膜蛋白。

此外，本研究利用ExPaSy的SOPMA工具预测该基因编码蛋白质的二级结
构，结果见图3。

由图3可知，参与形成螺旋α螺旋的氨基酸有85个，占33．33%；参与形成β转角的氨基酸有14个，占5．49%；参与形成延伸直链的氨基酸有22个，占8．63%；参与形成无规则卷曲的氨基酸有134个，占52．55%。

表1 牛Myf5基因编码蛋白质的氨基酸组成氨基酸名称数量（个）占比例（%）氨基酸名称数量（个）占比例（%）Ala（A） 17 6．7 Lys（K）11 4．3 Arg （R） 17 6．7 Met（M） 7 2．7 Asn（N） 8 3．1 Phe（F） 7 2．7 Asp（D）18 7．1 Pro（P） 20 7．8 Cys（C） 11 4．3 Ser（S） 34 13．3 Gln（Q） 11 4．3 Thr（T） 14 5．5 Glu（E） 15 5．9 Trp（W） 2 0．8 Gly（G） 12 4．7 Tyr（Y） 8 3．1 His（H） 6 2．4 Val（V） 11 4．3 Ile（I） 8 3．1 Pyl（O）
0 0 Leu（L） 18 7．1 Sec（U）00
图3 牛Myf5基因氨基酸二级结构的预测注：α螺旋用长竖线表示；β转角用中短竖线表示；延伸片段用中长竖线表示；无规卷曲用短竖线表示。

2．3．3 磷酸化位点预测通过Scansitee得到牛Myf5基因具有该家族基因的典
型结构域碱性螺旋－环－螺旋，其中第2－84个氨基酸为Myf5基因的Basic区（碱性氨基酸区），第85－136个氨基酸为Myf5基因的HLH结构（螺旋－环－螺旋结构）。

利用在线工具 Netphos 2．0预测发现，牛Myf5蛋白存在30个磷酸化位点，分别在Ser（23）、Thr（4）和Tyr（3）残基上。

根据分布可见磷酸
化位点多分布于肽链的氨基端和羧基端（图4）。

图4 牛Myf5蛋白质的结构组成和CDS区磷酸化位点的预测注：＊代表磷酸化位点。

3 讨论
生肌因子Myf5是该家族中最早表达的基因，在成肌细胞的特化与增殖过程中发挥关键作用，Myf5基因敲除试验中小鼠轴上肌肉系统发育迟缓并死于肋骨缺陷症，
说明Myf5基因起始调控了轴上肌肉的形成（Brown等，1994；Kassar等，2004）。

已有研究结果表明，缺乏MyoD和Myf5基因的小鼠不能形成肌肉，没有肌肉标志（marker）出现，不产生Myogenin促进的转录过程，而仅有Myf5
基因但缺少MyoD基因的小鼠则只有半量的Myf5和Myogenin RNA表达，这
显示Myf5与MyoD具有同源性，在成肌过程中发挥着重要的作用。

本研究克隆
了西门塔尔牛Myf5基因cDNA的CDS序列，全长为768bp，编码255个氨基酸，有助于进一步了解西门塔尔牛Myf5基因表达与调控的分子机制。

Myf5基因是MRF基因家族的一员，该家族的共同结构特点是具有1个保守的中
央蛋白基序（motif），其蛋白质二级结构都含有80个氨基酸左右，称为碱性螺
旋－环－螺旋（bHLH），bHLH高度保守，本研究扩增的Myf5具有该家族基因典型的碱性螺旋－环－螺旋结构域，其中Basic结构是HLH螺旋结构的延伸，通
过该结构域它们能够与E蛋白形成二聚体，再与肌肉特异性基因如肌球蛋白轻链
和肌酸激酶等基因的上游调控序列E－box结合，从而激活这些基因的表达（孙文浩等，2008；苏艳红等，2007），该区的几个氨基酸是激活肌肉基因转录的关键，用其他bHLH蛋白相应位置的氨基酸取代这些氨基酸，可以灭活 MyoD及其家族的基因转录作用，但不会影响其与DNA结合，而HLH螺旋结构则是与许多其他
因子相互作用的位点，是调控的重要区域（严婷婷等，2011）。

本研究通过在线工具预测Myf5基因编码蛋白质的二级结构和磷酸化位点，可以看出，牛Myf5蛋白的磷酸化位点，分别在丝氨酸（Ser）、苏氨酸（Thr）和酪氨
酸（Tyr）残基上，与真核细胞内蛋白质磷酸化位点主要发生在丝氨酸（Ser）、
苏氨酸（Thr）和酪氨酸（Tyr）残基侧链的羟基上的报道相一致，不同的蛋白激
酶可识别和修饰不同蛋白质的不同位点，为形成磷酸化作出了调控开关（钟茂春等，2010）。

在线分析结果发现该蛋白没有信号肽序列，是由于该基因具有只有在骨
骼肌细胞特异表达的组织特异性，同时该基因的bHLH结构域始于第一氨基酸
（Weinberg等，1996）。

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