QC青霉素87菌种的优化选育

87-40-36 92.09% 87.19% 97.44%
87-44-117 91.38% 86.83% 96.52%
结论：是要因。
验证三：诱变对象不适
-87谱系菌种诱变处理对象一直采用休眠孢子。小组成员以87-44-117菌种的 萌发孢子、不同生长阶段的菌丝、单菌落作为诱变对象，得到的变异率都明显 低于休眠孢子。
验证人：张伟
4918 4326
3
图8
付娟
5
6
7
10
发酵单位代谢折线图
(天)
可见，试验菌种的碳、氮源利用都全程快于对照菌种。所以培养基 中碳、氮源的不足，是造成试验菌种发酵后期单位增长缓慢的直接原因。
结论：是要因。
验证七：样品检测精度不高
实验室现用美国O.I.Analytical公司ALPKEM牌FS-IV型流体分析仪来测量 效价，允许误差范围在±1%之内。用标定好的青霉素溶液（25000u/ml）分 成一百个相同样品进行检测，均值为24862u/ml，标准差为25.6 u/ml,过程能 力指数为1.42，说明过程能力充分，具备表达试验正确结果的能力 。
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
图4 平均值控制图
UCL 平均值 中心值(CL) LCL
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
图5 极差控制图
验证人：王群 康自力
结论：不是要因。
斜面孢子
5-FU
高能电子诱变
分离
分离新菌种
培养
图9 菌种复合处理示意图
含有青霉素的培养基
第二步：通过自然分离培养的方法，结合摇瓶筛选试验， 对复合诱变得到的高产菌株进行优化稳定。
新菌种分离
自然培养
斜面孢子
砂土孢子
图10 菌种纯化过程
实施一：
第一步 复合处理所 得高产菌落形态
第二步 通过自然优化 后的菌落形态
3
试验菌种 对照菌种
5
6
7
图7 残氮量代谢折线图
天
10
由上图可知，试验菌种的氮源利用全程快于对照菌种。
3 0 0 0(0u / m l ) 25000 20000 15000 10000
12623 11670
18897 17406
22508 20511
24708 24640
试验菌种 对照菌种
5000 0
培养基配 方
确定最优的 培养基配方
延长 摇瓶周期
用正交试验的 方法调整培养 基中的碳、氮 源比例，优化 配方。
本岗位 本岗位
张小双 王茹 付娟
2005年7月
康自力 张伟 饶阳宾
2005年7月
九､ 对策实施
实施一：确定适宜的优化育种方法
第一步：以现生产菌种87-44-117为出发菌种，先加入化学诱变因子5-FU，再 通过高能电子照射，然后分离到含有一定青霉素浓度的固体培养基上培养，进行 复合诱变处理。
表8 因素水平表
项目
水平
乳糖 （%）
玉米浆
（%）
硫酸铵 （%）
硫酸亚铁 （%）
1
A1
B1
C1
D1
2
A2
B2
C2
D2
3
A3
B3
C3
D3
1 2 3 4 5 6 7 8 9 k1 k2 k3 极差R
表9 正交试验结果分析表
A
A1 A2 A3 A1 A2 A3 A1 A2 A3 69630 70037 64091 5946
验证人：王群 付应艳
结论：不是要因。
验证二：诱变方法选择不适
我们对04~05年度所做过的诱变育种结果统计分析，-87谱系菌种的选育随着三种 诱变方法使用次数的增加，致死率也随着下降，说明三种诱变方法对-87谱系菌种具 有了一定的饱和效应，造成诱变效果的降低。
表3 致死率统计表
87-21-10
UV致死率
一 ､ 小组概况
小组简介
注册 编号 —— 2005.
7
课题 类型 ——
攻关型
小组 人数 ——
11人
TQM 教育 ——
52h/人
活动 周期 —— 2005.12005.12
活动 次数 ——
13次
出勤 率 ——
98%
小组 成员
表1. 小组成员一览表
序 号
姓名
年龄
职称
组内分工
1 王群
2 康自力 3 付应艳 4 王世雯 5 付娟 6 张伟 7 饶阳宾 8 王茹 9 张小双 10 张 弘 11 祁桂玲
图2. 孢子镜检形态
图3. 菌落形态
调查 结果
青霉素-87菌种的孢子形态杂，弱孢子比例偏多，而且 菌落的放射线纹发散，说明菌种高产基因并没有得到充
分体现.因此要想完成车间的攻关目标，就必须
对青霉素-87菌种进行优化选育。
五 ､ 制定目标
62000 发酵 单位 61000 u/ml
60000
59000
(42cm,1min)
N-m致死率
(1mg/ml,5min)
UV+N-m 复合致死率
95.79% 90.58% 99.94%
验证人：张小双 王世雯
87-26-86 93.81% 89.39% 98.62%
87-32-34 92.83% 87.46% 97.53%
87-35-12 92.74% 87.01% 98.16%
UCL 极差 中心值(CL) LCL
验证五：摇瓶筛选周期不适
-87菌种原有摇瓶筛选实验的周期是6天，我们对87-44-117菌种在5天、6天、 7天、8天的筛选结果进行了比对，发现摇瓶实验中7天的发酵单位同最终筛选结 果的吻合率最高。
表5 吻合率统计表
复筛吻合率 %
5天
38.6%
6天
45.2%
7天
55.4%
8天
38.1%
验证人：王群 付娟
结论：是要因。
验证六：培养基成分不适
小组成员对-87菌种在现有培养基的代谢情况进行了考察。
g/ml
20
15
10
5
0 3
5
6
7
图6 残糖量代谢折线图
10 天
由上图可知，试验菌种的碳源利用全程快于对照菌种。
试验菌种 对照菌种
g/L
1.4 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0
B
B1 B1 B1 B2 B2 B2 B3 B3 B3 66148 68123 69487 3339
C
C3 C1 C2 C2 C3 C1 C1 C2 C3 66868 71435 65455 5980
D
D2 D1 D3 D1 D3 D2 D3 D2 D1 71571 66485 65702 5869
六 ､ 原因分析
为了提高优化选育效率，我们小组成员对影响优化选育的因素进行了 认真的分析和讨论，绘制出因果分析系统图。
出发菌株不纯
优
化
选育效率低
诱变方法选择不适
选
育
诱变对象不适
效
操作误差大
率 低
优化效率低
筛选工艺不适
摇瓶筛选周期不适
培养基成分不适
样品检测精度不高
七 ､ 确定要因
针对系统图的7条末端因素，小组成员逐项进行了验证。
寻找新的 菌种诱变 方法
通过优化育种， 获得稳定高产 菌种。
引入新诱变剂， 进行复合诱变 处理，再对菌 种纯化稳定。
北师大 本岗位
王群 付应艳 王世雯
2005年7月
2 摇瓶筛选 周期不适
设计适宜 的有定向 筛选作用 的摇瓶试 验
选择最佳摇瓶 周期，保证复 筛吻合率达到 50%以上。
3 培养基
改变
成分不适
图11 菌落形态示意图
效果：优化后菌种的高产特性非常明显，菌落形态纹
理细密，呈现螺旋状。
实施一：
图12 孢子形态镜检图
效果：优化后菌种的孢子形态大小整齐，弱孢子比例
明显减少，显示高产特性更加稳定。
实施二：设计具有定向选育功能的摇瓶试验
为了使优化选育后的生产菌种具有代谢快、生长周期长、耐低通气量等优良性 状，决定延长初筛摇瓶发酵周期（从原有的6-7天延长到7-8天）；将原有的摇瓶 装量从50ml/瓶增加到60ml/瓶。
验证人：饶阳宾 付娟
结论：不是要因。
经调查论证，最终确定优化选育效率低的主要原因是：
主要 原因
1、诱变方法选择不适 2、摇瓶筛选周期不适 3、培养基成分不适
八､ 制定对策
针对影响优化选育效率的主要原因，制定了相应的对策。
序 号
要因
对策
表6 对策表
目标
措施
地点 负责人 完成日期
1 诱变方法 选择不适
菌种优化选育是一项周期长、难度大、成功率低的工作 。尽管车间在菌种选育工作投入较多，自2002年以来一直没 有选育出新菌种。
1.菌种通过自发突变和诱发突变，其基因将产生可稳定遗 传的变异。再通过菌种筛选和菌种优化，选育到高单位突变 菌株是可行的。 2.从车间生产实际来看，组织了多次技术攻关。生产菌种优 化选育后，发酵单位同比都有2%以上的提高。 3.小组成员由车间主任、工艺员、种子组组长及技术员 、技 师等组成，专业技术素质高，选种经验丰富，管理到位，责 任心强。
理由一
我车间青霉素的发酵水平与同行业 其他厂家相比还有很大差距。
理由二
车间方针目标：优化选育新菌种 力争产率1:1.6
根据上述理由，本小组确定以青霉素-87菌 种的优化选育为本次活动的课题。
四 ､ 现状调查
调查1．2005年上半年车间月平均发酵单位情况
调查 结果
68000 66000 64000 62000 60000 58000 56000 54000 52000
摇瓶发酵单 位(u/ml)
21320 23622 21206 25667 21853 20603 22643 24562 22282
K=k1+k2 +k3= 203758
由上表正交试验结果可得
1、直观最佳组合A1B2C2D1为配方1 2、通过计算所得的最佳组合A2B3C2D1为配方2 3、各因素间的主次顺序由其极差R可知为C>A>D>B
表4 -87菌种在不同状态下的诱变结果表
变异率
UV,1min,42cm
菌丝
（20小时）
1.98%
验证人：康自力 王世雯
菌丝
（110小时）
2.46%
单菌落
3.25%
萌发孢子 休眠孢子
3.76%
5.02%
结论：不是要因。
验证四：操作误差大
操作人员共进行了4批次、每批30瓶的相同菌株发酵对照实验。以连续６瓶的 发酵单位作为样本经统计计算并分别做平均值-极差控制图，未出现超出控制界限 的点子，也未出现点子排列有非随机的迹象，可认为操作误差处于受控状态。
表7 筛选结果统计
出发菌种
原方案复筛吻合 新方案复筛吻合
率（%）
率（%）
87-40-36
39.6
52.7
87-44-117
41.8
55பைடு நூலகம்4
实验菌种
44.1
63.9
效果：新方案的定向选育效率高，吻合率
达到50%以上。
实施三：优化选育培养基配方
为了寻找合适的培养基配方，我们设计了L9（34）正交试 验，对发酵培养基配方中的碳、氮源进行了调整。
河北省第二十七次QC小组 代表会议交流材料
青霉素-87菌种的优化选育
发表人：王 茹 华北制药股份有限公司 102车间菌种QC小组
2006年6月
概述
2005年，我车间在青霉素-87菌种的生产 中取得了巨大成绩，胜利地完成了股份公司 下达的攻关任务，成本最低降至39元/十亿， 而且在多项技术指标中已经赶超国内同行业 其它厂家。菌种是抗生素生产的基础，其优 劣决定着生产水平的高低，而菌种的优良特 性只有通过不断的优化选育才能稳定在一个 高水平。本课题围绕着优化选育青霉素菌种 展开。
59971 活动前
61170 目标值
目标值确定依据：
《菌种控制程序》 HY/QP 09·01-2000
新菌种标准
华北制药股份 有限公司
在保证产品质量和收 率的前提下，青霉素 生产菌种发酵水平必 须 较 原 菌 种 提 高 2% 以 上，方可鉴定升级为 新菌种。
目 标 可 行 性 分 析
挑战性 可行性
32 工程师
QC组长
44
技师
工作实施整理
48
技师
工作实施
45
技师
工作实施
33
技师
工作实施
34
技师
工作实施
36
技师
工作数据统计
30
中技
工作实施
26
助工
实验数据整理
34
高工
实验进度安排
40 主任高工
工艺指导
二 ､发表对象简介
菌种优化选育工艺流程图
砂土孢子
双碟菌落
斜面孢子
菌种验证
摇瓶培养
摇瓶接种
三 ､ 选题理由
25500 25000 24500 24000
25002 24548 24756 24769
24249
23880
23918
23624
23500
配方2 配方1
23000
22500
实验1
平均单位:59971
平均单位:62959
05-1月
2月
3月
4月
5月
6月
药 哈
星 华
抗 鲁
药 川
图1 .我车间与其他厂家发酵单位对比图
2005年我车间开始使用-87菌种，生产水平稳步提高，16月份平均发酵单位59971u/ml，但与国内其他厂家相比， 还存在不小差距。
调查2．孢子显微镜和菌落形态观察
验证一：出发菌种不纯
我们对04~05年度所用过的出发菌种进行了纯度试验，结果显示所用过的出发菌 种的纯度均高于95%。
表2 菌种纯度试验表
菌种号 纯度
87-21-10
98.3%
87-26-86
98.6%
87-32-34
96.9%
87-35-12
97.8%
87-40-36
97.7%
87-44-117
97.4%