实验二：ERIC-PCR指纹图谱技术

ERIC-PCR简介1 肠杆菌基因间重复共有序列(ERIC)的发现与分布1990年,Sharples等在对Escherichia coli tls基因组中ds的3′末端区进行分析时首次发现了ERIC片段,命名为“基因间重复单位”[IRU (Intergenic Repetitive Unit)]序列。

随后,Hulton等也鉴定出了相同的重复序列,并命名为ERIC(En-terobacterial Repetitive Intergenic Consensus),即肠杆菌基因间保守重复序列。

并且在其他的肠道细菌基因组中也发现了相似的序列。

曹又方等对46个已测序的菌株进行全基因组序列搜索,结果表明ERIC仅主要存在于肠道细菌基因组间,并且含有该序列的细菌基因组中,序列的重复频率差异也很大。

目前尚未在细菌噬菌体和质粒上发现有ERIC序列的存在。

2 ERIC结构特征及功能ERIC序列长约126 bp,定位于基因组中可转录的非编码区域与转录有关的区域内,但与编码序列没有特定的关系,其中包含几个反向重复序列。

在基因组中ERIC 可以完整或部分缺失的状态存在,位于多顺反子操纵子基因间区域,或位于阅读框内上、下游不翻译区域,唯一已知例外是Vibro cholerae基因组中,有一个ERIC序列包含在sul 基因5′末端ERIC的功能目前还不太清楚,只是根据它的结构作了一些猜测。

认为位于基因其茎环结构防止外切核酸酶对基因3′末端的ERIC可能由于形成二级结构后, 3′末端的降解,促进上游基因的表达;ERIC在基因组间的位置和拷贝数具有种属特异性,可能该序列本身就为DNA提供某些结构或功能相关的信息,这些信息从而影响核酸的代谢,或者提供位点用于在类被核酸代谢相关的特定蛋白识别,核中组织染色体;大多数ERIC是可以转录的,在mRNA中的茎环结构可能干扰核糖体与之结合进而影响翻译的进行;ERIC可能通过促进基因的重新排列或者为基因重组提供不稳定位点来影响整个基因组的稳定性。

ERIC-PCR简介
：Versalovic于1996年描述的一种细菌基因组指纹分析方法，即细菌基因组重复序列PCR技术（rep-PCR）是扩增细菌基因组中广泛分布的短重复序列，通过电泳条带比较分析，揭示基因组间的差异。

细菌基因组中广泛分布的短重复序列（repetitivesequence），包括常用的REP （repetitiveExtragenicPalindromic,基因外重复回文系列）、ERIC（肠杆菌基因间重复一致序列）和BOX，它们在菌株、种、属水平上分布有差异及进化过程有相对保守性。

Rep-PCR目前发展迅速并被广泛应用于多种细菌基因分类，此方法操作方便，可以大样本进行。

REP-PCR分辨效果好，可重复性强，比RFLP、生化分型，核糖体分型要好。

REP-PCR目前可自动化分型，并可建立各种细菌REP、ERIC-PCR分型标准数据库。

［7］［8］［9］［10］［11］［12］［13］［14］［15］［16］［17］［18］［19］［20］［21］［22］［23］［24］［25］［26］［27］IWAHANA H ，YOSHI MOTO K ，MIZUSAWA N ，et al ．Multi -ple fluorescence -based PCR -SSCP analysis ［J ］.Biotech -niques ，1994，16（2）：296，300．SOMMER S S ，YAN J ，LI W ，et al ．Candidate gene analyses by scanning or brute force fluorescent sequencing ，a comparison of DOVAM-S with gel-based and capillary-based sequenc -ing ［J ］.Genet Test ，2007，11（3）：235-240．MARUYA E ，SAJI H ，YOKOYAMA S ．PCR-LIS-SSCP （Low ionic strength single -stranded conformation polymorphism ）--a simple method for high-resolution allele typing of HLA-DRB1，-DQB1，and-DPB1［J ］.Genome Res ，1996，6（1）：51-57．BRINKMANN N ，MARTENS R ，TEBBE C C ，et al ．Origin and diversity of metabolically active gut bacteria from labora -tory-bred larvae of Manduca sexta ［J ］.Appl Environ Microbi -ol ，2008，74（23）：7189-7196．SUNNUCKS P ，WILSON A C C ，BEHEREGARAY L B ，et al ．SSCP is not so difficult ：the application and utility of sin -gle-stranded conformation polymorphism in evolutionary bi -ology and molecular ecology ［J ］.Molecular Ecology ，2000，9：1699-1710．李玉梅，姚纪元，吴静，等．PCR-SSCP 技术的研究及应用进展［J ］.生物技术通报，2007（6）：71-74.方美英，姜志华，刘红林，等．应用PCR-SSCPs 、PCR-RFLPs 技术检测猪氟烷基因［J ］.养猪，1997（1）：29．丁家桐，姜勋平，朱猛进，等．母猪FSH β基因对仔猪哺乳期生长影响的研究［J ］.扬州大学学报：自然科学版，1999，2（4）：38-40．李绍华，李爱云，熊远著，等．猪MSTN 基因多态性及其SNPs 的研究［J ］.遗传学报，2002，29（4）：326-331．李婧，杨润清，孟和，等．ESR 与PRLR 基因对民猪产仔数的影响［J ］.黑龙江畜牧兽医，2003（4）：11-17．陈桂芳，谢庄，强巴央宗，等．西藏牦牛、荷斯坦牛三个功能基因部分序列多态性的比较研究［J ］.畜牧兽医学报，2003，34（2）：128-131．王启贵，李宁，邓学梅，等．鸡细胞外脂肪酸结合蛋白基因单核苷酸多态性与腹脂性状的相关研究［J ］.中国科学C 辑：生命科学，2001，31（3）：266-270．王岩，沈锡权，吴祖芳，等．PCR-SSCP 技术在微生物群落多态性分析中的应用进展［J ］.生物技术，2009，19（3）：84-87．任南琪，赵阳国，王爱杰，等．PCR-SSCP 技术分析碱度影响下硫酸盐还原反应器中微生物群落动态［J ］.中国科学C 辑：生命科学，2006，36（1）：51-58．CALLON C ，DELB 魬S C ，DUTHOIT F ，et al ．Application ofSSCP -PCR fingerprinting to profile the yeast community in raw milk Salers cheeses ［J ］.Systematic and Applied Microbi -ology ，2006，29（2）：172-180．OPELT K ，CHOBOT V ，HADACEK F ，et al ．Investigations of the structure and function of bacterial communities associ -ated with Sphagnum mosses ［J ］.Environmental Microbiology ，2007，9（11）：2795-2809．SHINTANI S ，NAKAHARA Y ，MIHARA M ，et al ．Inactivation of the p 14ARF ，p 15INK4B and p 16INK4A genes is a frequent event in human oral squamous cell carcinomas ［J ］.Oral Oncology ，2001，37（6）：498-504．丁建松，曹毅，童建．PCR-SSCP 研究进展［J ］.辐射防护通讯，2004，24（5）：27-31．USHIJIMA T ，HOSOYA Y ，SUZUKI T ，et al ．A rapid methodfor detection of mutations in the lacⅠgene using PCR-single strand conformation polymorphism analysis ：demonstration of its high sensitivity ［J ］.Mutat Res ，1995，334（2）：283-292．李鸿浩，任有蛇，岳文斌．PCR-SSCP 研究进展及其在羊经济性状研究中的应用［J ］.草食家畜，2006（1）：20-22．陈强，陈云贵，王根林．HSP 70基因PCR-SSCP 实验条件的优化［J ］.畜牧与兽医，2008，40（2）：66-67．□ERIC-PCR 的研究进展刘博婷（韶关学院生物科学系，广东韶关512005）摘要：肠道细菌基因间重复序列（enterobacterial repetitive intergenic consensus,ERIC ）是主要存在于肠道细菌的一类基因间重复序列。

文章编号:100021336(2004)0420288202肠杆菌基因间重复共有序列及ERIC 2PCR孙永艳　申　泉　李艳琴(山西大学生物技术研究所、化学生物学与分子工程教育部重点实验室,太原030006)摘要:ERIC 序列是近年来发现的存在于原核生物基因组中一类短的重复序列。

该序列在染色体上的分布和拷贝数具种间特异性,根据序列中心高度保守的44bp 的ERIC 核心序列设计反向引物,可扩增出反映细菌基因组结构特征的谱带。

由于ERIC 2PCR 快速简便,图谱重复性好,并可作为分子标记用于细菌的分类鉴定,所以,该方法已广泛应用到了科研和生产实践中。

关键词:ERIC ;ERIC 核心序列;ERIC 2PCR 中图分类号:Q93收稿日期:2004203217山西省自然科学基金资助项目(N o.20021080)作者简介:孙永艳(1975—),女,硕士生;李艳琴(1960—),女,副教授,硕士生导师,联系作者,E 2mail :yanqin @ 与真核生物相比,原核生物的基因组较简单,一般只有一个环状双链的染色体,大小不超过107bp ,DNA 序列多以单拷贝的形式存在。

近年来的研究表明,原核生物基因组中还存在着一类短重复序列,它们与tRNA 基因、rRNA 基因等多拷贝序列不同,大小不超过200bp ,反向重复,可以转录成RNA ,但不编码蛋白质。

这类短重复序列广泛分布在原核生物特别是细菌的基因组中,一般位于基因之间的区域。

目前,已报道的重复序列有REP 序列、ERIC 序列、Ng 2REP 序列、Dr 2REP 序列、M p 2REP 序列和STRR 序列等。

1.肠杆菌基因间重复共有序列(ERIC)1.1　ERIC 的发现与分布规律 肠杆菌基因间重复共有序列(enterobacterial repetitive intergenic consen 2sus ,ERIC )首先由Sharples 等[1]于1990年在E.coli中发现,命名为“基因间重复单位”(intergenic repeat unit ,IRU )。

=收稿日期>2010206218=基金项目>重庆发酵床零排放养猪关键技术研究与示范(09505);重庆畜牧科学院基本科研项目猪粪便快腐菌剂筛选的研究(09609)=作者简介>杨柳(19762),男,博士,从事兽医微生物研究工作,Em ai:lyangliuldz @163.co m ;付利芝,通讯作者,Em ai:l flzf u liz h i @文章编号:10052376X(2010)0920845203=综 述>ERIC 2PC R 及其指纹图谱技术的研究杨柳,张邑帆,郑华,李大军,杨金龙,杨睿,付利芝(重庆市畜牧科学院,重庆荣昌 402460)=摘要> 肠杆菌基因间重复共有序列(Enterobacterial repe titive i ntergen ic consensus ,ER I C )是主要存在于肠道细菌中的一类基因间重复序列,长度为127bp ,该序列在肠道细菌染色体上的分布和拷贝数有种间的特异性。

根据ER I C 序列建立的ER I C 2PCR 实际上是一种半随机性质的PCR,广泛应用于细菌分型、流行病学调查和分子微生态学研究。

本文简介了ER I C 2PCR 反应的特点及其应用的原理,详细阐述目前广泛应用的ER I C 2PCR 琼脂糖凝胶电泳(PCR 2PCR 2AGE )技术的不足,指出该方法所获电泳图谱中相同位置的D NA 条带可能包括不同的D NA 序列,指纹图谱分析时可能夸大模板DNA 的相似性。

强调ER I C 2PCR 变性梯度凝胶电泳(PCR 2PCR 2D GGE )技术是其应用的一个新方向,所得的指纹图谱能够更加敏感、准确、有效地展示底物序列的差异,其中的DNA 条带不需测序就可直接用于科研和生产实践中。

=关键词> ER IC ;PCR 2PCR 2AGE ;PCR 2PCR 2DG GE ;指纹图谱=中图分类号>R 23 =文献标识码>AER IC 2PCR and its fi n gerp r i n tingY ANG L i u ,Z HA NG Y i 2fan ,Z H E NG H ua ,LI Da 2j u n ,YANG Ji n 2long ,YANG Ru,i FU L i 2z h i(Chongqing Acade my o f Ani m a l S cience ,R on g chang Chongqing 402460,China )=Ab stra ct > Enterobac terial repe titive i ntergen ic consensus ,ER I C,is a k i nd of dispersed repetiti ve D NA sequence found in the geno m e of entero bacter i a .ER IC has 127bp and its d i str i butio n and copy nu m be rs are spec ies 2spec ific in enter 2obacter i a l chro m oso m e .ER I C 2PCR des i gned fro m the sequence of ER I C act ua lly is ha lf rando m PCR,and s u itable for the bacter ial c l assifi catio n ,ep i de m i olo gical i nvesti ga ti on and the structure of an m i c robial co mmun ity .In t h is pape r ,we re 2vie wed ER IC 2PCR feature and its app licati on ,and pointed out that the DN A bands w it h identica l positi ons i n fi nge rprint based o n t he agarose gel e l ectrophoresis (AGE)patte rns of ER I C 2PCR a m plified products can conta i n d iffe rent sequences ,which could possibly exagge ra te t he si m ilarities or d i versities a m o ng sa m ples usi ng d i versity i ndex .H o wever ,the ER I C 2PCR fi ngerpr i nt based on denaturi ng grad ient ge l electrophoresi s gel e lectro phoresis (DGGE)pa tterns can sentitively ,ex 2actl y and e ffecti ve l y sho w the difference of temp l e te D NA ;the DNA bands i n th i s fi ngerpr i nt do not need to be c l oned ,se 2quenced ,and can be directl y used in sc i entifi c resea rch and pro duc i ng prac tice .=K ey w or ds > ER IC ;PCR 2PCR 2AGE ;PCR 2PCR 2DGGE ;F i nge rpri n t肠杆菌基因间重复共有序列(enterobacter i a l repetitive i n 2tergen i c consensus,ER IC)首次由S HARPLES 等[1]于1990年在E.coli 中发现,命名为/基因间重复单位0(i ntergen ic repeat unit ,IRU )。

腹泻患者肠道菌群数量变化及ERIC—PCR指纹图谱分析目的了解粪检有白细胞的腹泻患者与健康者肠道菌群变化及指纹图谱差异。

方法提取解放军第252医院临床门诊30名健康成人和30例腹泻成人的粪便总DNA为模板，分为对照组和腹泻组。

荧光定量法测定肠道内双歧杆菌、乳酸杆菌、大肠埃希菌、肠球菌的菌群数量，ERIC-PCR指纹图谱法检查各组肠道菌群组成多样性差异。

结果两组肠道菌群数量：对照组粪便中双歧杆菌为（8.85±0.57）拷贝/g，乳酸杆菌为（8.36±0.45）拷贝/g；腹泻组粪便中双歧杆菌为（8.28±0.68）拷贝/g，乳酸杆菌为（7.79±0.39）拷贝/g；与对照组比较，腹泻组中该两种细菌数量明显减少（P 0.05）。

腹泻患者肠道菌群ERIC-PCR指纹图谱条带明显减少。

结论腹泻患者的肠道菌群结构发生了改变，菌群数量明显减少。

[Abstract] Objective To analyze the diversity variation and the fingerprints difference of intestinal microflora between diarrhea patients with the fecal leukocytes and health people. Methods 30 cases of normal people and 30 cases of diarrhea patients in No.252 Hospital of PLA were selected，whose total fecal DNA were used as model，were divided into control group and diarrhea group. Intestinal Bifidobacterium，Lactobacillus，Escherichia Coli，Enterococci bacteria number were detected by quantitative fluorescence method，the difference of intestinal flora diversity in the two groups was detected by ERIC-PCR fingerprint method. Results The quantities of intestinal microflora in the control group and diarrhea group：Bifidobacterium spp.[（8.85±0.57）copies/g vs （8.28±0.68）copies/g]；Lactobacillus spp.[（8.36±0.45）copies/g vs （7.79±0.39）copies/g]，there were significant differences （P 0.05）. The bands of ERIC-PCR fingerprints in diarrhea group were obviously declined. Conclusion The constitution of the intestinal microflora is changed in diarrhea patients and the quantity of intestinal flora is significant declined.[Key words] Diarrhea；Fluorescent quantification real-time PCR；ERIC-PCR；Intestinal flora腹泻是一种常见病，引起腹泻的原因有多种，大致可分为感染性腹泻和非感染性腹泻，其中感染型腹泻占比较高。

ERIC-PCR技MLST技对30株耐碳青霉烯类肺炎克菌的基因分型结果观察王方，吴新明，王彦，梁伟连云港市第二人民医院，江苏连云港222000摘要：目的采用肠杆菌基因间重复一致序列PCR(ERIC-PCR)技术与多位点序列分型技术(MLST)技术分析耐碳青霉烯类肺炎克菌菌株的基因分型，为临床用制提供依据。

方法采用VITEK-2细菌分析仪检测30株青霉烯类肺炎克菌菌株对、氨等16种抗菌药的耐药性。

提取30株菌株的基组DNA,制备菌株基因组模板，扩增碳青霉烯酶基因(KPC-2、NDM-1、IMP、VIM、OXA)对扩增阳性产物进行测NCBI网站上Blast比对，确青霉烯酶耐药基因的分型。

ERIC-PCR基因分型法:根据肠细菌基复序列ERIC设计引物，对30株炎克菌基因分型，运用NTSYS软件对ERIC-PCR得到的电泳图进行聚类分析。

MLST基因分型法:扩增肺炎克雷伯菌的7个管家基因(rpoB、gapA、mdh、pgi、phoE、infB和tonB)片段，扩增片段测序后与数据库数据比对得出等位基因谱，从而得到相应的序列型(ST)。

结果30株耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌菌株对氨节西林、氨节西林/舒巴坦、氨曲南、头抱他睫、头抱瞠林、头、亚胺培南、和哌拉西林/他瞠巴坦的耐药率均为100%，阿米卡星和复方新诺明的耐药率为76.6%，其他药物的耐药性介于两者之间。

30株菌均为多重耐药菌，在检测的16种药物中，耐药率介于76.6%~100%。

30株菌株中25株菌KPC-2基因扩增阳性,2株NDM基因扩增阳性,1株KPC-2、NDM-1基因男株未检测到碳青霉烯酶基因。

30株耐碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌株的MLST方法分型为5个ST型，其中ST11(83.3%,25/30)、ST641(6.6%,2/30)、ST76(3.3%, 1/30)、ST392(3.3%,1/30)和ST1322(3.3%,1/30)；ERIC-PCR分型为5个谱型，分别为A型(83.3%,25/30),B 型(6.6%,2/30)、型(3.3%,1/30)、D型(3.3%,1/30)和E型(3.3%,1/30)。