PH1698 SP法兔抗体免疫组化试剂盒实验方法操作手册

三步法（SP系列），实验步骤使用说明：SP9001（兔）适用于兔来源的一抗SP9002（小鼠）适用于小鼠来源的一抗SP9003 （山羊）适用于山羊来源的一抗SP9000 (通用型) 适用于兔，小鼠，大鼠来源的一抗3.0ml- 价格￥230.00 / 6.0ml- 价格￥380.00 / 18ml- 价格￥1080.00试剂盒规格及贮存条件规格：3ml（50片）/6ml(120 片)/18ml(360 片)贮存条件：本试剂盒宜4℃保存，稳定期1 年一﹑试剂盒内容试剂1 封闭用非免疫的驴血清工作液（含10%驴血清）即用型试剂2 生物素化二抗（驴抗兔/鼠/山羊）即用型试剂3 链酶卵白素-碱磷酶轭合物即用型试剂3 过氧化物酶标记链酶卵白素即用型实验步骤简介：1. 细胞爬片：冷丙酮或4%的多聚甲醛固定的细胞爬片，置0.1mol PBS 室温10分钟复水。

2. 修复：滴加复合消化液（0.125胰蛋白酶% +0.1胃蛋白酶%+0.01 EDTA% ）（0.1molPBS 配制）4度30-40分钟0.1mol PBS 洗三次，每次一分钟3. 血清封闭：（试剂1）室温10分钟，倾去。

4. 一抗：37℃1小时或4度过夜5. 0.1mol PBS 洗三次------每次三分钟6. 相应的生物素化二抗（试剂2）37℃30-40分钟7. 0.1mol PBS 洗三次------每次三分钟8. 链酶卵白素-碱磷酶轭合物或过氧化物酶标记链酶卵白素（试剂3）37℃40分钟9，NBT/BCIP或DAB显色，切片经梯度酒精脱水干燥，(二甲苯透明)，中性树胶封固；如果用AEC显色，则切片不能酒精脱水，而直接用水性封片剂。

灏洋生物15:14:49名称：connexin 43产品编号：CM7269价格/规格：0.1ml/20ug技术指标：小鼠抗人，大鼠，小鼠单克隆抗体Ig分类：IgG2a适用组织：冰冻/石蜡阳性部位：细胞浆组织处理：0.1mol枸橼酸缓冲夜-热修复15分钟（95度）产品说明：产地: Cellscience二步法（无生物素PV6000系列），实验步骤使用说明：试剂盒组成试剂A: 3% H2O2试剂B: Polymerized HRP-Anti Mouse或Rabbit IgG 3.0ml/6.0ml/18ml（根据一抗宿主而定）PV6001（兔）适用于兔来源的一抗PV6002（小鼠）适用于小鼠来源的一抗PV6000 (通用型) 适用于兔，小鼠，大鼠来源的一抗3.0ml- 价格￥300.00 / 6.0ml- 价格￥580.00 / 18ml- 价格￥1780.00试剂盒规格及贮存条件规格：3ml（50片）/6ml(120 片)/18ml(360 片)贮存条件：本试剂盒宜4℃保存，稳定期1 年免疫组化染色步骤1. 石蜡切片脱蜡和水化后，用PBS(pH7.4)冲洗三次，每次3分钟（3x3`）。

免疫组化法实验操作步骤以下是免疫组化法的标准实验操作步骤：1.样本准备：a.获取待检样本，例如组织切片或细胞悬液。

b.将样本固定，常用的固定剂包括福尔马林、乙醇和乙酸等。

c.进行脱水和石蜡包埋，以便于后续切片。

2.制备切片：a.用切片机将固定的样本切成薄片，通常为4-6微米。

b.将切片平均分配在载玻片上。

3.制备蜡块：a.将切片放入烘箱中进行去蜡，以去除切片上的石蜡。

b.用乙醇对切片进行脱水然后重新水化。

c.将切片放入热稳定耐热塑料材料中，通常为硝酸纤维素薄膜等。

4.抗原恢复：a.使用高温高压（如压力锅或蒸汽炉）进行抗原恢复，以改善抗体与抗原的结合效率。

b.根据实验需要选择适当的抗原恢复缓冲液，如磷酸盐缓冲液（PBS）、EDTA缓冲液或三氯醋酸缓冲液等。

c.将切片放入抗原恢复缓冲液中进行恢复处理。

5.抗体处理：a. 选择适当的一抗（primary antibody），根据目标蛋白质的性质选择单克隆或多克隆抗体。

b.将一抗稀释至适当浓度，根据抗原的强度调整抗体浓度。

c.将一抗加入样本上共孵育，使抗体与目标蛋白质发生特异性结合。

d.对于一些抗体，可以使用辅助试剂如牛血清蛋白、牛血清、胶原蛋白等增强结合效果。

6.清洗：a.用PBS或其他合适的缓冲液冲洗切片，以去除未结合的一抗。

b.重复冲洗步骤多次，以充分去除未结合的抗体。

7.检测标记：a.选择适当的检测标记，如酶（如辣根过氧化物酶，HRP）、荧光染料或金标记等。

b.将标记物加入到一抗与抗原结合的位置上，以形成可视的标记。

8.染色：a.若使用酶标记物，则使用特定底物进行染色，产生颜色反应。

b.若使用荧光标记物，则观察荧光信号。

9.显微镜观察：a.使用适当的显微镜观察切片，记录和分析结果。

b.对于荧光标记，可以使用特定的荧光染色剂如DAPI进行细胞核染色。

10.结果分析：a.根据实验设计和目的，对结果进行定性或定量分析。

b.可以使用图像分析软件进行影像处理和数据分析。

免疫组化操作步骤
免疫组化是一种常用的实验技术，用于检测和鉴定生物样本中的特定分子。

下面我会给出大致的免疫组化操作步骤，供你参考。

1.样本处理：将生物组织或细胞样本获取并处理成合适的形式，如切片或细胞悬液。

2.预处理：对于组织样本，可以使用甲醛等固定剂或冰冻保存。

对于细胞样本，也可以用1%的乙醇醋酸钠或甲醛冷冻保存。

3.抗原结构暴露：对于组织样本，可以使用抗原恢复液如缓冲盐水或热诱导抗原恢复等来暴露抗原结构。

对于细胞样本，可以用洗涤缓冲液洗涤，以去除细胞外蛋白质，并暴露出内部抗原。

4.阻断非特异性结合：使用非特异性结合物（如牛血清白蛋白、大肠杆菌蛋白等）进行阻断，以减少非特异性的背景信号。

5.抗体结合：加入目标抗体，与待测分子特异结合。

6.洗涤：洗涤掉未与抗体结合的废液，减少背景信号。

7.二抗结合：加入辣根过氧化物酶标记的二抗，与目标抗体结合，形成目标抗体-二抗复合物。

8.再次洗涤：冲洗掉未与二抗结合的废液，减少背景信号。

9.底物添加：加入染色底物，辣根过氧化物酶催化产生可见信号。

10.反应停止：停止底物活性，如加入酸性溶液。

11.显微镜观察：将样本放置在玻璃载玻片上，使用显微镜观察并记录结果。

12.图像分析：使用光学显微镜或荧光显微镜等设备获取图像，使用图像分析软件进行定量分析。

需要注意的是，实际操作中会根据具体的实验目的和技术要求进行适当的修改和调整。

免疫组化在科学研究和临床诊断中都有广泛应用，可以用于检测肿瘤标志物、病原体、免疫相关分子等，对于疾病诊断和治疗具有重要意义。

免疫组化法实验操作步骤步骤一：取材固定1.将需要处理的组织或细胞样本，如切片或离心沉淀等，放置在含有适当浓度的固定试剂（如4%的中性缓冲甲醛）中，使其固定。

2.这一步的目的是保持蛋白质的结构和形态，使其对后续步骤的抗体反应更加稳定。

步骤二：脱水和包埋1.将样本从固定试剂中洗涤，并逐渐转移到乙醇溶液中，以脱水。

2.将样本转移到适当浓度的透明剂（如甲基丙烯酸甲酯）中，使其透明化。

3.最后，将样本包埋在合适的固化剂（如尼龙、蜡、树脂等）中，以便后续的切片操作。

步骤三：切片和烘干1.使用组织切片机将样本以适当的厚度切成切片。

2.将切片放置在加热平台上，烘干以去除切片中的水分。

步骤四：抗体处理1.使用适当的抗体稀释液将抗体与切片接触。

抗体可为一抗或二抗，具体选择取决于实验需求。

2.将切片放置在含有抗体的湿润孵育盒中，使其与抗体反应。

孵育温度和时间取决于抗体的要求，一般在4℃下孵育过夜。

步骤五：洗涤1.将切片取出，并置于洗涤缓冲液中，用于去除未结合的抗体。

2.反复洗涤3-4次，每次至少5分钟，确保切片完全清洗。

步骤六：标记1.添加适当浓度的二抗，如辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗，与已经结合的一抗反应。

2.孵育切片与二抗共反应，孵育温度和时间根据试剂的要求进行。

步骤七：显色和染色1.使用合适的显色剂将切片进行显色。

常见的显色剂有DAB（二氨基联苯氧化物）和VIP（有机磷染料）等。

2.彩色染色可根据实验需求进行，可以使用核染料如伊红、快速伊红等对细胞核进行染色。

步骤八：石蜡去除和封片1.将切片浸入去石蜡溶液中，去除石蜡。

2.使用适当稀释的巴豆胶溶液将切片封闭，确保切片在显微镜下观察时保持湿润。

步骤九：显微镜观察1.将封片放置在显微镜载物台上，使用适当放大倍率的显微镜观察切片。

2.观察切片的染色情况、抗体标记的结果等，记录并进行分析。

这些是一般的免疫组化法实验操作步骤，根据具体实验需求和试剂要求，可能会有一些细微的差异和额外的步骤。

免疫组化操作规程（一）、仪器设备 1）18cm不锈钢高压锅或电炉或医用微波炉；2）水浴锅（二）、试剂1）PBS缓冲液（pH7.2～7.4）：NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na2HPO4 4.3mmol/L，KH2PO4 1.4mmol/L。

2）0.01mol/L柠檬酸盐缓冲液（CB，pH6.0，1000ml）：柠檬酸三钠3g，柠檬酸0.4g。

3）0.5mol/L EDTA缓冲液（pH8.0）：700ml水中溶解186.1gEDTA·2H2O，用10 mmol/L NaOH调至pH8.0,加水至1000ml。

4）1mol/L的TBS缓冲液（pH8.0）：在800ml水中溶解121gTris碱，用1N的HCl调至pH8.0,加水至1000ml。

5）酶消化液：a、0.1%胰蛋白酶液：用0.1%CaCl2(pH7.8) 配制。

b、0.4%胃蛋白酶液：用0.1N的HCl 配制。

6）3%甲醇-H2O2溶液：用30%H2O2和80%甲醇溶液配制。

7）封裱剂：a、甘油和0.5mmol/L碳酸盐缓冲液（pH9.0～9.5）等量混合；b、油和TBS(或PBS)配制。

8）TBS/PBS pH9.0～9.5，适用于荧光显微镜标本；pH7.0～7.4适合于光学显微镜标本。

（三）、操作流程1、脱蜡和水化脱蜡前，应将组织芯片在室温中放置60分钟或60℃恒温箱中烘烤20分钟。

1）组织芯片置于二甲苯中浸泡10分钟，更换二甲苯后再浸泡10分钟；2）无水乙醇中浸泡5分钟； 3）95%乙醇中浸泡5分钟；4）70%乙醇中浸泡5分钟；2、抗原修复用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片。

1）抗原热修复（1）高压热修复在沸水中加入EDTA（pH8.0）或0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）。

盖上不锈钢高压锅的盖子，但不进行锁定。

将玻片置于金属染色架上，缓慢加压，使玻片在缓冲液中浸泡5分钟，然后将盖子锁定，小阀门将会升起来。

免疫组化操作规程及操作流程免疫组化技术是一种常用的细胞和组织学研究方法，广泛应用于病理学、生物学、药理学等领域。

下面将详细介绍免疫组化操作规程及操作流程。

一、实验前准备1.准备实验所需的试剂和试验设备，包括抗体、缓冲液、加标物、显色剂等。

2.检查免疫组化试剂的有效期，确保试剂的质量。

二、标本处理1.收集组织标本，如活检样本或动物组织。

2.快速处理标本，迅速取出，并选择适当的处理方法，如固定、包埋等。

3.处理过程中要避免标本的冻融、干燥等。

三、抗原回复1.对于经过固定的组织标本，使用抗原回复方法来恢复组织标本中的抗原活性。

2.选择适当的抗原回复方法，如热处理、酶解等。

四、非特异性结合阻断1.使用非特异性抗血清或蛋白质来阻断非特异性结合位点。

2.使非特异结合抗体活性降低，减少假阳性结果。

五、抗体处理2.优化抗体浓度，确保抗体与标本中的抗原结合。

3.对于特定抗体，可以进行荧光标记或酶标记等。

六、免疫组织染色1.用适当的缓冲液稀释抗体，并将其应用于组织标本上。

2.根据实验需求选择适当的孵育时间和温度。

3.利用显色剂或荧光显像剂对标本进行染色。

七、显微镜观察与分析1.将染色后的标本放置在显微镜下观察，并选择适当的增强荧光信号方法。

2.结合相关的正对照和负对照进行结果分析，确定一些蛋白质在组织中的表达情况。

3.分析结果并记录数据。

八、结果分析与报告1.根据观察结果，分析样本中目标抗原的表达情况。

2.比较不同样本之间的差异，得出结论并撰写实验报告。

九、实验后处理1.清洗使用过的实验工具和材料，避免交叉污染。

2.妥善处理废弃物和化学品，根据实验室内相应的安全操作规范进行处理。

免疫组化SP 法一．实验原理SP 法是专为免疫组化和其他免疫检测而设计的，用以显示组织和细胞中抗原分布。

链霉亲和素是一种从链霉菌中提取的蛋白质，分子量47000. 同亲和素一样，对生物素分子有极高的亲和力，是一般抗原抗体亲和力的一百万倍。

亲和素是一个碱性蛋白质（IP=10），经改造后可以转变为中性蛋白质。

链霉亲和素等电点接近中性，IP=6.0~6.5 ，对组织和细胞的非特异吸附很低，基于链霉亲和素的免疫组化方法背景很低。

根据研究，SP 大约可形成一百万个左右的过氧化物酶和五十个左右的链霉亲和素所形成的复合物。

大量的酶将保证SP具有很高的敏感性。

SP兼具高敏感性，低背景和操作简便的优点。

三．操作步骤1．载玻片防脱片处理：可选择APES，捞片后置烤箱60℃60min 以使切片紧密粘附。

2．切片常规脱蜡3．30%过氧化氢1 份+蒸馏水10 份混合，室温10min 以灭活内源性酶。

蒸馏水洗 3 次4．热修复抗原：将切片浸入0.01M 构橼酸盐缓冲液（PH6.0），高压3min，之后冷却20min，再用PBS洗。

5．滴加5%BSA封闭液，室温10min，甩去多余液体，不洗6．滴加一抗（1:300 ）4℃过夜。

PBS（PH7.2~7.6）洗2min，共洗三次。

7．滴加生物素化的山羊抗兔IgG（1:100 ），37℃30min。

PBS （PH7.2~7.6 ）洗2min，共洗3 次。

8．滴加试剂辣根酶标记链霉卵白素（1:100 ）PB（S PH7.2~7.6）洗5min，共 4 次。

9．DAB显色：使用DAB显色试剂盒(AR1022)。

取1ml 蒸馏水，加设计盒中A,B,C 试剂各 1 滴，混匀后加至切片。

室温显色，镜下控制反应时间，一般5~30min 之间，蒸馏水洗涤。

10．苏木素轻度复染2min，脱水，透明，封片，显微镜观察。

免疫组化法实验操作步骤免疫组织化学(Immunohistochemistry, IHC)是一种利用抗体与组织中的抗原特异性结合的技术。

它是一种重要的研究方法，可以用于检测和定位组织中的特定蛋白质和其他生化分子。

以下是免疫组织化学实验的一般操作步骤：1.样本处理：a.固定：将待检测的组织样本进行固定处理，以保持其形态结构并保留组织内的抗原。

b.切片：将固定的组织样本切成非常薄的切片（通常为3-5微米厚），并将其放置在载玻片上。

2.抗原解蓝（抗原恢复）：a.对于不同类型的组织样本，选择适当的抗原解蓝方法。

b.抗原解蓝可以通过加热、酶解或其他方法来恢复组织样本中的抗原。

3.阻断非特异性结合：a. 使用一种非特异性的蛋白质来阻断载玻片上未特异性结合的位点，例如牛血清蛋白(Bovine Serum Albumin, BSA)或小鼠免疫球蛋白(Mouse IgG)。

b.加入适当浓度的阻断剂，并孵育片玻片上的切片，以阻断非特异性结合位点。

4.主抗体孵育：a.加入含有特定抗原的主抗体溶液，其可以与组织样本中特定的抗原结合。

b.孵育片玻片上的切片，使主抗体与待检测的抗原结合。

5.洗涤：a.用缓冲液或PBS等洗涤溶液洗涤载玻片上的切片，以去除未结合的主抗体。

6.二抗孵育：b.孵育片玻片上的切片，使辅助抗体与主抗体结合。

7.洗涤：a.再次用缓冲液或PBS洗涤载玻片上的切片，以去除未结合的辅助抗体。

8.信号放大：a.可根据需要，使用染色剂或底物来增强或显色识别待检测抗原的结合位置。

b.例如，使用荧光染料或酶底物，通过显微镜观察或光镜观察，可使抗原可视化。

9.洗涤：a.最后一次用缓冲液或PBS洗涤载玻片上的切片，以去除未结合的染色剂或底物。

10.封片：a.加入适当的封片剂，如富含丙酮的溶液，将载玻片上的切片封装起来，以保护切片和保存染色结果。

免疫组织化学是一种复杂的实验技术，需要仔细的操作和精确的控制条件才能得到准确的结果。

免疫组化操作规程及操作流程免疫组化（immunohistochemistry，简称IHC）是一种利用抗体-抗原反应来检测组织中特定蛋白质表达的方法。

它广泛应用于医学研究和临床诊断中，常用于检测肿瘤标志物、免疫细胞浸润和病毒感染等。

I.免疫组化操作规程1.样本处理a.组织固定：将组织标本进行固定，一般使用10%中性缓冲福尔马林进行固定，固定时间一般为24-48小时。

b.去脂化：对于脂肪较多的组织，需要将其进行去脂处理，可使用二甲苯或其他去脂剂进行处理，处理时间一般为20-30分钟。

2.抗原恢复a.热诱导抗原恢复：将固定的组织样本放入蒸汽气锅中，用缓冲液浸泡标本，加热至高压下，进行抗原恢复处理。

具体温度和时间根据样本类型和抗体要求而定。

b.酶诱导抗原恢复：对于抗原蛋白固定后被交联、无法热诱导恢复的样本，可使用酶解剂（如胰蛋白酶）进行抗原恢复。

3.阻断非特异结合a.使用非特异结合阻断剂：在进行免疫染色之前，需要将非特异结合位点进行阻断，可使用蛋白质阻断剂，如牛血清蛋白（BSA）或鱼凝胶蛋白（FSG）等，在阻断液中孵育样本。

4.抗体反应a.一抗孵育：将目标抗体（一抗）稀释后，滴加于待检样本上，进行孵育，一般时间为1-2小时。

b.二抗孵育：选择免疫印迹试剂盒中对应一抗的二抗，将其稀释后，滴加于待检样本上，进行孵育，一般时间为30-60分钟。

5.染色和显色a.底物酶标：使用底物和酶的复合物，进行染色和显色反应。

常用的底物有DAB（二氨基苯），TMB（3,3',5,5'-四甲基联苯胺）等，反应时间一般为5-10分钟。

b.荧光染色：若使用荧光标记的二抗，需进行相应波长的激发光照射，观察荧光信号。

6.降解和清理a.用超纯水洗涤：使用超纯水进行标本洗涤，彻底清除底物和底物残留物。

b.孵育升级脱位溶液：将样本浸泡在脱位溶液中，使特异结合的抗体与抗原分离。

c.用盖玻片封装：涂上透明胶和玻片，使其固定在盖玻片上，并封住。

免疫组化实验具体步骤及说明免疫组化（Immunohistochemistry，IHC）是一种用于检测组织部分或特定分子的表达、定位和定量的技术。

它基于抗原抗体相互作用的原理，通过特异性的抗体与目标分子结合形成复合物，再通过染色反应显示出目标分子的位置和数量。

IHC广泛应用于癌症诊断、疾病研究和药物开发等领域。

以下是免疫组化实验的具体步骤及说明：1.标本制备：首先，取得切片的组织标本，通常是经过固定和包埋的组织。

然后，将组织切片取下玻片，用去离子水处理。

最后，将切片分别置于乙醇溶液中进行脱水，再用苯酚或其他抗氧化剂处理，以保护切片的蛋白质结构。

2.去蜡：将切片置于细胞清洗液中，用搅拌器在室温下搅拌，去除蜡层。

然后，分别使用乙醇降级脱水和再次用去离子水处理，以去除残留的蜡。

3.抗原检出：使用特定的抗体来检测目标分子。

首先，在切片中添加抗原修复溶液，进行退火和抗原修复，以恢复抗原的免疫原性。

然后，用PBS洗涤切片，去除剩余的抗原修复液，并将切片与蛋白质阻断剂孵育，以防止非特异性结合。

最后，将切片与特异性的初级抗体孵育，以形成抗原-抗体复合物。

4.特异性结合检测：添加特异性的二级抗体，如辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗鼠IgG，与初级抗体特异性结合。

此外，还可以使用荧光标记的二级抗体，以便通过显微镜直接检测目标蛋白质的荧光信号。

完成二级抗体与抗原复合物的结合后，用PBS洗涤切片。

5.信号放大与检测：对于HRP标记的二级抗体，使用辣根过氧化物酶底物，如DAB（二氨基苯类胺）或TMB（3,3',5,5'-四甲基联苯胺）。

这些底物在酶作用下会形成可见的棕色沉积物。

对于荧光标记的二级抗体，在显微镜下直接检测荧光信号。

6.染色和显微镜观察：将切片用PBS洗涤，然后用余晖蓝染色溶液浸泡，以增强显微镜下观察的对比度。

最后，用水轻轻冲洗切片，除去多余的染色剂。

用显微镜观察切片，评估目标蛋白质的表达和定位。

兔抗体免疫组化SP试剂盒（DAB,RABBIT）说明书修订日期：2017.10.12 Cat number：KGSP03-KGSP04Store at2-8℃for12months,避光For Research Use Only(科研专用)一、试剂盒说明适用于免疫组化方法的石蜡包埋、冰冻切片、培养细胞涂片及血液标本。

二、试剂盒组份组份Cat:KGSP03Cat:KGSP04储存温度(60片)(300片)试剂A:10％山羊血清封闭液3mL15mL试剂B:抗兔生物素化二抗3mL15mL2-8℃试剂C:链亲和素标记HRP3mL15mL试剂D:浓缩DAB显色液120μL600μL试剂E:DAB底物缓冲液5mL25mL2-8℃，避光三、试剂盒以外自备仪器和试剂1、二甲苯、乙醇、无水甲醇2、蒸馏水或去离子水3、30％H2O24、10mM PBS,pH7.4或50mM TBS,pH7.85、一抗（兔抗体）6、苏木精染液7、封片胶8、显微镜四、使用注意事项1、检测标本时需同时做阴性对照和阳性对照。

2、DAB是一潜在致癌物，使用时请注意自我防护。

3、DAB显色液需现用现配，避光放置，且在30分钟内染色。

4、用滴瓶加液时，每一滴的体积为50μL。

五、推荐染色步骤：（以石蜡切片为例）1、标本制备石蜡切片用二甲苯常规脱蜡、入水、抗原修复（可根据一抗说明书推荐方法进行操作）。

染色前用PBS浸泡组织或细胞涂片10分钟。

（注意：从此步骤起，严禁标本或组织切片干燥）2、染色1）石蜡切片放入3％H2O2-甲醇液中浸泡10分钟，以消除内源性过氧化氢酶的用。

2）用PBS洗2分钟/次×3次。

3）加一滴试剂A于组织切片上（需完全覆盖待检组织）孵育10分钟。

4）倒掉或吸干液体（不要冲洗）。

5）每张切片加二滴（100μL）或适量一抗（需完全覆盖待检组织），湿盒内孵育30～60钟。

6）用PBS洗2分钟/次×3次。

7）每张切片加一滴试剂B（需完全覆盖待检组织），孵育10分钟。

免疫组化SP法引言免疫组化(SP)法是一种常用的免疫组织化学染色技术，用于检测细胞和组织中蛋白质的表达情况。

相较于传统的免疫组化方法，SP法的敏感性和特异性更高，能够提供更准确的结果。

本文将介绍免疫组化SP法的原理、步骤和应用，并提供一些实验技巧和注意事项。

原理免疫组化SP法结合了辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（AP）的酶标系统。

HRP可以催化有机物质与底物间的氧化还原反应，生成可见光。

而AP则能够催化磷酸酯与底物间的酸碱中和反应，生成二级离子，进而酶促反应。

SP法利用这两个酶的双重酶标效应，使得染色结果更明显，背景噪音更低。

实验步骤免疫组化SP法通常包括以下步骤：1.取得标本：首先需要准备待检测的组织样本或细胞制片。

可以选择固定、冻存或石蜡包埋样本。

2.制备切片：将组织样本切割成适当的厚度，一般为4-5μm。

使用玻璃片或载玻片使切片固定在切片架上。

3.脱脂去蜡：将切片在温水中浸泡片刻，去除石蜡并暴露组织。

4.抗原修复：根据需要，在组织上施加适当的抗原修复方法，以恢复由于石蜡包埋而导致的抗原损失。

5.抗体孵育：将适当的一抗或多抗添加到切片上，使其与目标蛋白结合。

根据需要，可以在抗体孵育前进行非特异性蛋白质封闭，以防止非特异性结合。

6.一抗信号放大：使用HRP标记的二抗与前一步骤结合的抗体结合。

在此步骤中，HRP将抗原邻近的HRP底物转化为可见的颜色。

7.二抗信号放大：使用AP标记的二抗与前一步骤结合的一抗结合。

AP 酶可将AP底物转化为色素，产生二级离子，使染色结果更明显。

8.染色：在适当的时间和温度条件下，在样本上施加适当的染色试剂，使目标蛋白在显微镜下呈现出想要的颜色。

9.倒置显微镜：使用倒置显微镜观察染色结果，根据需要进行图像拍摄记录。

实验技巧在进行免疫组化SP法实验的过程中，有一些技巧可以帮助提高实验效果：1.样本处理：对样本进行适当的抗原修复和封闭，以免出现非特异反应。

2.抗体选择：选择与目标蛋白有高度亲和力的特异性抗体，以提高染色的准确性。

免疫组化标准操作程序
Elivision™plus免疫组化染色原理：Elivision™plus试剂盒将多个抗鼠和抗兔的IgG分子与辣根过氧化物酶聚合，所形成的聚合物直接与一抗结合，从而放大了抗原抗体结合的信号。

一、染色步骤：
1、蜡切片脱蜡和水化后，用PBS（pH7.4）冲洗三次，每次3分钟（3*3分钟）。

2、根据每一种抗体的要求，对组织抗原进行相应的修复。

3、如有必要，每张切片加1滴或50ul3%过氧化氢溶液，室温下孵育10分钟，以阻断内源性过氧化物酶。

PBS冲洗3*3分钟。

4、甩去PBS,每张切片加1滴或50Ul的第一抗体，室温下孵育60分钟或4。

C过夜，具体参阅各种抗体的说明书。

5、PBS冲洗3*3分钟。

6、甩去PBS液,每张切片加1滴或50ul聚合物增强剂（试剂A）,室温下孵育20分钟。

7、PBS冲洗3*3分钟。

8、甩去PBS液，每张切片加1滴或50ul酶标抗鼠/兔聚合物（试剂B）,室温下孵育30分钟。

9、PBS冲洗3*3分钟。

10、甩去PBS液，每张切片加2滴或100ul新鲜配制的DAB或AEC 显色液，显微镜下观察3-10分钟。

11、蒸储水或自来水冲洗，苏木素复染，0.1%盐酸分化，自来水冲洗，PBS冲洗返蓝。

12、如果用DAB显色，则切片经过梯度酒精脱水干燥，（二甲苯透
明）中性树胶封片；如果用AEC显色，则切片不能经酒精脱水,而直接用水性封片剂封片。

二、染色结果：
镜下观察阳性显色为棕色或红色。

免疫组化实验方法
嘿，朋友们！今天咱就来唠唠免疫组化实验方法这档子事儿。

免疫组化实验啊，就像是一场奇妙的探索之旅。

想象一下，你就是个超级侦探，要去解开细胞里的秘密。

首先呢，得准备好样本，这就好比是给侦探准备好案发现场。

样本要处理得妥妥当当，不能有半点马虎。

然后就是关键的抗体啦！这抗体就像是侦探的放大镜，能帮你找出那些隐藏的线索。

得选对合适的抗体哦，不然可就找错方向啦。

接下来就是一系列的操作步骤啦。

孵育呀，冲洗呀，就跟侦探在现场仔细搜寻证据一样。

每一步都得小心翼翼，不能出岔子。

你说这免疫组化实验像不像一场精细的艺术创作？得有耐心，还得有技巧。

在实验过程中，可别小看了那些试剂和条件哦。

温度啦，时间啦，都得把握得恰到好处。

就好像做饭一样，火候不对，那菜的味道可就差远了。

还有啊，操作的时候可得集中注意力，别走神。

万一不小心弄错了一步，那可就前功尽弃啦，那不就白忙活一场了嘛！
做完实验，就等着看结果啦。

这时候就像是侦探终于揭开了谜底，那种期待和兴奋的心情，真是难以言表。

总之呢，免疫组化实验方法可不简单，但只要你认真对待，细心操作，就一定能在这场细胞的神秘世界里找到你想要的答案。

别害怕困难，勇敢地去尝试吧！相信自己，你一定能行！就这么着，大家赶紧去试试吧！。

兔p物质（SP）酶联免疫分析试剂盒使用说明书本试剂盒仅供研究使用。

检测范围：96T20ng/L-400ng/L使用目的：本试剂盒用于测定兔血清、血浆及相关液体样本中p物质（SP）含量。

实验原理本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中兔p物质（SP）水平。

用纯化的兔p物质（SP）抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入p物质（SP），再与HRP 标记的p物质（SP）抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。

TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。

颜色的深浅和样品中的p物质（SP）呈正相关。

用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD 值），通过标准曲线计算样品中兔p物质（SP）浓度。

试剂盒组成标本要求1．标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。

若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融2．不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。

操作步骤1.标准品的稀释：本试剂盒提供原倍标准品一支，用户可按照下列图表在小试管中进行稀2.加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准孔、待测样品孔。

在酶标包被板上标准品准确加样50μl，待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。

加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。

3.温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。

4.配液：将20倍浓缩洗涤液用蒸馏水20倍稀释后备用5.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。

6.加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。

7.温育：操作同3。

8.洗涤：操作同5。

9.显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟.10.终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。

免疫组化实验方法免疫组化步骤：1、取材：取实验组和对照组动物组织尽可能新鲜，PBS洗，取小于0.5cm×0.5cm×0.1cm组织块；2、固定和包埋：用4%多聚甲醛进行固定，经70%乙醇30分钟、80%乙醇30分钟、90%乙醇30分钟两次、95%乙醇30分钟两次、100%乙醇30分钟两次、二甲苯透明15分钟两次、55℃石蜡中1小时三次，用不锈钢模具包埋组织块；3、切片：将厚度5um的组织切片附于经多聚赖氨酸附膜的载玻片上，60℃过夜；4、脱蜡、入水：将切片浸于二甲苯中5分钟两次、100%乙醇5分钟两次、95%乙醇5分钟两次、90%乙醇5分钟两次、85%乙醇5分钟次、70%乙醇5分钟两次，自来水冲洗，PBS洗两次；5、抗原修复:柠檬酸缓冲液，热修复20分钟， PBS洗3次×5分钟；6、3%双氧水,室温10分钟, PBS洗3次×5分钟；7、切片上滴加正常山羊血清封闭液，室温20分钟。

甩去多余液体，不洗；8、切片上滴加第一抗体，4℃过夜，PBS洗3次×5分钟；9、切片上滴加生物素化第二抗体（IgG），37℃20分钟，PBS洗3次×5分钟；10、切片上滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液（S-A/HRP），37℃20分钟，PBS洗3次×5分钟；11、DAB显色：使用DAB显色试剂盒1ml蒸馏水加显色剂A、B、C各一滴，混匀，加至标本上，显色6分钟，充分水洗；12、复染：苏木素1分钟，充分水洗，1%盐酸酒精分化，1%胺水反蓝，充分水洗；13、封片：经70%乙醇5分钟、80%乙醇5分钟、90%乙醇5分钟两次、95%乙醇5分钟两次、100%乙醇5分钟两次脱水、二甲苯透明5分钟两次、中性树脂封片；14、显微镜观察：选择实验组和对照组的阳性组织相、进行400×的显微照相。

15、图像分析：选择有意义的组织相，经登录、编号、采集、分析、读取数据、最后存盘。

免疫组化操作步骤一免疫组化（ LP 法）操作步骤：1．切片常规脱蜡至水。

如需抗原修复，可在此步后进行2. 缓冲液洗 3min/2 次。

3. 为了降低内源性过氧化物酶造成的非特异性背景染色 , 将切片放在 Hydrogen Peroxide Block 中孵育 10-15 分钟。

4. 缓冲液洗 5min/2 次。

5. 滴加 Ultra V Block ，在室温下孵育 5 分钟以封闭非特异性的背景染色。

（注：孵育不要超过 10 分钟，否则会导致特异性染色降低。

如果一抗的稀释液中含有 5 － 10% 正常羊血清，这一步可以省略。

）6. 缓冲液洗 5min/2 次。

7. 滴加一抗工作液 37 ℃孵育 1 － 2 小时。

（具体孵育时间和温度由试验者最终决定）8. 缓冲液洗 5min/2 次。

9 ．滴加 Primary Antibody Enhancer( 增强子 ) , 在室温下孵育 20 分钟。

10 ．缓冲液洗 5min/2 次。

11 ．滴加 HRP Polymer( 酶标二抗 ) ，在室温下孵育 30 分钟。

（注： HRP Polymer 对光敏感，应避免不必要的光暴露并储存在不透明的小瓶中。

）12 ．缓冲液洗 5min/2 次。

13 ．向 1ml DAB Plus Substrate ( 或 AEC Plus Substrate) 中滴加 1-2 滴 DAB Plus Chromogen （或 AEC Plus Chromogen ） , 混匀后滴加到切片上，孵育 3 － 15 分钟。

（具体时间由染色深浅决定。

）14 ．自来水充分冲洗 , 复染，脱水 , 透明 , 封片。

二．免疫组化 ( 三步法 ) 操作步骤：（ 1 ）、石蜡切片脱蜡至水。

（ 2 ）、 3%H 2 O 2 室温孵育 5-10 分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。

（ 3 ）、蒸馏水冲洗， PBS 浸泡 5 分钟 x2 （如需抗原修复，可在此步后进行）。