第八章高效液相色谱法 (High Performance Liquid Chromatograph) 第一节概述（Generalization） 以高压液体为流动相的液相色谱分析法称高效液相色谱法（HPLC）。HPLC是20世纪70年代初发展起来的一种新的色谱分离分析技术。具有分离效能高、选择性好、灵敏度高、分析速度快、适用范围广（样品不需气化，只需制成溶液即可）的特点，适用于高沸点、热不稳定有机及生化试样的分离分析。 HPLC基本方法是用高压泵将具有一定极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂泵入装有填充剂的色谱柱，经进样阀注入的样品被流动相带入色谱柱内进行分离后依次进入检测器，由记录仪、或数据处理系统记录色谱信号再进行数据处理而得到分析结果。 高效液相色谱法按固定相不同可分为液－液色谱法和液－固色谱法；按色谱原理不同可分为分配色谱法（液－液色谱）和吸附色谱法（液－固色谱）等。目前，化学键合相色谱应用最为广泛，它是在液－液色谱法的基础上发展起来的。将固定液的官能团键合在载体上，形成的固定相称为化学键合相，具有固定液不易流失的特点，一般认为有分配与吸附两种功能，常以分配作用为主。C18（ODS）是最常使用的化学键合相。 根据固定相与流动相极性的不同，液-液色谱法又可分为正相色谱法和反相色谱法，当流动相的极性小于固定相的极性时称正相色谱法，主要用于极性物质的分离分析；当流动相的极性大于固定相的极性时称反相色谱法，主要用于非极性物质或中等极性物质的分离分析。 《中国药典》中有50种中成药的定量分析采用HPLC法，在中药制剂分析中，大多采用反相键合相色谱法。 一、高效液相色谱法的特点 目前经典LC主要用于制备，若用于分析则采用脱机或非连续检测。经典LC填料缺陷，通常是填料粒度大、范围宽、不规则，不易填充均匀，扩散和传质阻力大，谱带展宽加大。它存在致命弱点：速度慢、效率低和灵敏度低。HPLC填料（高效固定相）颗粒细、直径范围窄、能承受高压。达到传质阻力小，分离效率高。早期HPLC的固定相用涂渍的方法制备，液膜厚度d f大，这和GC一样，会大大降低色谱柱的柱效。现代HPLC填料大多采用键合固定相，其固定相膜很薄，因而大大提高了柱效。高效固定相会带来什么新问题呢？使用高效填料带来两个新问题：一是柱流动阻力大大增大，因此需要采用高压泵输液；二是表面能很大，要采用专业的装柱技术。 高效液相色谱法是在气相色谱和经典液相色谱的基础上发展起来的。现代液相色谱和经典液相色谱没有本质的区别。不同点仅仅是现代液相色谱比经典液相色谱有较高的效率和实现了自动化操作。高效液相色谱的原理与经典液相色谱相同，但是它采用了高效色谱柱、高压输液泵和高灵敏度检测器。因此，高效液相色谱的分离效率、分析速度和灵敏度大大提高。定量准确，达到可与GC相媲美的分离分析性能。特别是结合计算机技术，HPLC已成为高度自动化和智能化的现代分析仪器。 经典的液相色谱法，流动相在常压下输送，所用的固定相柱效低，分析周期长，例如柱长170㎝，柱内径0.9㎝，流动相速度30㎝3/h，约需20多小时才能分离出20种氨氨基酸；而用高效液相色谱法，只需1小时之内就完成。而现代液相色谱法引用了气相色谱的理论，流动相改为高压输送，色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料（几微米至几十微米）填充而成，均匀、规则的固定相，传质阻力
中国药典2020 高效液相色谱 高效液相色谱（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）是一种分离、检测、定量化合物的分析技术。它通过样品在固 相填充柱（也称为色谱柱）中与流动相相互作用，达到物质的分离和 检测的目的。 高效液相色谱的主要设备包括进样器、泵、检测器和色谱柱。进 样器负责将样品注入到色谱柱中，泵则负责向色谱柱内注入流动相， 检测器则负责检测和记录某特定物质的浓度，并把数据传回计算机。 色谱柱则是样品分离的关键部分，它由一种或多种材料组成，使样品 能够在流动相中以一定速率流过。 高效液相色谱通常用在检测复杂样品中的化合物，如食品、药品、生物样品等。它的主要特点是高分离能力、高灵敏度、高准确性和高 重现性。它能够检测到微量量级以下的化合物，并且很容易从复杂矩 阵中提取所需的物质。 高效液相色谱的工作原理是基于化学物质的亲性性质。样品经过 某种预处理后，以一定的注入速度进入色谱柱中。在色谱柱中，样品
物质会和填充柱内固定的某种材料作用，根据化合物的特性不同，有些化合物会与某些色谱柱材料形成亲和作用，有些则会与其他材料发生反应，并根据这些作用发生时的瞬间不同时刻，生成不同的荧光信号。 高效液相色谱的流动相包括两种，一种叫极性流动相，即水相。另一种叫做非极性流动相，即有机溶剂。在高效液相色谱的运用过程中，这两种流动相经常会互相使用，互相搭配，以达到更好的分离效果。 总结来说，高效液相色谱是一种分离、检测和定量化合物的重要技术，其优点包括高分离能力、高灵敏度、高准确性和高重现性等。在现代科学和工业生产中，高效液相色谱不仅在药品、食品、生物样品分析方面得到广泛应用，而且还在环保、冶金、化工等其他关键领域起到了巨大的作用，使科技更加先进，生产更为精准。
高效液相色谱分析原理及流程 高效液相色谱以经典的液相色谱为基础，是以高压下的液体为流动相的色谱过程。通常所说的柱层析、薄层层析或纸层析就是经典的液相色谱。所用的固定相为大于100um的吸附剂(硅胶、氧化铝等)。这种传统的液相色谱所用的固定相粒度大，传质扩散慢，因而柱效低，分离能力差，只能进行简单混合物的分离。而高效液相所用的固定相粒度小(5um-10um)、传质快、柱效高。高效液相色谱法(HPLC)是20世纪60年代后期发展起来的一种分析方法。近年来，在保健食品功效成分、营养强化剂、维生素类、蛋白质的分离测定等应用广泛。世界上约有80%的有机化合物可以用HPLC来分析测定。 高效液相色谱分析原理 (一)高效液相色谱分析的流程 由泵将储液瓶中的溶剂吸入色谱系统，然后输出，经流量与压力测量之后，导入进样器。被测物由进样器注入，并随流动相通过色谱柱，在柱上进行分离后进入检测器，检测信号由数据处理设备采集与处理，并记录色谱图。废液流入废液瓶。遇到复杂的混合物分离(极性范围比较宽)还可用梯度控制器作梯度洗脱。这和气相色谱的程序升温类似，不同的是气相色谱改变温度，而HPLC改变的是流动相极性，使样品各组分在最佳条件下得以分离。 (二)高效液相色谱的分离过程 同其他色谱过程一样，HPLC也是溶质在固定相和流动相之间进行的一种连续多次交换过程。它借溶质在两相间分配系数、亲和力、吸附力或分子大小不同而引起的排阻作用的差别使不同溶质得以分离。开始样品加在柱头上，假设样品中含有3个组分，A、B和C，随流动相一起进入色谱柱，开始在固定相和流动相之间进行分配。分配系数小的组分A不易被固定相阻留，较早地流出色谱柱。分配系数大的组分C 在固定相上滞留时间长，较晚流出色谱柱。组分B的分配系数介于A，C之间，第二个流出色谱柱。若一个含有多个组分的混合物进入系统，则混合物中各组分按其在两相间分配系数的不同先后流出色谱柱，达到分离之目的。 不同组分在色谱过程中的分离情况，首先取决于各组分在两相间的分配系数、吸附能力、亲和力等是否有差异，这是热力学平衡问题，也是分离的首要条件。其次，当不同组分在色谱柱中运动时，谱带随柱长展宽，分离情况与两相之间的扩散系数、固定相粒度的大小、柱的填充情况以及流动相的流速等
高效液相色谱分析法的基本原理和基本组成高效液相色谱（HighPerformanceLiquidChromatography，缩写 为HPLC）是一种在分析和细胞分离化学领域中最重要的技术手段之一。在这项技术中，溶剂通过精密的柱型容器内部流动，而溶质则被不同的空气动力学条件（例如压力和温度）穿越柱的表面，进而实现其分离。高效液相色谱分析法不仅可用于单一物质的分离，也可以用于实现混合物的全分析。本文将深入介绍高效液相色谱分析法的基本原理和基本组成。 首先，高效液相色谱分析法的基本原理是通过将混合物加入适当溶剂中并在高压动力学条件下推进，而溶质会根据其在柱中的溶解度而被分离出来，实现其分离。当混合物经过分离处理时，每一种溶质会形成一个独立的峰，最终可以根据峰的位置，形状和大小来对混合物中的溶质进行识别和测定。 此外，实现混合物分离和测定所需要的基本组成也是非常重要的。首先，必须有一个溶剂，用来混合溶质以及推动它们到HPLC系统中。其次，柱是HPLC系统中的基本元件，由于其表面状态的不同，可以 介导溶质的转移。最后，还必须有一个泵，通过它可以驱动溶液从柱的入口到出口的流动，以推进混合物的分离。 在开始实验测试之前，必须先根据每一种溶质的特性，设计出适当的HPLC系统，才能得到满意的分离效果。其中，准备柱是必不可 少的，而且也是最重要的一步。柱的特性取决于其黏度、孔径和长度等参数，而且这些参数取决于柱内吸附体的种类、形状和大小。因此，
在确定柱参数之前，必须先研究柱中添加的吸附体。 除了以上介绍的基本组成，HPLC系统中还必须具备多种检测设备，以及一个控制系统和一个数据处理系统，以便对HPLC系统的运行情况进行实时监测，确保实验的结果可靠可信。 基于以上说明，可以看出，高效液相色谱分析法不仅可用于单一物质的分离，也可以用于实现混合物的测定，其基本原理和基本组成也是至关重要的。高效液相色谱分析法由于其准确性和灵敏度而备受赞誉，它可以用于医药、食品和环境分析以及其他行业的应用，为科学研究和实践发挥着重要的作用。 综上所述，高效液相色谱分析法是一种非常重要的技术手段，它的基本原理和基本组成是必不可少的，可以用于多种应用场景，发挥着重要的作用。
第二章高效液相色谱法 高效液相色谱法特点 1、高压，150×105-350×105Pa 2、高速 3、高效，3万塔板/m 4、高灵敏度 高效液相色谱与气相色谱比较 ●分析对象及范围：GC分析只限于气体和低沸点的稳定化合物，而这些物质 只点有机物总数的20%；HPLC可以分析高沸点、高分子量的稳定或不稳定化合物，这类物质占有机物总数的80%。 ●流动相：GC采用的流动相中为有限的几种“惰性”气体，只起运载作用， 对组分作用小；HPLC采用的流动相为液体或各种液体的混合，可供选择的机会多。它除了起运载作用外，还可与组分作用，并与固定相对组分的作用产生竞争，即流动相对分离的贡献很大，可通过溶剂来控制和改进分离。 ●操作温度：GC需高温；HPLC通常在室温下进行。 二、影响分离的因素 基本概念及理论基础与气相色谱一致，主要区别为流动相不同，液相色谱流动相为液体，气相色谱流动相为气体 H = A + B/u + Cu 对于分子扩散项，当流动相线速度大于0.5cm/s时可忽略不计 三、HPLC主要类型 1、液-液分配色谱法：早期通过在担体上涂渍一薄层固定液制备固定相, 现多为化学键合固定相，即用化学反应的方法通过化学键将固定液结合在担体表面。 2、液-固色谱：以固体吸附剂为固定相，如硅胶、氧化铝等，较常使用的是5～10μm的硅胶吸附剂。流动相可以是各种不同极性的一元或多元溶剂。 3.离子色谱：水溶液中阴离子分析的最佳方法，固定相为离子交换树脂，流动相为无机酸或无机碱的水溶液。各种离子根据它们与树脂上的交换基团的交换能力的不同而得到分离。 4.空间排阻色谱：以凝胶为固定相。凝胶是一种经过交联的、具有立体网状结构和不同孔径的多聚体的通称。如葡聚糖凝胶、琼脂糖等软质凝胶；多孔硅胶、聚苯乙烯凝胶等硬质凝胶； 液-液分配色谱法 在液-液色谱中,流动相和固定相都是液体,它能适用于各种样品类型的分离和分析，无论是极性的和非极性的，水溶性和油溶性的，离子型的和非离子型的化合物。 分离原理： 液-液分配色谱的分离原理基本与液液萃取相同，都是根据物质在两种互不相溶的液体中溶解度的不同，具有不同的分配系数。所不同的是液液色谱的分配是在柱中进行的，使这种分配平衡可反复多次进行，造成各组分的差速迁移，提高了分离效率，从而能分离各种复杂组分。 在液液色谱中为了避免固定液的流失。对流动相的一个基本要求是流动相尽
第二章高效液相色谱分析 §2.1 高效液相色谱法概述（掌握） 2.1.1 高效液相色谱法的特点 1、与经典液相色谱法比较 2、与气相色谱法比较 3、高效液相色谱法的发展 A、固定相的变化 填料粒度减小，粒型规整；键合型固定相；整体结构固定相；亲和固定相。目前，出现使用1.0µm填料的超高压液相色谱。
B 、流动相变化 目前，出现120～220℃超热水为流动相、FID 和FPD 检测器的HPLC 。 C 、全新方法 剪切流路液相色谱；不同分离机制组合的多维液相色谱以及HPLC 与MS 、NMR 、IR 联用的多维液相色谱法。 4、高效液相色谱法的特点 ①高压 ：采用高压输液设备，（150~350）× 105 Pa ②高速：分析速度快； ③高效：柱效很高。（n>30000），可以在数分钟内完成数百种物质的分离； ④高灵敏度：10—9g （UV ）；10—11 g （荧光检测）。 5、高效液相色谱法的局限 ①溶剂用量太大； ②缺乏诸如气相色谱使用的TCD 、FID 通用型检测器； ③不能替代气相色谱法，难分离化合物(柱效10万以上)，必须使用毛细管气相色谱法进行分离； ④不能替代中、低压柱色谱法，一些生物活性化合物不能承受200kPa ～1MPa 压力。 §2.2 影响色谱峰扩展及色谱分离的因素（了解） 2.2.1 影响色谱峰的扩展的因素 高效液相色谱法的基本概念及理论基础，与气相色谱法是基本一致的，其区别主要在于 流动相的不同。现根据速率理论及色谱峰扩展及色谱分离的影响讨论如下： 高效液相色谱的范氏方程： 22 22m p sm p s f d m p m m s C d C d C d C D H d u u u D D D λ⎛⎫=++++ ⎪ ⎪⎝⎭ 若将上式简化，可写作： B H A Cu u =++ 这与气相色谱的速率方程形式是基本一致的，主要区别在于纵向扩散项可以忽略不计， 影响柱效的主要因素是传质项。 1、涡流扩散项e H 2e p H d λ= 式中——λ：填充不规则因子；d ：填料平均直径。 它与载体流速无关； 若柱子填充均匀，填料的颗粒也均匀，则0λ→⇒0e H →⇒柱效高；若填充不均匀， λ↗⇒e H ↗⇒柱效低。 d d m d C D H u = 式中——C ：常数；D ：扩散系数；u ：流动项的线速度。 由于分子在液体中的扩散系数比在气体中要小4~5个数量级，因此在液相色谱中，当流动相线 速度大于10.5 cm s -⋅时，这个纵向扩散项对色谱峰扩展的影响实际上是可以忽略的，而气相色谱法中这一项却是重要的。 （1）固定相传质阻力项s H 2s f s s C d H u D =
高效液相色谱-荧光法测定人尿液中氧氟沙星的浓度【实验目的】 1．掌握氧氟沙星尿液样品的收集、处理方法和尿药累积排泄率的计算方法。 2．熟悉氧氟沙星尿液样品的预处理方法好测定步骤。 【实验原理】 氧氟沙星为喹诺酮类抗菌药，化学名(+/-)-9-氟-2,3-二氢-3-甲基-10-(4-甲基-1-哌嗪基)-7-氧代-7H-吡啶并[1,2,3-de]-[1,4]苯并恶嗪-6-羧酸。本品为白色或微黄色结晶性粉末；无臭、味苦；遇光渐变色；在三氯甲烷中略溶，在水或甲醇中微溶或极微溶解，在冰醋酸或氢氧化钠试液中易溶，在0.1mol/L盐酸溶液中溶解。 （C18H20FN3O4 361.38） 环丙沙星（内标），化学名1-环丙基-6-氟-4-氧代-1，4-二氢-7-（1-哌嗪基）-3-喹啉甲酸。 （C17H18FN3O3331.35） 1．尿液中药物浓度的测定可以计算药物的排泄量及排泄率，在某些缺乏严密医护条件不便于对给药对象多次采血情况下，尿药排泄数据可以用来求算药动学参数；一般抗菌药物很容易通过尿液以原形药物形式排出体外，可以表征当时体内的药量。 2．氧氟沙星具有长共轭刚性结构，可以采用荧光检测器检测，由于体内内源性物质能够产生荧光的可能性很小，因此，荧光检测可以有效地减小内源性物质的干扰，同时增加检测灵敏度，满足了体内药物分析干扰多、含量低的特点。 3．氧氟沙星具有酸碱两性，在水溶液中发生解离，因此选择偏酸性的色谱条件可以有效地抑制其拖尾或者色谱峰对称性差的缺点，获得较好的色谱分离效果；由于尿液中浓度较大，可以采用直接稀释后离心的前处理手段，以获得适合于色谱分析的样品。 【仪器与试药】
高效液相色谱在药物分析中的应用 高效液相色谱（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）是分析化学中一种非常重要的手段。在药物分析中，HPLC广泛应用于药物含量测定、杂质分析、药代动力学、药物失效机理分析、药物交互作用等方面。因为其高灵敏度、高分离度、高准确性、高重现性等优点，被誉为现代化学分析的“铁路”。 HPLC分析原理简介 HPLC的分离原理是根据样品分子在固定相和流动相之间的互相作用力不同，利用固定相呈现出的分子选择性吸附作用来实现分离。在HPLC分析过程中，固定配合物和悬浮在流动相中溶质之间通过相互作用，使流动相中的溶质与固定相结合并阻止经过的过程成分的运动而实现分离。 高效液相色谱在药物分析中的应用 1.药物含量及其杂质检测 药物含量及其杂质是药物分析的重要内容。通过HPLC可以对药物及其杂质进行可靠、灵敏、准确的检测。例如，HPLC可以用于测定药物的纯度、杂质、活性成分、含量等。 例如，按照中国药典2015年版的规定，通过HPLC分析测定头孢曲松钠药品中的含量，结果表明该药品中含有98.4%的头孢曲松钠。 2.药物代谢动力学分析 药代动力学研究是药物研发过程中必要的环节，可以分析药物在体内代谢和排泄的情况。药物代谢动力学研究是药物治疗效果和合理用药的依据。因此，HPLC 非常适合进行药物代谢动力学研究。
例如，使用HPLC测定维生素B2代谢动力学的过程中，首先通过内标法选取L-色氨酸等内标物，然后用HPLC分离并测定维生素B2及其代谢产物蒽醌，结果表明HPLC是非常适合于测定维生素B2代谢动力学的方法。 3.药物失效机理分析 药物的失效机理是因为药物有可能产生不希望的肝毒性或其他副作用，使得药物失效。HPLC分析可以用于药物失效机理的分析。例如，HPLC可以用于分析站立喹啉失效的原因，结果表明站立喹啉受热环境下会分解，并产生过氧化物，导致药物失效。 4.药物交互作用分析 药物与药物之间的相互作用可能会使药物的疗效大为降低或增强。通过HPLC 分析可以对药物与药物之间的相互作用进行分析并对临床用药做出合理的建议。 例如，HPLC可以用于分析雷贝拉唑与阿奇霉素的相互作用，结果表明雷贝拉唑和阿奇霉素在肠道中相互作用，并导致阿奇霉素的生物利用度得到了提高。 总结 在药物分析中，HPLC是一个非常重要的技术手段。它具有高选择性、高分辨率、高准确性和高灵敏性等优势，极大地提高了药物分析领域的研究效率，也有利于药物临床用药和药物治疗效果的评估。
高效液相色谱法分析中的常见问题与解决方 案 高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）是一种现 代化的分析方法，广泛应用于药物、食品、环境等领域。然而，在实际应用过程中，常常会遇到一些问题。本文将探讨高效液相色谱法分析中的常见问题，并提供解决方案。 1. 色谱峰分离不良 在进行高效液相色谱分析时，首要问题就是色谱峰的分离不良。造成这个问题 的原因可能是样品组分过于复杂，或是色谱柱选择不当。解决的方法包括：（1）优化样品前处理方法，如提取、净化等，以减少样品的复杂性； （2）调整流动相的组成和流速，或试用其他类型的色谱柱，以提高色谱峰的 分离度。 2. 流动相持续泵出问题 在HPLC分析过程中，流动相持续泵出是关键步骤之一。当出现流量不稳定或 持续泵出不工作的情况时，可以尝试以下解决方法： （1）检查管路是否有漏气现象，尤其是连接件的密封性； （2）清洗或更换柱子和过滤器，以防止堵塞； （3）检查、更换流量检测器，并校正流量计。 3. 柱寿命较短
柱寿命的短暂是高效液相色谱法分析中常见的问题之一，主要原因是样品残留 物的堆积、色谱柱废液的积累、和流动相的不合适。针对这个问题可以采取以下措施： （1）对样品进行预处理，减少残留物的堆积； （2）定期清洗和维护色谱柱，保持柱的表面状况； （3）使用适当的流动相，避免酸性或碱性物质损害色谱柱。 4. 波峰畸变问题 波峰畸变是指在色谱图上观察到的峰形呈现为不对称的情况，这可能是由于柱 床不均匀、流量不稳定或是组分浓度过高引起。解决这个问题的方法包括：（1）更换新的色谱柱，确保柱床的均匀性； （2）检查各部分的流量是否稳定，尤其是溶液的泵出和进样流速的稳定性； （3）适当稀释样品，以降低组分浓度。 5. 某些组分无法检测到 当分析物无法检测到时，可以考虑以下解决方法： （1）确认所使用的检测器是否适用于分析物的检测，并检查检测器的灵敏度； （2）尝试使用其他检测器或改变检测器条件，如波长或电流； （3）检查样品制备方法是否完整，是否包含了分析物。 总结起来，高效液相色谱法在分析中常常遇到色谱峰分离不良、流动相持续泵 出问题、柱寿命较短、波峰畸变以及某些组分无法检测到等常见问题。通过优化样品前处理、调整流动相的组成和流速、检查和清洁柱子等方法，可以有效解决这些问题，提高高效液相色谱法的分析准确性和效率。
高效液相色谱的分离和分析 高效液相色谱（HPLC）是现代化学分析领域中最重要的分离技术之一。它在食品、制药、生物技术、环境科学和研发等领域都有广泛的应用。本文将从HPLC 的基本原理出发，介绍它的分离和分析方法，以及这种技术的优点和局限性。一、HPLC的基本原理 HPLC是基于分配系数的原理，它利用固定相和移动相之间的相互作用来分离化合物。固定相是一种由颗粒状或均匀涂覆在支撑材料表面的成膜状材料，例如硅胶、碳等。移动相是一种由溶剂混合物组成的流体，它会在固定相表面通过，与固定相相互作用。 利用HPLC进行分离的过程包括样品进样、移动相泵送、分离柱和检测器等四个步骤。样品进入分离柱以后，会在固定相上被分离，所分离的成分将按照固定相的吸附能力和移动相的溶解能力来进行分离。为了实现快速、高效的分离，通常我们会通过改变流速、操作温度和pH等参数来优化HPLC的分离效率。 二、HPLC的分离和分析方法 在HPLC中，常用的分离方法主要包括反相色谱、离子交换色谱、凝胶过滤色谱、亲和层析和大小排除色谱等。这些分离方法都具有不同的选择性和分离效率，因此它们可以用于分离许多复杂的混合物。 反相色谱是最常用的HPLC分离方法之一，它的固定相通常是极性低的碳氢化合物，而移动相则是一种极性高的溶剂体系，例如水-乙腈或水-甲醇混合物。这种方法可以用于分离许多非极性化合物，例如蛋白质。 离子交换色谱则同时考虑样品的电荷，它利用固定相和移动相之间原子间相互作用而实现分离。移动相是一个由缓冲溶液、盐和极性有机溶剂组成的混合物。这种方法可以用于分离具有不同离子性质的化合物，例如金属离子和生物分子等。
分析实验报告高效液相色谱 引言： 高效液相色谱（High performance liquid chromatography, HPLC） 是一种广泛应用于生物化学、药物分析、环境检测等领域中的分析技术。 其原理是利用固定相和液相之间的相互作用进行化合物的分离与定量分析。本实验旨在通过操作高效液相色谱仪，掌握HPLC的基本原理、操作方法 和数据处理技巧。 实验方法： 实验所使用的仪器为Agilent 1260 Infinity II高效液相色谱仪， 柱为C18柱，以甲醇-水为流动相进行分离。首先，使用样品溶液（如药 物或化合物混合物）进行系统性能调试，包括柱温、流速、梯度洗脱程序 等参数的优化。根据实验要求，确定分离柱和流量。然后，按照仪器操作 手册的指导，进行初始条件设置、进样及洗脱等步骤。最后，通过检测器 检测到的信号，确定各组分的峰面积或峰高，以定量分析目标化合物的含量。 实验结果及分析： 在实验中，我们以对硝基苯酚为目标化合物，进行了HPLC分离与定量。首先，通过系统性能调试，确定了优化的柱温、流速和梯度洗脱程序 等参数。然后，按照仪器操作手册的指导，进行了初始条件设置、进样及 洗脱等步骤。最后，通过检测器检测到的信号，确定了各组分的峰面积。 在HPLC色谱图中，我们观察到了目标化合物对硝基苯酚的峰。通过 计算该峰面积，并与一系列标准溶液峰面积进行比较，可以确定目标化合 物的含量。
分析实验结果，我们发现目标化合物对硝基苯酚在该条件下呈良好的分离，并且峰形较好。根据峰面积的大小，可以定量分析目标化合物的含量。而对于其他组分的峰，也可以据此进行进一步的鉴别和分析。 讨论： 在本实验中，我们成功地运用了高效液相色谱进行化合物的分离和定量分析。HPLC作为一种高效、灵敏的分析方法，广泛应用于生物化学、药物分析等领域。 然而，在实际应用中，仍存在一些问题需要解决。例如，在一些情况下，可能会出现柱堵塞、峰形畸变等问题，影响分离效果和数据准确性。此外，在一些情况下，可能需要针对不同化合物进行柱和流动相的优化，以达到更好的分离效果。 结论： 通过本次实验，我们掌握了高效液相色谱的基本原理、操作方法和数据处理技巧。成功地使用HPLC进行了化合物的分离和定量分析。尽管仍存在一些问题需要解决，但HPLC作为一种高效、灵敏的分析方法，为生物化学、药物分析等领域的研究提供了有力工具。 [1] Skoog, D. A., Holler, F. J., & Crouch, S. R. (2024). Principles of instrumental analysis. Nelson Education. [2] Snyder, L. R., Kirkland, J. J., & Dolan, J. W. (2024). Introduction to modern liquid chromatography. Wiley.
高效液相色谱分析 基本要点： 1. 了解高效液相色谱法的优点及适用范围； 2. 了解高效液相色谱仪的主要部件及高效液相色谱法基本流程； 3. 理解常用检测器的原理、适用的分析对象及适用范围； 4. 理解各种分离方式的原理及选择原则。 第一节高效液相色谱法的特点 一、概述 液相色谱法是指流动相为液体的技术。早期的液相色谱（经典液相色谱）是将小体积的试液注入色谱柱上部，然后用洗脱液（流动相）洗脱。这种经典色谱法，流动相依靠自身的重力穿过色谱柱，柱效差(固定相颗粒不能太小)，分离时间很长。 70年代初期发展起来的高效液相色谱法，克服了经典液相色谱法柱效低，分离时间很长的缺点。成为一种高效、快速的分离技术。高效液相色谱法是在经典色谱法的基础上，引用了气相色谱的理论，在技术上，流动相改为高压输送（最高输送压力可达4.9 107Pa）;色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料填充而成，从而使柱效大大高于经典液相色谱（每米塔板数可达几万或几十万）；同时柱后连有高灵敏度的检测器，可对流出物进行连续检测。 二、特点 1．高压：液相色谱法以液体为流动相（称为载液），液体流经色谱柱，受到阻力较大，为了迅速地通过色谱柱，必须对载液施加高压。一般可达150～350×105Pa。 2. 高速：流动相在柱内的流速较经典色谱快得多，一般可达1～10ml/min。高效液相色谱法所需的分析时间较之经典液相色谱法少得多，一般少于 1h 。 3. 高效：近来研究出许多新型固定相，使分离效率大大提高。 4.高灵敏度：高效液相色谱已广泛采用高灵敏度的检测器，进一步提高了分析的灵敏度。如荧光检测器灵敏度可达10-11g。另外，用样量小，一般几个微升。 5.适应范围宽：气相色谱法与高效液相色谱法的比较：气相色谱法虽具有分离能力好，灵敏度高，分析速度快，操作方便等优点，但是受技术条件的限制，沸点太高的物质或热稳定性差的物质都难于应用气相色谱法进行分析。而高效液相色谱法，只要求试样能制成溶液，而不需要气化，因此不受试样挥发性的限制。对于高沸点、热稳定性差、相对分子量大（大于 400 以上）的有机物（这些物质几乎占有机物总数的 75% ～ 80% ）原则上都可应用高效液相色谱法来进行分离、分析。据统计，在已知化合物中，能用气相色谱分析的约占20%，而能用液相色谱分析的约占70～80%。 第二节影响色谱峰扩展及色谱分离的因素 一、液相色谱速率理论—影响色谱峰扩展因素 1. 涡流扩散项He A = 2λd p 其含义与其相色谱法相同。
高效液相色谱分析 一、选择题 1.液相色谱适宜的分析对象是( )。 A 低沸点小分子有机化合物 B 高沸点大分子有机化合物 C 所有有机化合物 D 所有化合物 2.在液相色谱中,梯度洗脱适用于分离( )。 A 异构体 B 沸点相近,官能团相同的化合物 C 沸点相差大的试样 D 极性变化范围宽的试样 3吸附作用在下面哪种色谱方法中起主要作用( )。 A 液一液色谱法 B 液一固色谱法 C 键合相色谱法 D 离子交换法 4.在液相色谱中,提高色谱柱柱效的最有效途径是( )。 A 减小填料粒度 B 适当升高柱温 C 降低流动相的流速 D 增大流动相的流速 5.液相色谱中通用型检测器是( )。 A 紫外吸收检测器 B 示差折光检测器 C 热导池检测器 D 荧光检测器 6.高压、高效、高速是现代液相色谱的特点,采用高压主要是由于( )。 A 可加快流速,缩短分析时间 B 高压可使分离效率显著提高 C 采用了细粒度固定相所致 D 采用了填充毛细管柱 7.在液相色谱中,下列检测器可在获得色谱流出曲线的基础上,同时获得被分离组分的三维彩色图形的是( )。 A 光电二极管阵列检测器 B 示差折光检测器 C 荧光检测器 D 电化学检测器 8.液相色谱中不影响色谱峰扩展的因素是( )。 A 涡流扩散项 B 分子扩散项 C 传质扩散项 D 柱压效应 9.在液相色谱中,常用作固定相又可用作键合相基体的物质是( )。 A 分子筛 B 硅胶 C 氧化铝 D 活性炭 11.在液相色谱中,固体吸附剂适用于分离( )。 A 异构体 B 沸点相近,官能团相同的颗粒 C 沸点相差大的试样 D 极性变换范围 12水在下述色谱中,洗脱能力最弱(作为底剂)的是( )。 A 正相色谱法 B 反相色谱法 C 吸附色谱法 D 空间排斥色谱法 13.在下列方法中,组分的纵向扩散可忽略不计的是( )。 A 毛细管气相色谱法 B 高效液相色谱法 C 气相色谱法 D 超临界色谱法 14. 下列用于高效液相色谱的检测器,()检测器不能使用梯度洗脱。 A、紫外检测器 B、荧光检测器 C、蒸发光散射检测器 D、示差折光检测器 15. 高效液相色谱仪与气相色谱仪比较增加了() A、恒温箱 B、进样装置 C、程序升温 D、梯度淋洗装置 二、填空题 1.高效液相色谱中的技术类似于气相色谱中的程序升温,不过前者连续改变的是流动相 的,而不是温度。 2.在液-液分配色谱中,对于亲水固定液采用流动相,即流动相的极性_______________固定相的极性称为正相分配色谱。 3.正相分配色谱适用于分离化合物、极性的先流出、极性的后流出。 4.高压输液泵是高效液相色谱仪的关键部件之一,按其工作原理分为和两大类。 5.离子对色谱法是把加人流动相中,被分析样品离子与生成中性离子对,从而增加了样品离子在非极性固定相中的,使增加,从而改善分离效果。
实验六 萘、联苯、菲的高效液相色谱分析 一、目的要求： (1)了解反相色谱的优点和应用 （2）掌握归一化定量方法 2．原理 在液相色谱中，若采用非极性固定相，如十八烷基键合相（ODS ），极性流动相，这种色谱法称为反相色谱法。这种分离方式特别适合于同系物，苯并系物等。萘、联苯、菲在ODS 柱上的作用力大小不等，它们的'k 值不等（'k 为不同组分的分配比），在柱内的移动速率不同，因而先后流出柱子。根据组分峰面积大小测定的定量校正因子，就可由归一化定量方法求出各组分的含量，归一化定量公式为： ''''1122%100i i i n n A f P A f A f A f =⨯++⋅⋅⋅ 式中，i A 为组分的峰面积，'i f 为组分的相对定量校正因子。采用归一化法 的条件是：样品中所有组分都要流出色谱柱，并能给出信号。此法简便、准确，对进样量的要求不十分严格。 3．仪器与试剂 仪器：Shimadzu LC-10A 高效液相色谱仪；紫外吸收检测器（254nm ）；柱Econo-sphore C 18(3μm)；10c m ×4.5mm 微量注射器。 试剂：甲醇（AR ）；重蒸馏一次；二次蒸馏水；萘；联苯；菲均为AR 级。流动相：甲醇/水=88/12。 4．实验步骤 （1）按操作说明书使色谱仪运行正常，并将实验条件调节如下： 柱温：室温 流动相流量：1.0mL/min 检测器工作波长：254nm （2）标准溶液配制：准确称取萘约0.08g ，联苯0.02g ，菲0.01g ，用重蒸馏的甲醇溶解，并转移至50mL 容量瓶中，用甲醇稀释至刻度。 （3）在基线平直后，注入标准溶液3.0μL ，记下各组分保留时间，再分别注入纯样对照。
高效液相色谱法分析芳香类化合物 一、原理 HPLC基本原理是将待测芳香类化合物样品通过溶解于流动相中，并 通过一个固定相填充在管柱上的分离介质，将样品中的化合物进行分离， 再用检测器来检测分离后的芳香化合物。HPLC分离机理主要包括吸附、 分配、离子交换、凝胶滤净等。其中对于芳香类化合物而言，吸附和分配 是最常用的分离机制。 二、方法 HPLC分析芳香类化合物的方法主要包括样品准备、流动相选择、固 定相选择、色谱柱选择和检测器选择。 1.样品准备：对于芳香类化合物的分析，样品总体积一般不超过1mL。样品可以是液体、固体或气体萃取物。在液体样品的处理过程中，可以经 过过滤、稀释或浓缩等步骤来准备样品。 2.流动相选择：流动相是一种溶液，它可以是有机溶剂、水或它们的 混合物。选择合适的流动相可以改变芳香类化合物在固定相上的吸附和分 配性质，从而实现它们的分离。常用的流动相包括甲醇、乙醇、水、醚等。 3.固定相选择：固定相是色谱柱中的填料，也称为流动相。常用的固 定相有硅胶、C18和凝胶等。对于芳香类化合物而言，常用的固定相是 C18，它具有很好的吸附性能。 4.色谱柱选择：色谱柱是HPLC中至关重要的部分，它直接影响着芳 香类化合物的分离效果。色谱柱的选择应根据待测化合物的性质、分析对 象和分析方法来确定。
5.检测器选择：常用的检测器有紫外检测器（UV）、荧光检测器、质 谱检测器等。对于芳香类化合物而言，UV检测器是最常用的检测器之一三、应用 HPLC广泛应用于医药、环境、食品、化妆品等领域中对芳香类化合 物的分析。 1.水样中芳香类化合物的分析：HPLC可以对水样中的有机污染物进 行精确的定性和定量分析。常见的水样中芳香类化合物分析包括：苯酚、 苯胺、苯甲酸等。 2.食品中香精成分的分析：HPLC可用于分析食品中添加的香精成分，如苯甲醛、苯甲酸乙酯等。 3.药物中挥发性成分的分析：HPLC可以对药物中的挥发性成分进行 分离和分析。如薰衣草中的香豆素、香叶基酮等。 4.香精化妆品中成分的分析：HPLC可以对香精化妆品中的各种香料 和成分进行分离和分析。如香精中的麝香酮、檀香醇等。 总结起来，HPLC技术在分析芳香类化合物中具有广泛的应用前景。 这项技术在药物、环境、食品、化妆品等领域起到了非常重要的作用，并 为相关行业提供了有力的支持。
第一章测试 1.在高效液相色谱中可以忽略范式方程的哪一项 A:涡流扩散项 B:纵向扩散项 C:传质阻力项 D:所有选项都不对 答案:B 2.色谱法最早用于下列哪种物质的分离 A:药物 B:植物色素植物色素 B、胡萝卜素 C、食品 D、药品植物色 素 B、胡萝卜素C、食品 D、药品植物色素 B、胡萝卜素 C、食品 D、药品植物色素 C:食品 D:胡萝卜素胡萝卜素 答案:B 3.以下哪本期刊的主题不涉及色谱领域 A:Journal of Separation Science B:Atherosclerosis C:Journal of Chromatography A D:Journal of Chromatographic Science 答案:B 4.色谱法分离混合物的可能性决定于试样混合物在固定相中的差别的是 A:沸点差 B:分配系数 C:吸光度 D:温度差 答案:B 5.在气-液色谱系统中，被分离组分与固定液分子的类型越相似，它们之间 A:作用力越小，保留值越小 B:作用力越大，保留值越小 C:作用力越小，保留值越大 D:作用力越大，保留值越大 答案:D 6.色谱基本理论中理论塔板数反映了 A:柱的效能 C．保留值 D．分配系数柱的效能 B:分离度 C:保留值 D:分配系数 答案:A
7.下列有关色谱特点说法正确的是 A:灵敏度高 B:定性能力强 C:分析效率高 D:自动化程度高 答案:ACD 8.以下色谱分析法中属于定性指标参数的是 A:分配系数 B:相对保留时间 C:保留指数 D:保留时间 答案:BCD 9.色谱法在以下哪种应用中不具有特殊优势 A:化合物的定性鉴别 B:化合物的结构鉴定 C:化合物的理化性质测定 D:混合物的分离 答案:ABC 10.以下对色谱分析法描述正确的是 A:色谱法通常利用某一特定的色谱系统（如TLC，HPLC或GC系统等）进行分离分析 B:分配系数的不同使不同组分在色谱中得到分离 C:色谱分析法是一种物理或物理化学的分离分析方法 D:色谱分析法的定性能力高于化学法和光谱法 答案:ABC 第二章测试 1.气相色谱仪主要包括： A:分离和温控系统 B:进样系统 C:气源系统 D:检测系统 答案:ABCD 2.影响线性分流的因素包括： A:气化室温度 B:柱温 C:进样量 D:分流比 答案:ACD 3.影响电子捕获检测器灵敏度的因素正确的是： A:载气与尾吹气的流速
超高效液相色谱(UPLC) 超高效液相色谱技术（ultra performance liquid chcromatography，简称UPLC）是一种综合了小颗粒填料、非常低系统体积(死体积)及快速检测手段等全新的检测技术。在全面提升HPLC的速度、灵敏度及分离度的同时，保留其原有的实用性及原理。基于小颗粒技术的UPLC，并非普通HPLC系统改进而成。它不但需要耐压、稳定的小颗粒填料（可达1.7µm），而且需要耐压的色谱系统(>15,000psi)、最低交叉污染的快速进样器、快速检测器及优化的系统体积等诸多方面的保障，以充分发挥小颗粒技术优势。这就需要对系统所有硬件和软件的进行全面创新。世界第一个商品化UPLC产品是Waters ACQUITY UPLC TM超高效液相色谱系统，它于2004年3月投入市场。 图1：填料技术的沿革 1．小颗粒填料改善分离的理论与科学基础 液相色谱30年的发展史是颗粒技术的发展史。颗粒大小的改变直接影响到柱效，从而对分离结果产生直接影响。由上图可知：随着颗粒度的不断降低，色谱分
离度不断提高。事实上，上述规律的理论基础是著名的Van Deemeter方程。Van Deemeter方程是色谱科学家预测颗粒度变化而引起的色谱变化的根本依据。Van Deemeter曲线（见图2）预测最佳柱效与相应的流动相流速。由Van Deemeter方程得知：随着颗粒度减小，相应的理论塔板高度（HETP）也下降，得到的柱效会更高。还应该注意到1.7 µm颗粒的HETP最小值区域扩大了（见图2），这表明可以在比大颗粒更宽的流量范围内得到最高的柱效，结果可以不损失高分离度的同时来适当提高流动相的流速（分析速度）。小颗粒填料为色谱分离带来如此的高柱效和速度优势，使得利用小颗粒技术成为色谱科学家梦寐以求的目标。然而HPLC系统的设计，一直难于发挥出最小颗粒的优点。小颗粒技术的运用，不但要求仪器在超出目前限度（6000 psi/ 400 bar）的压力下工作，同时要求仪器系统的死体积要更小，以便不影响梯度性能，而且还要检测器能高速检测出峰宽只有几秒的色谱峰。 在利用杂化颗粒技术合成出耐压的新一代小颗粒色谱填料之后，UPLC超高效液相色谱系统的设计，充分利用了小颗粒填料的所有优点，弥补传统HPLC系统的不足。
高效液相色谱法及其在药物分析中的应用 以液体为流动相的色谱法称为液相色谱法。用常压输送流动相的方法为经典液相色谱法，这种色谱法的柱效能低、分离周期长。高效液相色谱法（highperformanceliquidchromatography，简称HPLC）是在经典液相色谱的基础上发展起来的一种色谱方法。与经典的液相色谱法相比，高效液相色谱法具有下列主要优点：①应用了颗粒极细（一般为10µm以下）、规则均匀的固定相，传质阻抗小，柱效高，分离效率高；②采用高压输液泵输送流动相，流速快，一般试样的分析需数分钟，复杂试样分析在数十分钟内即可完成；③广泛使用了高灵敏检测器，大大提高了灵敏度。目前，已经发展了多种不同的固定相，有多种不同的分离模式，使高效液相色谱法的应用范围不断扩大。下面介绍高效液相色谱法的有关知识，新的方法和技术以及在药物分析中的应用。 一、分类 高效液相色谱法按分离机理的不同可分为以下几类： （一）吸附色谱法（adsorptionchromatography） 以吸附剂为固定相的色谱方法称为吸附色谱法。使用最多的吸附色谱固定相是硅胶，流动相一般使用一种或多种有机溶剂的混合溶剂。在吸附色谱中，不同的组分因和固定相吸附力的不同而被分离。组分的极性越大、固定相的吸附力越强，则保留时间越长。流动相的极性越大，洗脱力越强，则组分的保留时间越短。 （二）液-液分配色谱法（liquid-liquidchromatography) 液-液分配色谱的固定相和流动相是互不相溶的两种溶剂，分离时，组分溶入两相，不同的组分因分配系数（K)的不同而被分离。目前广泛使用的化学键合固定相是将固定液的官能团键合在载体上而制成的，使用化学键合固定相的色谱方法（简称键合相色谱法）可以用分配色谱的原理加以解释。键合相色谱法在HPLC中占有极其重要的地位，是应用最广的色谱法。 按照固定相和流动相极性的不同，分配色谱法又可分为正相色谱法和反相色谱法两类。 1.正相色谱法（normalphasechromatography) 固定相极性大于流动相极性的分配色谱法称为正相分配色谱法，简称为正相色谱法。氰基键合硅胶、氨基键合硅胶等极性的化学键合固定相是正相色谱常用的固定相，正相色谱的流动相一般为极性较小的有机溶剂。在正相色谱中，极性小的组分由于K值较小先流出，极性较大的组分后流出。正相色谱法用于溶于有机溶剂的极性及中等极性的分子型物质的分离。 2.反相色谱法（reversedphasechromatography） 流动相极性大于固定相极性的分配色谱法称为反相分配色谱法，简称为反相色谱法。反相色谱法使用非极性固定相，最常用的非极性固定相是十八烷基硅烷键合硅胶，还有辛烷基硅烷键合硅胶等。流动相常用水与甲醇、乙腈或四氢呋喃的混合溶剂。在反相色谱中极大的组分因K值较小先流出色谱柱，极性较小的组分后流出。流动相中有机溶剂的比例增加，流动相极性减小，洗脱力增强。反相色谱法是目前应用最广的高效液相色谱法。 （三）离子交换色谱法(ionexchangechromatography) 离子对交换色谱法是以离子交换剂为固定相的色谱方法，组分因和离子交换剂亲和力的不同而被分离。柱填料含有极性可离子化的基团，如羧酸、磺酸或季铵离子，在合适的PH值下，这些基团将解离，吸引相反电荷的物质。由于离子型物质能与柱填料反应，所以可被分离。样品中不同的组分因离子交换平衡常数的不同而分离。离子交换色谱的流动相一般为一定PH值的缓冲溶液，有时也加入少量的有机溶剂，如乙醇、四氢呋喃、乙腈等，以增大组分在流动相中的溶解度。流动相的PH值影响离子交换剂的交换容量。对弱酸或弱碱性的被分离组分，流动相的PH值还会影响其电离状况，流动相的PH值必须使待分离组分处于离解