5_2-D_DIGE_荧光的标记原理与试验流程

灵敏度
平均背景
600 pg
718
120 pg
345
24 pg
58
信噪比 1.65
1.5
15 3
1.36
ng Transferrin
0.8 0.12 0.024
4 2-D DIGE Training Course
Typhoon消除荧光强度差异
调节扫描参数PMT 电压， Max Intensity = 60000~9000 Cy2, Cy3, Cy5 数据相近
超声
离心
上清抽提
14 2-D DIGE Training Course
Step 3 – 调节pH值&定量
调节 pH 至 8.0-9.0 ，
最佳 pH 8.5
精确定量 (e.g. Ettan™ 2-D Quant Kit) 推荐蛋白浓度 5-10 mg/mL
15 2-D DIGE Training Course
测试结果判断
上样量 重新定量
Deep purpleTM or SYPRO ™ 染色
1
2

4
标记
1 2 3 4
裂解液成分
荧光扫描
pH
染料保质期
1 2 3 4
23 2-D DIGE Training Course
标准的 染料: 肽 比率下, 每个蛋白分子的一个 赖氨酸被标记 即使在 染料: 肽 比率高时, 其他氨基酸也未被 标记
最小标记荧光染料仅特异性标记赖氨酸残基
9 2-D DIGE Training Course
总结— 特点与优势
• 分子量/电荷匹配 • 一个正电荷 • 高特异性的最小标记法 • 染料间光谱不重叠 不同荧光染料标记后蛋白在 胶图上位置相同 标记后不改变蛋白的PI，不 影响IEF 每种蛋白在胶图上只呈现一 个蛋白点 高清晰度信号 可用于最小标记 标记、电泳、扫描过程信号 淬灭少 在IEF过程蛋白的标记不受影 响
Lysis
buffer
4 % CHAPS 7 M 尿素 2 M 硫脲
NO
伯胺基团 (e.g. IPG buffer)
NO
硫醇基 (e.g. DTT)
12 2-D DIGE Training Course
尿素、硫脲溶液中抽提蛋白
2500000
8 M 尿素
7M urea + 2M thiourea 8M urea
protein
NHS 官能团
400pmol 染料 标记50μ g蛋白
最小标记： 1-2 % 的蛋白质被标记 每个蛋白上仅有一个赖氨酸被标记
3 2-D DIGE Training Course
灵敏度
Cy2 Cy3 Cy5 530+/-0.1 580+/-15 670+/激发光 (nm) 488+/- 0.1 633 +/-0.1 发射光(nm) 15 520+/-20
Experiments shown by kind permission of AstraZeneca
7 2-D DIGE Training Course
结果
1:5 1:80
1:200
染料: 肽 摩尔比 未标记的肽 标记1个赖氨酸的肽
8 2-D DIGE Training Course
结论—特异性标记赖氨酸
5 2-D DIGE Training Course
线性动态范围—4个数量级
rfu
ng
Cy5 标记的转铁蛋白 1-D SDS-PAGE
6 2-D DIGE Training Course
特异性实验
CGYGPKKKRKVGG 合成肽 含4 赖氨酸, MW = 1377
标准的最小标记法进行标记
100 pmol 荧光染料标记0.6-25 ug 合成肽 MALDI-TOF对结果分析
10 2-D DIGE Training Course
• 高灵敏度、高亮度
• 稳定耐光 • pH环境中 稳定
• 2-D DIGE Fluor最小标记染料特性 • 标记流程 • 标记效率测试
11 2-D DIGE Training Course
Step 1 – 裂解
30 mM Tris pH 8.5
2000000
7 M 尿素, 2 M 硫脲
rfu
1500000
1000000
500000
0 0 10 20 30 40 50 Transferrin (ng) 60 70 80 90 100
Transferrin (ng)
13 2-D DIGE Training Course
Step 2 – 蛋白抽提
10 mM 1μ L 赖氨酸 淬灭
涡旋混匀，离心
淬灭反应：冰上、暗处、15min 标记蛋白可稳定储存 3 个月 at - 70 ºC
18 2-D DIGE Training Course
Dos and don’ts
标记前检测 pH
标记范围 pH 8.0-9.0
裂解液中可含尿素和硫脲
裂解液中成分不能含有伯胺和硫醇基团
2-D DIGE 荧光的标记原理
与试验流程
2-D DIGE 荧光染料 最小标记法
• 2-D DIGE Fluor最小标记染料特性
• 标记流程
• 标记效率测试
2 2-D DIGE Training Course
标记反应 Dye+
O O O N O
+H 3N-
protein
Dye+
O
N H
pH 8.5
参照说明书附录了解干扰 or 与标记不兼容 的试剂
19 2-D DIGE Training Course
• 2-D DIGE Fluor最小标记染料特性 • 标记流程 • 标记效率测试
20 2-D DIGE Training Course
何时进行1D标记效率测试？
• 新的样品
•
•
使用新试剂，与DIGE的兼容性未知
肽比率高时其他氨基酸也未被标记?最小标记荧光染料仅特异性标记赖氨酸残基92ddigetrainingcourse总结特点与优势?分子量电荷匹配?一个正电荷?高特异性的最小标记法?不同荧光染料标记后蛋白在胶图上位置相同?标记后不改变蛋白的pi不影响ief?每种蛋白在胶图上只呈现一?高特异性的最小标记法?染料间光谱不重叠?高灵敏度高亮度?稳定耐光?ph环境中稳定?每种蛋白在胶图上只呈现个蛋白点?高清晰度信号?可用于最小标记?标记电泳扫描过程信号淬灭少?在ief过程蛋白的标记不受影响102ddigetrainingcourse?2ddigefluor最小标记染料特性?标记流程?标记效率测试2ddigetrainingcourse11lysisb30mmtrisph854chaps尿素step1裂解buffer7m尿素2m硫脲no伯胺基团eg
试剂的浓度超出推荐范围
•
试剂影响标记效率
21 2-D DIGE Training Course
标记效率测试试验
• 将标记样品进行1-D gel • 用E.coli 裂解液作为阳性对照。 • 每个标记做三个梯度
• 用ImageQuant软件定量分析
cy2
cy3
cy5
Control
22 2-D DIGE Training Course
Step 4 – 蛋白标记
• 打开染料前平衡到室温，离心使粉末落至
管底部 • DMF 溶解终浓度1 mM（5nMol-5uL） • 新鲜DMF，开封后3个月使用 • 蜗旋 & 离心 • 1 mM 染料储液 暗处-20 ºC 稳定储存2个
月
16 2-D DIGE Training Course
Step 4 – 蛋白标记
1. 配制染料工作液 (400 pmole/uL) 染料工作液暗处 -20 ºC 储存1 week
2. 染料工作液加入蛋白溶液
400 pmole 染料标记 50 ug 蛋
白
涡旋混匀， 离心 3. 标记反应：冰上、暗处、30min
17 2-D DIGE Training Course
Step 4 – 蛋白标记