Western blot 实验原理和实验步骤 PPT

Western Blot基本原理
WesternBlot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，
“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。SDS-PAGE可对蛋白质
样品进行分离，转移到固相载体——例如PVDF膜上。固相载体可
以吸附蛋白质，并保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
转移后的PVDF膜就称为一个印迹（blot），用蛋白溶液（如
成带。
第二步：把凝胶中已分成条带的蛋白质转移到一种固相支持物上， 用得最多的材料是硝 酸纤维素膜(NC 膜)和 PVDF 膜， 蛋白转移的方法多用电泳转移 （转移电泳） ，它又有半 干法和湿法之分，电转移主要方法有垂直的槽式和水平的半干式两种。
第三步：是用自特异性的抗体检测出已经印迹在膜上的所要研究的相应抗原。免疫检测 的方法可以是直接的和间接的。现在多用间接免疫酶标的方法，在用特异性的第一抗体杂 交结合后，再用酶标的第二抗体（碱性磷酸酶（知AP）或辣根过氧化物酶（HRP）标记的 抗第一抗体的抗体）杂交结合，再加酶的底物显色或者通过膜上的颜色或 X 光底片上暴光 的条带来道显示抗原的存在。该技术被广泛应用于蛋白表达水平的检测中。
半干转移步骤
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（1）从阳极（下）到阴极（上）方向依次：滤纸、PVDF膜、凝胶、滤纸，
呈三明治样。在加有转膜液的盘里放入转膜用的夹子、滤纸和浸过的膜。
（2） 将阳极（下）打开使保持水平。在上面垫两张厚滤纸，用玻棒来回擀
几遍以擀走里面的气泡。
（3） 轻轻将小玻璃板撬掉，再将浓缩胶轻轻刮去，要避免把分离胶刮破。
转膜
在电流的作用下，使蛋白质从胶转移至固相载体（膜）上。
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膜的选择：印迹中常用的固相材料有NC膜、DBM、DDT、尼龙膜、 PVDF等。我们选用PVDF（聚偏二氟乙烯），其具有更好的蛋白吸附、
物理强度，以及具有更好的化学兼容性。有两种规格：Immobilon-P
（0.45um）和Immobilon-PSQ(0.2um for MW<20kDa)。
5%BSA或脱脂奶粉溶液）处理，封闭PVDF膜上的疏水结合位点。
用目标蛋白的抗体（一抗）处理PVDF膜——只有待研究的蛋白质
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才能与一抗特异结合形成抗原抗体复合物，这样清洗除去未结合 的一抗后，只有在目标蛋白的位置上结合着一抗。用一抗处理过
的PVDF膜再用标记的二抗处理，二抗是指一抗的抗体，如一抗是
上样与电泳
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将制备好的样品溶解后，把蛋白样品直接上样到SDS-PAGE
胶加样孔内即可。浓缩胶用70V电压，当样品至分离胶时，
用120V电压，至溴酚兰跑到底时停止电泳。
电泳时常遇到的问题 ︶ 条带呈笑脸状，原因：凝胶不均匀冷却，中间冷却不好。 ︵ 条带呈皱眉状，可能是由于装置不合适，特别可能是凝 胶和玻璃挡板底部有气泡，或者两边聚合不完全。 拖尾：样品溶解不好。 纹理（纵向条纹）：样品中含有不溶性颗粒。 条带偏斜：电极不平衡或者加样位置偏斜。 条带两边扩散：加样量过多。
槽式湿转法 将凝胶和固相基质夹在滤纸中间，浸泡在转移装置的缓冲液中。
-/海绵/滤纸/胶/膜/滤纸/海绵/+
半干转移法
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即将凝胶夹层组合放在吸有转印缓冲液的滤纸之间，通过滤纸上吸附
的缓冲液传导电流，起到转移的效果。因为电流直接作用在膜胶上，
所以其转移条件比较严酷，但是其转移时间短，效率高。
-/滤纸/胶/膜/滤纸/+
小心剥下分离胶，并根据胶的大小裁剪同样大小PVDF膜，剪去膜的左上角作为
标记。如果样本多，同时做几张膜，可用铅笔在膜下角标ABCD或1234，这样可
以分出膜的正反和加样顺序。
注意：裁滤纸和膜时一定要戴手套，因为手上的蛋白会污染膜。
将裁好的PVDF膜置于甲醇中浸2min才可使用。
3 Western blot 流程图
Western Blot一般流程
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蛋白样品的制备 SDS聚丙烯酰胺
凝胶电泳百度文库
转膜 封闭 一抗杂交 洗膜 二抗杂交 洗膜 底物显色
蛋白样品的制备
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1、细胞的处理：1、细胞计数，取5*10^4/well，500g离心5min。加入200ul PBS混匀，500g离心5min。去掉废液加入15ul PBS 再加入5ul 5Xloading buffer， 100C煮沸10min，冰上放置5min，稍离心。
从鼠中获得的，则二抗就是抗鼠IgG的抗体。处理后，带有标记
的二抗与一抗结合形成抗体复合物可以指示一抗的位置，即是待
研究的蛋白质的位置。
组成
蛋白免疫印迹（Western blotting 或 Immunoblotting）一般由凝胶电泳、样品的印
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迹和免疫学检测三个部分组成。
第一步:是做 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳，使待测样品中的蛋白质按分子量大小在凝胶中分
2、分泌蛋白的提取：取15ul细胞上清，加入5ul 5Xloading buffer，100C煮沸 10min，冰上放置5min，稍离心。
大家学习辛苦了，还是要坚持
继续保持安静
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
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分离胶浓度与蛋白分离范围
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制胶
1）装好架子，固定好玻璃板。
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2）注水试漏。 3）倒水，甩干，用滤纸吸净残留水份。
Western blot 实验原理和实验步骤
为什么要做蛋白质印迹实验？
研究一些体外的蛋白质分子，寻找目的蛋白是否存在样品当中 蛋白质的表达情况，上调或下调表达，在不同的样品中，样品之间的表达差异性。
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Western blot 基本原理
蛋白免疫印迹的组成
Western blot 一般流程
Western blot 常见问题分析
4)按照下面配方配制12%分离胶。一般1.5玻璃板需胶6.5-
7ml，1.0玻璃板需胶4.5ml。
5)将胶慢慢倒入，防止有气泡产生。
6）在胶上面加入一层蒸馏水，可以将胶里的气泡压出、
将胶面压平并防止顶层胶风干。
7)待分离胶凝集后（至少20度，30min），配制浓缩胶5％。
制胶过程注意事项
6 操作时要使两玻璃对其，以免漏胶 加完分离胶后，加水液封时要很慢，否则胶会被冲变型。 灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度。 操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。 分离胶充分凝固就倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。 插梳子时要使梳子保持水平。