丝状真菌瑞氏木霉生产重组蛋白的分子生物学研究进展(一)关键词：瑞氏木霉；遗传改造；基因定位置换整合；重组蛋白摘要瑞氏木霉是自然界中普遍存在并有重要经济意义的一种丝状真菌，作为工业生产菌株生产多种水解酶类已有多年历史。
本文报道了用基因工程手段对瑞氏木霉进行遗传改造，构造具新性状的重组菌株，用以过量产生同源和异源蛋白类物质的分子生物学研究进展。
包括利用CBHI 基因的强启动子在瑞氏木霉中过量表达瑞氏木霉内切葡聚糖酶、小牛凝乳蛋白酶、人抗体片段、哈茨木霉几丁质酶、Hormoconis葡萄糖淀粉酶等同源和异源蛋白以及利用在葡萄糖上强表达的启动子生产纤维素酶等遗传工程进行情况。
关键词瑞氏木霉；遗传改造；基因定位置换整合；重组蛋白1前言多年以来，丝状真菌及其产生的酶类已广泛用于食品和食品加工业。
由于其在工业上的巨大应用潜力，促进了大规模发酵工程、下游加工工程和对菌株的遗传改造的发展，其结果有助于将丝状真菌进一步应用于当今的工业生产。
大多数情况下，自然发生的菌株产生我们所需蛋白的水平很低，以至不能在商业上加以利用。
因此，为了得到所需的目的蛋白，需对自发菌株进行遗传改造。
随着分子遗传技术和真菌基因转移系统的发展，利用基因工程方法对丝状真菌进行有目的的遗传改造，已以成为可能。
丝状真菌瑞氏木霉（Trichodermareesei）是多细胞的真核微生物，其作为工业菌株用于生产分解不同植物材料的酶类，包括纤维素酶、半纤维素酶、蛋白酶、淀粉酶等，已有多年历史。
瑞氏木霉所产生的一种主要的纤维酶一纤维二糖水解酶I（cellobiohydrolase1），由单拷贝基因编码，其产量可达瑞氏木霉胞外分泌性蛋白总量的50%1]。
由此可见，cbh1启动子是很强的启动子。
因此在对瑞氏木霉的遗传改造中，常利用cbh1的启动子与终止子序列构建载体，并利用cbh1的前导肽序列引导重组蛋白进行分泌性表达。
瑞氏木霉具有极好的合成蛋白和分泌蛋白的能力；并具有真核的分泌机制，很可能还具有与哺乳动物系统相似的蛋白修饰性能，如：高甘露糖型和N-糖基化2]等。
由于瑞氏木霉具有以上优良性能，再加之其工业化规模发酵条件已比较成熟，这些都促进了对瑞氏木霉的遗传改造，为同源或异源分泌性蛋白的产生提供了一条行之有效的途径。
瑞氏木霉不仅具有适于蛋白生产的诸多优点，且对人没有毒性，在产酶条件下也不产生真菌毒素和抗生素。
近年来的实践表明，经过基因工程手术改造的瑞氏木霉重组菌株是安全无害的3]。
2过量生产同源蛋白一纤维素酶与木聚糖酶的生产纤维素酶广泛用于淀粉加工、谷物酒精发酵、麦芽制备和酿造、动物饲养以及青贮饮料加工、果汁和蔬菜汁的提取等诸多方面，近年来被应用于纺织、造纸、制浆等工业。
由于纤维素酶应用范围极其广泛，使得开发和改造纤维素酶生产菌株具有极强的现实意义。
瑞氏木霉具有降解纤维素的完全酶系，所分泌的纤维素酶混合物通常包括内切葡聚糖酶等多种酶活力。
1990年，Harkki等报道，通过基因定位置换整合使编码CBHI的基因失活，结果EGI的产量提高，不再产生CBHI4]（见图1）。
1993年，Karhunen 等报道，将编码EGI的基因置于强启动子cbh1的控制之下，用此表达盒替换染色体的cbh1位点之后，EGI的产量是通常强纤维素分解菌所得CBHI量的2倍或者与其一样多5]。
其他人也曾报道过类似的情况。
瑞氏木霉的一个或几个纤维素酶基因经基因位定位置换整合而失活6，7]。
这些菌株提供了一系列令人感兴趣的新酶混合物，即可用于工业生产，又可用于研究不同酶组分对各种纤维底物的分解作用。
但是，基因失活和基因置换的方法，可能不适用于需极高特异和必须去除非必需酶活力的酶制剂。
这是因为用于酶生产的培养基，可能会诱导产生大量其它水解酶类。
而要使编码这些酶的基因都失活，在实际当中几乎是不可能的。
为了防止这类问题的产生，Goldman(1992)、Schindler（1993）Nakari(1995)等人先后报道从瑞氏木霉中分离了非纤维素酶基因的启动子，包括pgk启动子、pkiA启动子、tefl启动子和一个在葡萄糖培养基上强表达但未知的cDNA1的启动子，这些启动子可以在葡萄糖培养基上启动合成所需要的纤维素酶，产生的酶制剂基本上没有其它纤维素酶活力。
在cDNA1启动子控制下所合成的纤维二糖水解酶和内切葡聚酶产量最高可达50-100mg/L，占分泌蛋白总量50%以上8]。
1996年，Kurzatkowski等构建了能在葡萄糖培养基上生长的瑞氏木霉的重组菌株，其携带的木霉糖酶Ⅰ或木霉糖酶Ⅱ结构基因是在内源丙酮酸激酶基因（pkil）表达信号的控制之下表达。
通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫染色，发现这两种类型的转化体在葡萄糖培养基上生长时，能分别分泌出木霉糖酶Ⅰ和木霉糖酶Ⅱ。
对于木霉糖酶来说，最好的转化体产生的特异性酶活力为76U/mg；而对于木霉糖酶Ⅱ来说，则为145U/mg；都大大高出于自发菌株所产生的26U/mg9]。
3异源蛋白的生产3.1真菌酶蛋白类将TrichodermaharzianumP1染色体上的内切几丁质酶基因分离，导入丝状真菌瑞氏木霉，并在cbh1启动子过量表达。
出发菌株瑞氏木霉RutC-30不具有任何内切几丁质酶活力。
T·harzianum内切几丁质酶基因编码区前的区段的瑞氏木霉中能正确发挥功能。
摇瓶培养产生130mg/L 有活力的几丁质酶，比T·harzianum产生的内切几丁质酶活力提高大约20倍。
瑞氏木霉RutC-30似乎能忍受内切几丁质酶具有抗植物病原真菌的活力10]，已被用于植物病源真菌的生物防治。
另据B.Cubero等（1997）报道，在瑞氏木霉组成型启动子ki和cbh2终止子的控制之下构建了两种载体，分别含有T·harzianum的基因chit33和bgn16.2的开放阅读框（chit33编码一种内切几丁质酶，bgn16.2编码一种外切葡萄糖淀粉酶），并获得了稳定的拷贝转化体。
对转化体bng16.2来说，整合到基因组中的基因拷贝数与mRNA和蛋白质的积累量和在葡萄糖阻遏或几丁质酶诱导条件下的胞外牧特性酶活力之间均呈正相关。
该菌株比野生型菌株能更迅速地抑制病原真菌的生长。
对转化体chit33来说，在葡萄糖阻遏的条件下。
对转化体chit33来说，在葡萄糖阻遏的条件下，其产生的胞外几丁质酶活力是野生菌株的10倍11]。
JoutsjokiVV(1994)报道，构建了两种一步基因置换载体。
一种载体含有Hormoconisresinae葡萄糖淀粉酶P的基因组基因（gamP），另一种含有相应的cDNA，都在瑞氏木霉cbh1启动子控制下表达。
这些载体经转化后置换瑞氏木霉的cbh1基因。
在这两种载体中，cbh1启动子都能精确地连接到gamP蛋白质编码区上游，指导瑞氏木霉分泌出有活力的葡萄糖淀粉酶P（GAMP）。
这表明gamP基因中内含子序列在瑞氏木霉中得到了正确的加工。
研究结果表明，含有gamPcDNA的最优转化体能分泌大约700mg/L有活力的GAMP，是在H.resinae中产量的20倍12]，但chb1基因被gamP基因组基因置换的瑞氏木霉转化体，所分泌的有活性的GAMP要多于含有3拷贝cDNA的转化体。
对瑞氏木霉分泌H.nisresinae葡萄糖淀粉酶P的研究结果表明，自然状态未成熟GAMP 的N端延伸部分可以在瑞氏木霉中作为一种有效的分泌信号，所产生的胞外葡萄糖淀粉酶活力高于以CBHI信号肽作为分泌信号时的情况13]。
酵母基因在瑞氏木霉中表达的一例是：酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae）DPM1基因（编码甘露糖基磷酸多萜醇合成酶）的编码区插入到pLMRS3质粒中，在瑞氏木霉pki启动子和cbh2终止子控制下表达。
在pFG1质粒（含有瑞氏木霉pyr4基因）存在下，与pLMRS3质粒一起对瑞氏木霉的一种pyr4阴性突变株TU-6进行共转化。
然后筛选pyr4阳性转化子，得到4株多拷贝DPM1基因串联整合的稳定转化子。
与受体菌株TU-6相比，转化子的甘露糖基磷酸多萜醇合成酶活力提高了15-19倍，分泌的蛋白总量也提高了4倍14]。
除以上蛋白外，被表达的真菌蛋白还包括肌醇六磷酸酶等。
这些酶都是在cbh1启动子下表达，摇瓶培养产量达100mg/L水平。
发酵培养中，产量为每升几克。
在cbh1启动子的控制之下，来自担子菌纲的真菌Phlebiaradiate的氧化还原酶（如：漆酶）的产量也达到中等水平3.2哺乳动物蛋白瑞氏木霉已被用于牛凝乳蛋白酶的生产。
利用cbh1启动子和终止子，通过共转化外源基因与来自构巢曲霉（Asp.nidulans）的amdS基因一起引入乙酰胺非利用型菌株。
测量到的凝乳酶mRNA和分泌出的凝乳酶的量要比相应的cbh1mRNA和CBHI的量低1-2个数量级。
这表明牛凝乳蛋白酶在瑞氏木霉中的表达受到了转录限制。
但是，所获得的40mg/L的水平，与典型的在构巢曲霉素中的2-10mg/L的最初水平相比，还是一个可喜的进步15，16]。
另外，据文献报道，利用其它丝状真菌生产的几种人体蛋白是：表皮生长因子（hEGF），生产激素（hGH），白细胞介素6，组织血纤维蛋白溶酶原激活因子（htPA）等。
Fab分子是由抗体完整的轻链和重链的Fd部分，由链间二硫链连接在一起。
这种分子曾由木霉成功地生产出来，并用于研究其分泌过程。
利用cbh1启动子和信号序列，分别构建了表达轻链和重链的表达盒。
首先构建的是只产生轻链的菌株，然后用2种不同的重链表达载体进行再转化。
这两种载体分别指导Fd链或者与CBHI核心-连接区融合在Fd链的表达。
只产生轻链的菌株分泌的轻链水平很低（0.2mg/L）。
对前一种重链载体的转化体来说，在摇瓶培养中，分泌的有可能的Fab 分子为1mg/L。
在具有cbh1-Fd融合结构的转化体菌株中，观察到产量有显著增长。
最优菌株能分泌40mg/L具有免疫活力的CHBI-Fab融合蛋白。
在发酵培养中，水平增长到150mg/L.然而，没有融合到CBHI上的Fab分子，水平仍为1mg/L。
有趣的是，一种未知的木霉蛋白酶在CBHI-Fab融合蛋白的N-端特异去除2个氨基酸，能产生少量的Fab分子。
释放的Fab分子表现出免疫活性和对抗原的亲和性，而CBHI-Fab 分子的免疫活性要低5-12倍。
对分离到的抗体链进行定量测定表明，分泌出的所有轻链都和重链组装在一起。
CBHI-Fab产物的上清液中，含有显著数量（800mg/L）的CBHI核心-连接区肽，它们来自CBHI-Fd 融合分子。
这样，CBHI-Fd的产生是非常有效的（大于800mg/L），但其中只有少量（40mg/L）装配成有功能的CBHI-Fab分子（或者，释放的Fab分子）。
