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引物设计实例分析(多图)

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引物设计及测序结果分析精PPT课件

引物设计及测序结果分析精PPT课件
第36页/共57页
Primer Premier 5.0使用介绍 Load sequence
Preimer Premier 启动界面
第37页/共57页
引物设计界面
Original sequence
Sequence name
Choose a function
Use these two button to translate the DNA seq to a protein seq or a
第20页/共57页
3、DNA和RNA的微量分析：
PCR技术高度敏感，对模板ＤＮＡ的含量要求很 低，是DNA和ＲNA微量分析的最好方法。实际工 作中，一滴血液、一根毛发或一个细胞已足以满足 PCR的检测需要，因此在基因诊断方面具有极广阔 的应用前景。
4、基因转录水平检测
RT-PCR可检测不同组织或细胞中基因的转录水 平.
❖ PCR不仅可以用于基因的分离、克隆和核苷酸序列分 析，还可以用于突变体和重组体的构建，基因表达调 控的研究，基因多态性的分析，遗传病和传染病的诊 断，肿瘤机制的探索，法医鉴定等诸多方面。
第2页/共57页
PCR技术原理
以拟扩增的DNA分子为模板，以一对分别与模 板5′末端和3′末端互补的寡核苷酸片段为引 物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的 机制沿着模板链延伸直至完成新的DNA合成，重 复这一过程，即可使目的DNA片段得到扩增。
第39页/共57页
引物搜索选项设定
引物类型
搜索模式
5’引物位置范 围
3’引物位置范 围
产物大小范 围
第40页/共57页
引物长度
搜索结果
28对引物
引物分值 100分为满分
每对引物的信 息

《PCR引物设计》课件

《PCR引物设计》课件

04
pcr引物的应用与案例分 析
pcr引物在基因克隆中的应用
01
pcr引物用于基因克隆的目的是为了获得目的基因的序列信息， 进而进行后续的基因功能和表达研究。
02
设计特异性引物，通过pcr技术，从基因或基因组中筛选出目的基因。
引物设计需考虑基因序列的特异性、扩增效率和避免非特异性
03
扩增等因素。
引物特异性优化
避免引物间的互补
引物之间不应存在互补序列，以避免形成引物二聚体或发夹 结构。
避免引物与模板扩增 和产物。
引物扩增效率的优化
引物与模板的匹配度
引物的3'端应与模板完全匹配，以提 高引物的扩增效率。
引物之间的匹配度
两个引物之间应有良好的匹配度，以 保证PCR反应的顺利进行。
引导合成
引物作为合成子链的起点，通过与 DNA聚合酶的结合，引导合成与 模板互补的DNA链。
决定产物长度
引物的设计决定了PCR产物的长度 ，通过选择合适的引物，可以控制 产物的大小和特异性。
pcr引物设计的基本原则
特异性
长度和序列
引物应与模板DNA具有高度的特异性，避 免与其他非目标DNA序列发生非特异性结 合。
pcr引物的未来发展方向与挑战
引物设计的自动化
随着生物信息学的发展，未来引物设计 可能更加自动化，减少人工干预和误差
。
标准化和质量控制
建立引物设计的标准化流程，加强引 物设计的质量控制，确保实验结果的
可靠性和可重复性。
新型引物设计策略
针对特定需求，开发新型引物设计策 略，提高PCR反应的特异性和灵敏度 。
引物灵敏度测试
03
测试引物在不同模板浓度下的扩增效率，选择灵敏度较高的引

实例图解简并引物设计 共25页

实例图解简并引物设计 共25页

碱M
基B
代 码
D N
碱基 代码 A, G Y G, T S A, C W G, C, T V A, G, T H A, G, C, T
碱基 C, T G, C A, T A, G, C A, C, T
3. 质量评估
•（1）参数评估
将初步得到的引物序列，粘贴入Oligo Calc 的文本框内， 按下“Calculate”按钮，得到引物的相关参数，如：长 度、GC 含量、Tm 值等信息。
马铃薯Y 病毒（Potato virus Y，PVY）是侵染马铃薯、
烟草、辣椒等茄科作物并造成严重危害的病毒之一，广 泛分布全球各马铃薯种植区。RT-PCR 技术具有高度的特 异性和灵敏性等特点，已经成为 PVY 检测最常见的方法。 但由于PVY 株系分化严重，不断有新的重组株系产生， 单一的特异性引物无法适应PVY 不同株系的检测需求， 需要设计一对简并引物以能够满足生产上的检测需求。
八、详细图解
1. 序列准备： •（1）GenBank 下载PVY 全基因组序列； •（2）由于基因序列比较大，且数量多，推荐用MAFFT 多重序列比对； •（3）扩增片段区域选择，CP 基因长度及位置如下图所示：
• 先将光标定位在第一条序列任意位置，然后在左下角"Site"处直接输 入 CP 基 因 上 游 分 界 点 位 置 （ 8391 ） 后 回 车 。 接 着 点 击 “Speicaes/Abbrv”和8391 那一列的交界点时按下键盘上“Shift” 不放，移动光标到“1”那一列，此时点击鼠标右键“Delete”删除 冗余序列。
• PS ： 是 否 位 于 密
码子的第3 位，可
以
通
过
“ Tranlated

引物设计实例分析(多图)

引物设计实例分析(多图)

引物设计基本原则引物长度（primer length）产物长度（product length）序列Tm值（melting temperature）G+C含量（composition）引物二聚体及发夹结构（duplex formation and hairpin）阅读框1. 引物的长度一般为15-30bp,常用的是18-27bp,但不能大于38,因为过长会导致其延伸温度大于74℃，即Taq酶的最适温度2. 产物的长度扩增片段长度为100~600碱基对。

3. Tm值引物的Tm值一般控制在55-60度，尽可能保证上下游引物的Tm值一致，一般不超过2度。

如果引物中的G+C含量相对偏低，则可以使引物长度稍长，而保证一定的退火温度。

Tm=2（A+T）+4（C+G）4. 引物的GC含量有效引物中（G+C）的比例为40-60%,过高或过低都不利于引发反应。

上下游引物的GC含量不能相差太大。

5. 引物自身引物间3‘端的互补、二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败任务用绿色荧光蛋白（GFP）标记蛋白NR1引物要求PCR扩增GFPGFP两边添加BamHI酶切位点保证NR1的阅读框不改变第一步：扩增GFP基本序列第二步：GC比值；Tm值第三步：酶切位点第四步：阅读框第五步保护序列Primer1: 5' GCGGggatccTATGGTGAGCAAGGGCGAGGA Primer2: 5' GCGCggatccctCTTGTACAGCTCGTCCA TGCC记得当初写本科论文，感到不知道讨论什么问题好。

愣是写了一大段的PCR条件摸索的讨论。

后来PCR成为实验最基本的一步了，但是发现在PCR中还是有许多需要注意的地方。

PCR的第一步就是引物设计了。

引物设计需要注意的地方很多，在大多数情况下，我们都是在知道已知模板序列时进行PCR扩增的。

在某些情况比如构建文库的时候也会在不知道模板序列的情况下进行设计。

这个时候随机核苷酸序列就与模板不是完全匹配。

第五章PCR引物设计-精选.ppt

第五章PCR引物设计-精选.ppt
ΔG值反映了引物与模板结合的强弱程度
引物与模板应具有较高的结合能量，这 样有利于引物与模板序列的整合。因此， 5´端与中间段的ΔG值应较高，引物3’端
的△G 值过高，容易在错配位点形成双链结构 并引发DNA 聚合反应。
算法：邻近热力学
例：ACGG 和其互补 TGCC 结合的ΔG： ΔG(ACGG)= ΔG(AC)+ ΔG(CG)+ ΔG(GG)
同时应预测将扩增的片段单链是否形二 级结构。如这个区域单链能形二级结构， 就避开它。如这一段不能形二级结构， 那就可以在这一区域设计引物。
若不能避开这一区域时，用7-deaza-2′脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮 助的。
1、引物设计的原则
① 引物要跟模板紧密结合； ② 引物与引物之间不能有稳定的二聚体或发夹
引物设计要点（3）
引物的Tm值。Tm值最好接近72℃。过高（>72℃）
或过低（<37℃）都不利于引发反应。上下游引物的 Tm 不能相差太大。
长度为25mer以下的引物：Tm = 4℃(G + C)+ 2℃(A + T)
对于更长的寡聚核苷酸， Tm = 81.5 + 16.6 x Log10[Na+] + 0.41 (%GC) –
因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增特 异性与效率。
引物的5′端
引物的5′端限定着PCR产物的长度，它对扩增特异性 影响不大。 引物5′端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、 地高辛、Eu3+等；引入蛋白质结合DNA序列；引入 突变位点、插入与缺失突变序列和引入一启动子序列 等。
引物的GC含量一般为45-55%，过高或 过低都不利于引发反应。上下游引物的 GC含量不能相差太大。

手把手教你设计引物（图文并茂）

手把手教你设计引物（图文并茂）

手把手教你设计引物（图文并茂）不知不觉几年下来自己也快毕业了，感谢丁香园这些年来的帮助。

没有什么可回报的东西，就发个帖教教新人如何设计引物吧，尽量做到手把手的教，图文并茂。

引物设计的帖子不少，以前很多战友会推荐Oligo、PrimerPremier、DNA man等等软件。

这些软件设计完最后还是要去BLAST比对下，所以我教大家一种易懂实用的在线设计方法，觉得好的话请投个票。

就以人的PTEN基因为例，首先你要找到他的基因序列，如果你要用的是cDNA，就找它的mRNA序列。

如果你要做的是DNA，就找DNA的序列。

以cDNA为例，普遍的一种方法是上PUBMED中GENE栏搜索找到cDNA那栏，但PUBMED导出序列不太方便，我介绍个网站/index.html1. 输入目的基因，进入2.在左侧栏选择TRANSCRIPT，选择后进入3. 选择PTEN-001中的TRANSCRIPT进入，点击左侧cDNA4. 然后点击CONFIGURE THIS PAGE进入设置你要显示的内容5. 除了第一栏SHOWEXONS选择YES外，其他的都选择NO，然后取个名字保存SAVE CONFIGURATION AS6. 然后在左侧栏点击DOWNLOADVIEW AS RTF可下载你要的cDNA序列，这个文件可以用WORD打开，不同的颜色代表一个外显子间断下载后打开的WORD7. 然后根据可以根据你感兴趣的序列设计引物了，比如我在分别在第6和第7外显子分别设计上下游引物。

选取并复制第6和第7外显子序列8. 登陆/tools/primer-blast/，粘贴这段序列，设置好RANGE和PCR产物的大小，然后在下面点击GET PRIMERS，可以在线设计并比对引物9.最后选择一个比较特异性的引物，条带大小要尽量单一，其他的基因序列尽量不要比对到。

引物设计不求人！手把手教你设计RT-qPCR引物！

引物设计不求人！手把手教你设计RT-qPCR引物！

引物设计不求⼈！⼿把⼿教你设计RT-qPCR引物！RT-qPCR 全称 Real-time polymerase chain reaction, 即实时聚合酶链锁反应，是⼀种在DNA扩增反应中，以萤光染⾊剂检测每次聚合酶链锁反应（PCR）循环后产物总量的⽅法。

OK～这⾥对RT-qPCR的原理，应⽤及数据分析就不再赘述了，因为今天我们主要讲的是如何设计出好的PCR引物。

相信科研⼩伙伴们都已经⽤过Pubmed来设计引物了，基本就是 “傻⽠式操作”就解决了！但这⾥还需提醒⼩伙伴们两点：1. 需跨越⾄少⼀个外显⼦连接（⼀般我们⽤来做RT的RNA都是通过Trizol抽提法分离出来的，为了避免基因组的DNA也有可能被扩增出来，就要⾄少跨越⾄少⼀个exon-exon junction 了）。

2. 不要忘记选对“物种”！（这⾥以⼈种⽰例）但是Pubmed设计出来的引物⼀般不尽如⼈意，⽐如说引物之间存在极⼤的互补性，3’端的互补重叠，形成引物⼆聚体等等。

因为⽤Pubmed设计引物本⾝能设置的参数条件就很少，所以它才是最简单的。

所以，今天我要给⼤家介绍两款实⽤的软件，Primer Premier 6.0 和 Oligo 7.0。

今天主要讲讲第⼀款，⾄于第⼆款，改天再聊啦！当然，这两款软件，要想⽤全功能版本，都是需要付费的哦！不过...，我们伟⼤的祖国有强⼤的某宝，这⾥就不多说了哈。

好了，我们进⼊今天的正题……（说了这么多废话，终于要进⼊正题了！！！）⾸先，我们选⼀个基因举例来说，PPARA，⾄于为什么会选这个基因呢？因为啊，PPAR⽬前是肿瘤学研究中的⼀个“明星基因”，它的全称是Peroxisome proliferator-activated receptor, 即过氧化物酶体增殖物激活型受体，⽬前发现有三种亚型，PPAR a，PPARbeta/delta，PPAR r。

好吧…….听着好复杂的样⼦啊！总之，管它到底是什么呢，下⾯来说说它的引物如何设计。

如何根据要求自己设计PCR引物

如何根据要求自己设计PCR引物

如何根据要求自己设计PCR引物1PCR引物设计课堂笔记○PCR这个名词大家都不陌生，但实际操作时我们常说的引物设计到底是怎么回事呢？今天我就来给大家用实例演示一下哈。

首先，我们要知道引物设计的目的是为了找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。

引物设计是PCR的关键，附上PCR的基本流程图：○引物设计的原则：1.引物长度：一般为15-30bp，常用的是18-27bp，但不能大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，即Taq酶的最适温度。

2.引物的特异性：引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%或有连续8个互补碱基同源。

3.序列Tm值：引物的Tm值一般控制在55-60度, 尽可能保证上下游引物的Tm值一致,一般不超过2度。

退火温度=4×(G+C)+2×(A+T)-(5～8)4.G+C含量：有效引物中(G+C)的比例为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。

上下游引物的GC含量不能相差太大。

5. 引物的3′端：引物的延伸是从3′端开始的，不能进行任何修饰；引物3’端的碱基一般不用A，因为A在错误引发位点的引发效率相对比较高；引物间3’端的互补、二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败6.引物的5′端：引物的5′端限定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。

因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。

引物5′端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白质结合DNA序列；引入突变位点、插入与缺失突变序列和引入一启动子序列等。

下面以实例操作演示一下加酶切位点时如何自己设计引物：2用绿色荧光蛋白(GFP)标记蛋白NR1○简单点说，就是现在我们要把Plasmid 2中GFP基因片段添加到Plasmid 1中的NR1基因片段上，但是Plasmid 2中GFP基因片段本身并没有BamHⅠ这个酶切位点，也就说我们要在引物设计中人为地把BamHⅠ这个酶切位点的序列添加给GFP基因片段，这样PCR后得到的GFP基因片段就可以通过BamHⅠ这个酶切位点进入到Plasmid 1中，然后绿色荧光蛋白(GFP)就可以来标记蛋白NR1，达到我们之后实验中来观察蛋白NR1的目的，示意图见下。

Primer5设计引物------图文并茂一步步教你

Primer5设计引物------图文并茂一步步教你

1、打开后的界面如图。

2、点FILE---NEW—DNA SEQUENCE如图3、输入目的基因片段，可以复制后用ctrl+V键拷贝到栏内，后应加数个N以备后续设计时加酶切位点及保护碱基，如图所示。

输入目的基因片段，可以复制后用ctrl+V键拷贝到栏内，后应加数个N以备后续设计时加酶切位点及保护碱基，如图所示。

4、此主题相关图片如下：选中enzyme图标，将所选质粒上的多克隆酶切位点加入左栏此主题相关图片如下：选中OK键，5、分析目的基因中所含的酶切位点，选插入位点时就应排除这些酶此主题相关图片如下：6、选中primer图标，点S图标，edit primer,开始设计正义链。

此主题相关图片如下：7、软件默认引物为二五个碱基此主题相关图片如下8、可将鼠标点在设计框的3端从右向左删除7－9个碱基，保留16－18个配对即可此主题相关图片如下：9、在引物的5端加入选好的酶切位点并在其左侧加3个保护碱基，入该图加入HIND III 酶切位点及TTA保护碱基，完成后点analyze，认为可以后点OK。

此主题相关图片如下：10、选中左上角A图标，用鼠标拉动滑块将待选引物放至目的基因末端。

11、从3端删除7－9个碱基同正义链。

此主题相关图片如下：12、将酶切位点加在5端，应将产品目录所示的酶切位点序列从右至左加入（注意不要加反）如图加入BamH I酶切位点及CGC3个保护碱基。

完成后点analyze，认为可以后点OK。

此主题相关图片如下：13、最后分析结果如图，反义链的FALSE PRIMING可以不考虑，RATING表示引物评分也可以不考虑，主要看Tm值正义链和反义链相差不应超过3度。

GC含量不应超过60％此主题相关图片如下：14、该软件有个缺点，不能保存分析结果，只能选择打印此主题相关图片如下：15、如果设计RT-PCR检测的引物就如下所示，同上输入目的基因片段，选SEARCH图标，选择参数，一般选PCR primers---both—100至250个碱基，引物长短20＋/-2，search parametere 中的参数可以不选，为默认设置。

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设计的目的是在两个目标间取得平衡：扩增特异性和扩增效率。引物分析软件将试图通过使用每一引物设计变化的预定值在这两个目标间取得平衡。设计引用有一些需要注意的基本原理：
①引物长度
一般引物长度为18~30碱基。总的说来，决定引物退火温度（Tm值）最重要的因素就是引物的长度。有以下公式可以用于粗略计算引物的退火温度。
这里顺便提一下如果有什么技术给大家留下深刻影响，欢迎大家发email推荐给生物通。说不定你的推荐可以让它成为年度之星呢。
如果要加入额外的碱基总是或多或少会影响到整个PCR反应，比如在加入NotⅠ的酶切位点后整个引物的退火温度就会直线上升（它识别的是8个碱基，且全为GC），这样使另外一个引物的设计变得十分困难，因为一对引物间退火温度相差不宜太远。因此上面提到许多设计原则在实际应用中往往难以做到都符合。在碰到这些情况的时候，我们只能秉着“实践是检验真理的唯一标准”这一原则，要试一试才能知道能否行得通了。
⑧为了下一步操作而产生的不完全匹配
5’端对扩增特异性影响不大，因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5′端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白质结合DNA序列；引入突变位点、插入与缺失突变序列和引入一启动子序列等。额外的碱基或多或少会影响扩增的效率，还加大引物二聚体形成的几率，但是为了下一步的互补序列，否则引物自身会折叠成发夹状结构，这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。若用人工判断，引物自身连续互补碱基不能大于3bp。两引物之间不应该存在互补性，尤应避免3′端的互补重叠以防引物二聚体的形成。一般情况下，一对引物间不应多于4个连续碱基的同源性或互补性。
③退火温度
退火温度需要比解链温度低5℃，如果引物碱基数较少，可以适当提高退火温度，这样可以使PCR的特异性增加；如果碱基数较多，那么可以适当减低退火温度，是DNA双链结合。一对引物的退火温度相差4℃～6℃不会影响PCR的产率，但是理想情况下一对引物的退火温度是一样的，可以在55℃～75℃间变化。
④避免扩增模板的二级结构区域
c定向TA克隆添加尾巴
在T载体刚出的时候大家都拍手称赞，真是方便，哪个小子脑子这么聪明想出来的。但是后来人们发现TA克隆无法将片段定向克隆到载体中，所以后来Invitrogen推出了可以定向克隆的载体，它的一端含有四个突出的碱基GTGG。因此在PCR引物设计时也要相应的加上与之互补的序列，这样片段就可以“有方向”了。
选择扩增片段时最好避开模板的二级结构区域。用有关计算机软件可以预测估计目的片段的稳定二级结构，有助于选择模板。实验表明，待扩区域自由能（△G）小于58.6lkJ/mol时，扩增往往不能成功。若不能避开这一区域时，用7-deaza-2’-脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮助的。
⑤与靶DNA的错配
在引物长度小于20bp时：[4(G+C)+2(A+T)]-5℃
在引物长度大于20bp时：62.3℃+0.41℃(%G-C)-500/length-5℃
另外有许多软件也可以对退火温度进行计算，其计算原理会各有不同，因此有时计算出的数值可能会有少量差距。为了优化PCR反应，使用确保退火温度不低于54℃的最短的引物可获得最好的效率和特异性。
当被扩增的靶DNA序列较大的时候，一个引物就有可能与靶DNA的多个地方结合，造成结果中有多个条带出现。这个时候有必要先使用BLAST软件进行检测，网址：/BLAST/。选择Align two sequences (bl2seq)，如下图。
BLAST的使用方法也十分简单，如下图所示。
引物设计基本原则
引物长度（primer length）
产物长度（product length）
序列Tm值（melting temperature）
G+C含量（composition）
引物二聚体及发夹结构（duplex formation and hairpin）
阅读框
1.引物的长度
一般为15-30bp,常用的是18-27bp,但不能大于38,因为过长会导致其延伸温度大于74℃，即Taq酶的最适温度
总的说来，每增加一个核苷酸引物特异性提高4倍，这样，大多数应用的最短引物长度为18个核苷酸。引物长度的上限并不很重要，主要与反应效率有关。由于熵的原因，引物越长，它退火结合到靶DNA上形成供DNA聚合酶结合的稳定双链模板的速率越小。
②GC含量
一般引物序列中G+C含量一般为40%~60%，一对引物的GC含量和Tm值应该协调。若是引物存在严重的GC倾向或AT倾向则可以在引物5’端加适量的A、T或G、C尾巴。
5.引物自身
引物间3‘端的互补、二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败
任务
用绿色荧光蛋白（GFP）标记蛋白NR1
引物要求
PCR扩增GFP
GFP两边添加BamHI酶切位点
保证NR1的阅读框不改变
第一步：扩增GFP基本序列
第二步：GC比值；Tm值
第三步：酶切位点
第四步：阅读框
第五步保护序列
Primer1: 5' GCGGggatccTATGGTGAGCAAGGGCGAGGA
Primer2: 5' GCGCggatccctCTTGTACAGCTCGTCCATGCC
记得当初写本科论文，感到不知道讨论什么问题好。愣是写了一大段的PCR条件摸索的讨论。后来PCR成为实验最基本的一步了，但是发现在PCR中还是有许多需要注意的地方。PCR的第一步就是引物设计了。引物设计需要注意的地方很多，在大多数情况下，我们都是在知道已知模板序计。这个时候随机核苷酸序列就与模板不是完全匹配。我们通常指的设计引物都是在已知模板序列的情况下进行。
2.产物的长度
扩增片段长度为100~600碱基对。
3. Tm值
引物的Tm值一般控制在55-60度，尽可能保证上下游引物的Tm值一致，一般不超过2度。如果引物中的G+C含量相对偏低，则可以使引物长度稍长，而保证一定的退火温度。
Tm=2（A+T）+4（C+G）
4.引物的GC含量
有效引物中（G+C）的比例为40-60%,过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。
将引物序列粘贴到1区，将靶DNA序列粘贴到2区，这两者可以互换的，并且BLAST会计算互补、反义链等多种可能，所以不需要用户注意两条链是否都是有义链。如果知道序列在数据库中的GI号也可以直接输入GI号，这样就不用粘贴一大段的序列了。最后在3处点击Align就可以查看引物在靶DNA中是否有多个同源位点了。
可是使用BLAST还是有其不方便的地方。因为它一次只能比较两条序列，那么一对引物就需要分开进行比对。如果存在错配，还需要自己计算由于错配形成的片段长度有多大。在下一篇中将介绍一个软件，可以直接将靶DNA和引物输入对产物片段进行预测。
⑥引物末端
引物3’端是延伸开始的地方，因此要防止错配就从这里开始。3’端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在G+C富集序列区错误引发。3′端也不能有形成任何二级结构可能，除在特殊的PCR（AS-PCR）反应中，引物3′端不能发生错配。如扩增编码区域，引物3′端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增特异性与效率。
很多时候PCR只是初步克隆，之后我们还需要将目的片段亚克隆到各种载体上，那么就需要在PCR这个步骤为下一步的操作设计额外的碱基。以下总结一些为了亚克隆所要设计的序列。
a添加限制性内切酶酶切位点
添加酶切位点是将PCR产物进行亚克隆使用得最多的手段。一般酶切位点是六个碱基，另外在酶切位点的5’端还需要加2～3个保护碱基。但是不同的酶需要的保护碱基数目是不相同的，例如：SalⅠ不需要保护碱基，EcoRⅤ需要1个，NotⅠ需要2个，HindⅢ3个。其中，在原核表达设计引物时还有一些小技巧，大家可以参考：《原核表达之实验前的分析》。里面一些规则是所有表达都通用的。
d In-Fusion克隆方法
这项技术是Clontech还属于BD的时候推出的，2004年在生物通可着实风光了一把，不但当选年度创新试剂还被大家投票为最受大家欢迎的试剂。此技术就其步骤来说是及其方便的，不需连接酶，不需长时间的反应。只要在设计引物的时候引入一段线性化载体两端的序列，然后将PCR产物和线性化的载体加入到含有BSA的In-Fusion酶溶液中，在室温下放置半个小时就可以进行转化了。这种方法特别适合大批量的转化。
有一种做法是在进行PCR反应的同时进行酶切，这样就需要注意一些内切酶在PCR反应中的酶切反应率，见附录。不过这种方法虽然方便但并不推荐。有时候，就是把PCR产物回收后酶切再与载体连接效果都不尽理想，同步进行会使出现问题的原因变得更加复杂。一旦出现问题，分析起来更麻烦。
b LIC添加尾巴
LIC的全称是Ligation-Independent cloning，它是Navogen公司专门为其部分的pET载体而发明的一种克隆方法。用LIC法制备的pET载体有不互补的12–15碱基单链粘端，与目的插入片段上相应粘端互补。扩增目的插入片段的引物5'序列要与LIC载体互补。T4 DNA聚合酶的3'→5'外切活性经短时间即可在插入片段上形成单链粘端。由于只能由制备好的插入片段和载体互相退火形成产物，这种方法非常快速高效，而且为定向克隆。