P C R技术(包含引物设
计)
聚合酶链式反应（PCR）
原理：
DNA的半保留复制时，双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链，在DNA聚合酶与启动子的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。在实验条件下，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，并设计引物做启动子，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。PCR类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。
PCR由变性 - 退火(复性）- 延伸三个基本反应步骤构成：
①模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA 双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；
②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至40~60℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；
③引物的延伸：DNA模板 - 引物结合物在DNA聚合酶的作用下，于72℃左右，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
PCR技术分类（常用）
（1）反向PCR技术(Inverse PCR, IPCR)：反向PCR是克隆已知序列旁侧序列的一种方法．主要原理是用一种在已知序列中无切点的限制性内切酶消化基因组DNA．后酶切片段自身环化．以环化的DNA作为模板，用一对与已知序列两端特异性结合的引物，扩增夹在中间的未知序列。该扩增产物是线性的DNA 片段，大小取决于上述限制性内切酶在已知基闲侧翼DNA序列内部的酶切位点分布情况。用不同的限制性内切酶消化，可以得到大小不同的模板DNA，再通过反向PCR获得未知片段。
（2）锚定PCR技术(Anchored PCR, APCR)：用酶法在一通用引物反转录cDNA3’-末端加上一段已知序列, 然后以此序列为引物结合位点对该cDNA进行扩增, 称为APCR。
（3）不对称PCR技术(asymmetric PCR)：两种引物浓度比例相差较大的PCR 技术称不对称PCR。在扩增循环中引入不同的引物浓度, 常用50～100÷1比例。在最初的10～15个循环中主要产物还是双链DNA, 但当低浓度引物被消耗尽后, 高浓度引物介导的PCR反应就会产生大量单链DNA。
（4）反转录PCR技术(reverse transcription PCR, RT-PCR)：当扩增模板为RNA 时, 需先通过反转录酶将其反转录为cDNA才能进行扩增。应用非常广泛, 无论是分子生物学还是临床检验等都经常采用。
（5）巢式PCR技术(NEST-PCR)：先用一对靶序列的外引物扩增以提高模板量, 然后再用一对内引物扩增以得到特异的PCR带, 此为巢式PCR。若用一条外引物作内引物则称之为半巢式PCR。为减少巢式PCR的操作步骤可将外引物设计得比内引物长些, 且用量较少, 同时在第一次PCR时采用较高的退火温度而第二次采用较低的退火温度, 这样在第一次PCR时, 由于较高退火温度下内引物不能与模板结合, 故只有外引物扩增产物, 经过若干次循环, 待外引物基本消耗尽, 无需取出第一次PCR产物, 只需降低退火即可直接进行PCR扩增。这不仅减少操作步骤, 同时也降低了交叉污染的机会。这种PCR称中途进退式PCR，主要用于极少量DNA模板的扩增。
（6）多重PCR技术(multiplex PCR)：在同一反应中用多组引物同时扩增几种基因片段,如果基因的某一区段有缺失,则相应的电泳谱上这一区带就会消失。主要用于同一病原体的分型及同时检测多种病原体、多个点突变的分子病的诊断。（7）重组PCR技术：重组PCR技术是在两个PCR扩增体系中, 两对引物分别由其中之一在其5’-端和3’-端引物上带上一段互补的序列,混合两种PCR扩增产物,经变性和复性,两组PCR产物互补序列发生粘连,其中一条重组杂合链能在PCR 条件下发生聚合延伸反应,产生一个包含两个不同基因的杂合基因。
（8）原位PCR技术：利用完整的细胞作为一个微小的反应体系来扩增细胞内的目的片段,在不破坏细胞的前提下,利用一些特定的检测手段来检测细胞内的扩增产物。直接用细胞涂片或石蜡包埋组织切片在单个细胞中进行ＰＣＲ扩增，可进行细胞内定位，适用于检测病理切片中含量较少的靶序列。
（9）荧光定量实时PCR技术
反应动力学
PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升，最终DNA扩增量可用Y=(1+X)n计算，Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示平均每次的扩增效率，n表示循环次数。平均扩增效率理论值为100%，但实际情况达不到，反应初期靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期，即出现“停滞效应”，此效应称平台期，与DNA聚合酶数量和活性、PCR扩增效率、非特异性产物的竞争等因素有关。
PCR扩增产物
可分为长产物片段和短产物片段两部分，短产物片段的长度严格地限定在两个引物链5’端之间，是需要扩增的特定片段。短、长产物片段是由于引物所结合的模板不同而形成的，以一个原始模板为例，在第一个反应周期中，以两条互补的DNA为模板，引物是从3’端开始延伸，其5’端是固定的，3’端则没有固定的止点，长短不一，这就是长产物片段。进入第二个反应周期后，引物除与原始模板结合外，还要同新合成的链（长产物片段）结合引物在与新链结合时，由于新链模板的5’端序列是固定的，故这次延伸的片段3’端被固定了止点，保证了新片段的起点、止点都限定于引物扩增的序列以内，形成长短一致
的短产物片段。由于短产物片段是按指数倍数增加，而长产物片段则以算术倍数增加，故可忽略不计，使得PCR的反应产物不需再纯化既可以保证足够纯的DNA片段供分析、监测。
反应五要素---引物、模板、DNA聚合酶、四种dNTP、Mg2+
（1）引物设计
①引物长度：15-30bp，常用为20bp左右。
②引物扩增跨度：以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。
③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，引物自身连续互补碱基不能超过3个，一对引物间也不易多于四个连续碱基的互补性。【引物的GC含量和Tm 值应该协调：Tm=4（G+C）+2（A+T）】
④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3'端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。
⑤引物3’端为关键碱基，是PCR延伸的起始端，不能进行任何修饰，也不能形成二级结构的可能，一般3‘端也不能发生错配，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。 5’端无严格限制，只起限定PCR产物长度的作用，对扩增特异性影响不大，因此常用来引进修饰位点或标记物。
⑥引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。
⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。
⑧引物量：每条引物的浓度0.1～1umol或10～100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。
（2）DNA聚合酶：目前有两种Taq DNA聚合酶供应，一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反应约需酶量0.5-2.5 U/50 ml，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。
（3）dNTP的质量与浓度：dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1M NaOH或1M Tris-HCL的缓冲液将其PH调节到7.0～7.5，小量分装， -20℃冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解。在PCR反应中，dNTP应为50～
200umol/L，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等( 等摩尔配制)，如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低)，就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量。
（4）模板(靶基因)核酸：模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一，传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。SDS的主要功能是：溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS 还能与蛋白质结合而沉淀；蛋白酶K能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白，再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉
蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作为模板用于PCR反应。
（5）Mg2+浓度：Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度为1.5～2.0mmol/L为宜。Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少。
RT-PCR -- 是将RNA的反转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。
总RNA提取（-70℃保存）
Trizol法：
1、取组织100㎎于玻璃匀浆器中，加入1ml Trizol 冰上抽打匀浆（边匀浆边暂停）
2、移入1.5mlEP管中，颠倒混匀，室温保存5min
3、加氯仿0.2ml（总体积的1/5），振荡混合，室温放置5min
4、4℃，离心12000 rpm，15min
5、取上层液相（约400μl）移入一新1.5ml EP管中，加等体积异丙醇（约400μl）,振荡混合，室温保存10min
6、4℃，离心12000 rpm，10min
7、弃上清液，加1ml 75%无水乙醇（4℃保存），振荡混合
8、4℃，离心7500 rpm，5min
9、弃上清液，室温放置20min(EP管倒置在滤纸上)使RNA沉淀干燥（不能完全干燥）
10、加20ul DEPC水至EP管中，在60℃孵育3-5min(或手握3-5min),使RNA 充分溶解（可保存在液氮或低温冰箱-70℃）
测RNA浓度：走RNA变性电泳观察18s、28s条带，分光光度计检测260/280吸光度比值
调零：750ul DEPC水
测量：745ul DEPC水 + 5ul RNA
总RNA浓度= OD260×40×稀释倍数（150倍）ug/ml
= OD260×40×150 ug/ml
= OD260×6 ug/ul
A1/A2应在1.8-2.0之间
注意：提取RNA的质量主要是要通过260/280的比值看是不是在2.0左右，当OD260/OD280<1.8时提示有蛋白或酚的污染，需要进一步纯化RNA；还要跑胶看看28s、18s、5s的三条带是不是清晰，一般质量好的RNA，28s:18s的亮度比例在2:1左右，最后一条5s的应该比较淡。
②逆转录RT（cDNA：一周内-20℃保存，长期-70℃保存）
RT反应体系：20ul体系
第一步：约20分钟
RNA抽提物 5μl
Radome引物 2μl
RNAsin 0.5μl
1、65℃ 15分钟
2、立即放入冰浴
第二步：约2小时
RNAsin 0.5μl
10mM dNTP 1μl
5× RT缓冲液 4μl
25mM MgCl2 4μl
AMV 3μl
1、37℃ 1.5小时
2、94℃ 5-10分钟
3、反应物保存于-20℃或进行PCR
③聚合酶链反应PCR(产物-20℃保存)
PCR反应体系：100μl体系
约4.5小时约5小时
25mM MgCl2 2μl 3μl
10×PCR缓冲液 5μl 5μl
10mM dNTP 1μl 1μl
10pmol/μl上游引物 2.5μl 2.5μl
10pmol/μl下游引物 2.5μl 2.5μl
cDNA模板 2.5μl 5μl
ddH2O 34μl 30μl
Taq酶 0.5μl 1μl
轻质石蜡油 50μl 50μl
1、94℃ 2分钟，55℃ 1分钟，72℃ 2分钟为第一个步1个循环
2、94℃ 45秒，55℃ 40秒，72℃ 1分钟为第二步30/40个循环
3、72℃ 10分钟
4、取出后4℃保存，5分钟后-20℃保存或走电泳
④琼脂糖凝胶电泳：约1.25小时
1、配制0.5× TBE电泳缓冲液300 ml
2、配制凝胶浓度1.7%（40ml 0.5×TBE加0.68g胶），微波炉中火2分钟溶解胶，冷却至60℃加入溴乙锭2μl（10mg/ml的终浓度0.5μg/ml），充分混匀
3、将温热的凝胶倒入已置好梳子的胶膜中，在室温下放置30-45min后现进行电泳
4、加样8μl PCR反应产物+2μl溴酚兰，空一格加DNA marker
5、电泳50-80V ，电场强度不宜高于5V/cm
6、在紫外灯下观察,DNA 存在则显示出红色荧光条带,采用凝胶成像系统拍照保存。
电泳缓冲液(5×TBE贮存液)：Tris 54g、硼酸27.5g、0.5M EDTA 20ml pH8.0、加蒸溜水至1000ml。使用时，将5×TBE稀释10倍成0.5×TBE就可以在电泳时使用(工作浓度)。
上样缓冲液(6×缓冲液，4℃保存)：0.25%溴酚蓝、0.25%二甲苯青FF、30%甘油
琼脂糖凝胶配制：（1.0%）1.0g琼脂糖+100ml电泳缓冲液，微波炉加热至沸腾(如果首次煮胶，一定要煮透，以不出现泡沫为标志)，熔化的琼脂物冷却至60℃时加入10mg/ml溴化乙锭5μl，充分混匀，将温热的凝胶倒入已置好梳子的胶膜中，在室温下放置30-45min(可以放入4度冰箱加快琼脂糖凝固)后现进行电泳。1.5%同上，将琼脂糖的量改为1.5g。
试剂：
1、DEPC水：吸出1ml DEPC放在1000ml容量瓶中加双蒸水定容至1000ml，配成1‰DEPC水，并充分振荡混匀备用。
2、75%乙醇：用无水乙醇+DEPC水配，然后放-20℃保存。
(DEPC水需先高压，高压时注意：1.装DEPC水的瓶子在盖子和瓶之间要放上线头；2.高压时间在40-45分钟，所以水要适当多加一点；3.高压结束后，不要强行放气，要让压力自然下降，不然水会喷出)。
3、异丙醇：放入棕色瓶中。
4、氯仿：放入棕色瓶中。
5、轻质石蜡油
Trizol：一种新型总RNA抽提试剂，可以直接从细胞或组织中提取总RNA。其含有苯酚、异硫氰酸胍等物质，能迅速破碎细胞并抑制细胞释放出的核酸酶。DEPC：焦碳酸二乙酯，是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂
随机引物、Oligo(dT)、基因特异性引物：用于反转录的引物可视实验的具体情况选择
M-MLV、AMV（配10×RT-buffer）：逆转录酶
RNasin：RNA酶抑制剂
dNTP：脱氧核糖核苷三磷酸（dATP、dGTP、dTTP、dCTP、dUTP）
Taq酶（配10×PCR-buffer、MgCl2）：DNA聚合酶
Primer（上游、下游）
Marker：是分子量不同的DNA片段，主要用途就是DNA 分子凝胶电泳时，加样用做对比来检测琼脂糖凝胶是否有问题。
附：TBE（Tris硼酸缓冲液）