生物技术大实验
第一部分植物组织培养
实验一、母液的配制和保存（3学时）
一、实验目的
通过配制MS培养基母液，掌握贮备液的配制和保存方法。
二、原理
配制培养基时，为了使用方便和用量准确，通常采用母液法进行配制，即按培养基配方中各试剂的用量，扩大若干倍后再准确称量，分别先配制成一系列的母液置于冰箱中保存。使用时按比例吸取母液进行稀释配制即可。
以MS培养基为例，所需配制的母液为：大量元素母液（母液Ⅰ，浓缩10倍）、微量元素母液（母液Ⅱ，浓缩100倍）、铁盐母液（母液Ⅲ，浓缩100倍）和有机化合物母液（母液Ⅳ，浓缩100倍）等。
三、实验仪器设备和试剂
冰箱，天平，酸度计，烧杯（50ml，100ml，500ml，1000ml），量筒(1000ml，100ml，25ml)，容量瓶(1000ml，500ml，100ml)，磨口试剂瓶(100ml，500ml，1000ml)，药勺、称量纸、滴管、玻璃棒，电炉，微波炉
NH4NO3, MnSO4.4H2O, KNO3, ZnSO4.7H2O, CaCl2.2H2O, Na2MoO4.2H2O, MgSO4.7H2O, CuSO4.5H2O, KH2PO4, CoCl2.6H2O, H2BO3，Na2•EDTA•2H2O，KI, FeSO4.7H2O，烟酸，甘氨酸, 盐酸硫胺素, 肌醇, 盐酸吡哆醇, 蒸馏水
四、实验方法
1、MS大量元素母液的配制
配制时先用量筒量取蒸馏水大约350ml，放入500ml的烧杯中，按照配方表中用量依次分别称取：NH4NO3 ,KNO3 ,KH2PO4 ,MgSO4.7H2O ,CaCl2.2H2O，待第一种化合物溶解后再加入第二种化合物，当最后一种化合物完全溶解后，将溶液倒入500ml的容量瓶中，用蒸馏水定容至500ml，然后，倒入细口试剂瓶中，贴上标签，注明母液名称、配制日期、配制人姓名，置于4℃冰箱中保存备用。
2、MS微量元素母液的配制
按照配方表中用量用电子天平分别依次称取MnSO4•4H2O，ZnSO4•7H2O ，H2BO3，KI ，NaMoO4•2H2O，CuSO4•5H2O，CoCl2•6H2O，用蒸馏水逐个溶解，待全部溶解后，用容量瓶定容，装入500ml细口试剂瓶中，贴上标签，注明母液名称、配制日期、配制人姓名，置于4℃冰箱中保存备用。
3、MS铁盐母液配制
把FeSO4•7H2O和Na2•EDTA•2H2O分别置于200ml蒸馏水中，加热并不断搅拌使之溶解。保持加热，把FeSO4溶液慢慢倒入Na2•EDTA溶液中并不断搅拌，接近沸腾时停止加热，待溶液冷却后把pH值调到5.5，加蒸馏水到最终容积500ml，置于棕色细口瓶中，用力振荡1～2min，贴上标签，注明母液名称、放大倍数、配制日期、配制人姓名。在室温下避光保存一段时间令其充分反应后，再置于4℃冰箱中保存备用。
4、MS有机化合物母液的配制
按配方表中用量依次称取：肌醇，维生素B1，烟酸，甘氨酸，维生素B6，用蒸馏水依次溶解并定容后，转入500ml细口试剂瓶中，贴上标签，注明母液名称、配制日期、配制人姓名，置于4℃冰箱中保存备用。
5、植物生长物质母液的配制
NAA母液：配制浓度为0.1mg/ml。NAA属于生长素类激素。
6-BA母液：配制浓度为0.1mg/ml。6-BA属于细胞分裂素。
五、实验报告
1、撰写实验报告。（包括实验名称、目的、原理、实验用品、实验操作内容，实验结果，数据记录与处理、分析和讨论）
2、思考题（必做）
⑴MS培养基母液配方及其母液的配制
⑵植物生长物质母液的配制：
实验二、培养基的配制与灭菌（3学时）
一、实验目的
学习用母液法配制培养基以及掌握培养基灭菌的方法。
二、原理
组织培养所用的培养基含有植物细胞生长所必需的各类营养物质，同时也是微生物繁殖的极好场所，因此必需对培养基进行灭菌处理，以确保无菌操作的顺利进行。
三、实验仪器设备和试剂
天平，烧杯（50ml，100ml，500ml，1000ml），量筒(1000ml，100ml，25ml)，移液管（10ml，5ml，2ml，1ml，0.5ml），药勺，称量纸，玻璃棒，吸耳球，酸度计或pH试纸，培养瓶（400个），瓶盖（或封口膜+耐热橡皮筋），线绳，高压灭菌锅，滴瓶
琼脂，蔗糖，蒸馏水，1mol/LHCl，1mol/LNaOH
四、实验步骤
1、培养基的配制
培养基A：MS+0.2mg/L NAA+1.0mg/L6-BA+ 3%蔗糖+0.8%琼脂，pH5.8。（见实验三）
培养基B：MS+0.1mg/L NAA+1.5mg/L6-BA+ 3%蔗糖+0.8%琼脂，pH5.8。（见实验四）
培养基C：1/2MS+0.1mg/L NAA+1.5%蔗糖+1.0%琼脂，pH5.8。（见实验四）
①将所需的各种母液按顺序放好，将洁净的各种玻璃器皿等放在指定位置。
②取
③按相应培养基称量蔗糖和琼脂，并添加到搪瓷缸中，在电磁炉上加热待琼脂完全融化后加蒸馏水定容至500ml。
④充分混合后，用1mol/LNaOH和1mol/LHCl调节培养基的pH为5.8。
⑤趁热把培养基分装到广口瓶中，每瓶约20~40ml。封好瓶口。贴上标签，注明培养基名称，配制者组号（或姓名）和配制日期，待灭菌。
2、培养基灭菌
灭菌温度及灭菌时间：121℃（1.06kg/cm2）下灭菌15分钟。（如是实验所用菌材灭菌，如无菌水及器械，则是121℃（1.06kg/cm2）下灭菌30分钟）
①检查灭菌锅外层锅内水位，水量过少时应加水。把分装好的培养基放入灭菌锅的消毒桶内。
②盖上锅盖，注意按照说明操作并确定已盖好，设置好温度和时间参数，开启电源加热灭菌。
③灭菌时间到后，先切断电源，让灭菌锅内温度自然下降，待灭菌锅压力表指针降到0时，打开排气阀，旋松螺栓，开启锅盖，取出已灭菌的培养基。
④刚灭过菌的培养基成液体状，取出时不要用力摇动，否则会导致部分培养基沾附在瓶壁。放置在水平桌面上自然冷却。在室温下放置1-2天，观察有无微生物生长，以确定培养基是否彻底灭菌。经检查没有杂菌生长的方可使用。
五、实验报告
撰写实验报告。（包括实验名称、目的、原理、实验用品、实验操作内容，实验结果，数据记录与处理、分析和讨论）
附：稀酸和稀碱的配制方法
1mol/LHCl
取浓盐酸8.25ml，加蒸馏水至100ml，即为1mol/LHCl。
1mol/LNaOH
称取氢氧化钠4g，加入蒸馏水100ml，即为1mol/LNaOH。
