细胞免疫荧光步骤

免疫荧光染色的主要原理是利用抗原抗体之间的特异性结合来显示目的蛋白，主要包括蛋白和一抗结合，其次是带有荧光基团的二抗识别并结合一抗，荧光显微镜下即可观察到荧光，下文主要列举了三种细胞免疫荧光染色的实验步骤。

zo-1的免疫荧光，步骤如下：

1、细胞在盖片上生长融合到95%-100%时，从孵箱中取出。

2、用预温的1×PBS洗3次，每次10分钟

3、4%的甲醛室温固定20-30分钟

4、1×PBS洗3次，每次10分钟

5、0.2%Triton X-100透化2-5分钟

6、1×PBS洗3次，每次10分钟

7、5%BSA室温封闭30分钟

8、加一抗(用1%BSA稀释)放在湿盒里，4度过夜

9、1×PBS洗3次，每次10分钟

10、加二抗(用1%BSA稀释)30分钟，闭光

11、1×PBS洗3次，每次10分钟

12、95%甘油封片

注：4%甲醛，0.2%Triton，5%BSA均用1×PBS稀释

从大鼠分离的T细胞能否直接做细胞免疫荧光

细胞爬片的免疫荧光步骤基本一致：

1.取出细胞爬片放到35mm或60mm用过的细胞培养皿里，PBS洗三遍。

注意：有的时候作的细胞爬片可能比较小，因此夹取的时候要小心，注意反正面，放在皿里洗比较方便，避免了来回夹取，另外洗的时候加PBS不要太冲，不要细胞冲下来。洗的时候我都是多加PBS，稍晃一下就倒掉，没有等5分钟或10分钟。

2. 4%冷的多聚甲醛固定20分钟，PBS洗三遍。

3. 0.2%Triton X-100通透10分钟，PBS洗三遍。

4. 与二抗相同宿主的血清封闭30分钟，PBS洗三遍。

细胞免疫荧光

I、步骤：

一、固定：

PBS 5min×3次振荡洗涤制作好的细胞爬片。

固定液覆盖细胞，RT 静置15min。

PBS 5min×3次振荡洗涤。

二、通透化：

通透液覆盖细胞，RT 静置30min。

PBS 5min×3次振荡洗涤。

三、封闭：

封闭液覆盖标本表面37℃孵育1h。

四、一抗孵育：

一抗以合适浓度稀释PBS，覆盖标本表面。

4℃孵育过夜，第二天37℃复温1h。

PBS 5min×3次振荡洗涤。

五、二抗孵育：

FITC标记二抗以合适浓度稀释于PBS，覆盖标本表面。

37℃避光孵育<60min。

PBS 5min×3次避光振荡洗涤。

六、染核：

新鲜稀释Hoechst覆盖细胞表面，RT避光静置<10min。

PBS 5min×3次避光振荡洗涤。

七、封片：

在干净的载玻片上滴一滴封片剂，将爬片的细胞面扣在封片剂上。

八、镜检，4℃避光保存。

II、注：

1、细胞密度要合适，状态较好。

2、从孵育二抗开始要避光（关闭室内日光灯即可）。

3、完成后最好及时镜检，照相；分别用不同波长激发荧光，在Photoshop软件下合成一张

图。

III、试剂配制：

1、固定液：4%多聚甲醛/PBS：

4g多聚甲醛，50～80mlPBS，加热至60℃，持续搅拌至完全溶解，（通常需滴

加少许1n NaOH才能使溶液清亮），定容100ml，RT保存。

2、通透液：0.5 %(v/v)TritonX-100/PBS

3、封闭液：正常山羊血清稀释于PBS；或商品化封闭液成品。

4、Hoechst：Hoechst33258即可。

5、封片剂：50%(v/v)甘油/PBS。

细胞免疫荧光标记实验步骤

细胞免疫荧光标记实验是用来观察和分析细胞中的特定分子或结构的一种常用方法。下面是一些常见的细胞免疫荧光标记实验步骤：

1. 细胞培养准备:

- 在无菌条件下准备所需培养基和培养器具。

- 将待标记细胞接种在培养皿中，以适当的细胞密度使其在培养基中生长。

2. 固定细胞:

- 将细胞培养皿中的培养基倒掉。

- 用生理盐水或磷酸缓冲液轻轻洗涤细胞，以去除未附着的细胞和培养基残留。

- 加入适当的固定液，例如4%的乙醛，固定细胞并封存其内部结构。

3. 渗透化处理:

- 使用适当的渗透剂，如0.1%的Triton X-100，以打破细胞膜，使抗体能够渗透到细胞内部。

- 进行渗透化处理的时间应根据实验要求而定。

4. 抗体标记:

- 制备适当的抗体和荧光染料稀释液。

- 将抗体稀释液加入到细胞上，使其与目标分子结合。

- 按照实验要求，在适当的温度和时长下孵育细胞，促使抗体

与目标分子充分结合。

5. 洗涤和染色:

- 用洗涤缓冲液充分洗涤细胞，以去除未结合的抗体和荧光染料。

- 使用适当的荧光染料对细胞进行染色。如需防褪色，可以添

加适当的抑制剂。

6. 显微镜观察和图像捕获:

- 用适当的显微镜观察细胞，并捕获荧光图像。

- 根据需要，使用图像处理软件对图像进行分析和量化。

注意事项：

- 实验前确保实验室和设备都是清洁的，并遵守实验安全操作

规范。

- 涉及有害物质时，戴好个人防护用品，如实验手套和护目镜。

- 每个实验步骤的时间和条件可能因实验要求而异，需根据具

体实验方案进行调整。

这些步骤提供了一般的细胞免疫荧光标记实验的大致流程，但

方法一：

1.首先需要把细胞养在玻璃片上〔悬浮细胞需要用多聚赖氨酸包被过的玻璃片〕

2. 然后在 4％ PFA里面室温下固定30 分钟， PBS洗两次， 0.1%TX-100 室温下作用1－ 2 分钟使细胞膜通透。

3.接下来进行荧光标记，需要在一个大的容器〔面积大，扁平状的，比方大的培养皿〕里面，放一张用水打湿的

滤纸，以保持湿度。

4.剪一片适宜大小的 parafilm ，在上面滴上稀释在 1％ BSA/TBS中的一抗〔稀释倍数依具体抗体而定〕，每个玻

璃片 30ul 足够，把玻璃片盖在上面〔细胞面朝下〕，室温下孵育30 分钟，然后在PBS里洗三次。

5.接下来二抗孵育步骤同上。

6.最后，在载玻片加上 mountingmedium 〔大约每个玻璃片加 10ul 〕，把玻璃片放上去〔细胞面朝下〕，37度 30

分钟，然后就可以在荧光显微镜下观察了。

7.抗体很重要，不能有非特异性结合。你可以先做WB检测一下你的抗体，看看有没有杂带。

8.双标的话，可以把两个一抗一起加或者分别标记两次〔可以都试一下看看那种方法适宜〕。如果一个抗体需要

二抗，一个是直接荧光标记的，可以把荧光标记的那个和另外一个的二抗一起加。

方法二：

1.选取一抗时要来源于两种不同的动物，我用的是来源于 rabbit 和 rat 的抗体，二抗那么是不同荧光信号标记的，

我用的是 donkeyanti-rabbit-FITC〔绿〕和 donkeyanti-rat-Tex-Red〔红〕。

2.我的做法是两种一抗同时孵育，然后两种二抗同时孵育。抗体浓度、孵育时间要仔细摸索，我感觉一抗 4 度孵

细胞免疫荧光

1、吸干十二孔板中每孔中的培养基，用PBS洗三次，5min/次，注意摇床要缓

慢。

2、吸干PBS，每孔加200~300μl固定液，室温固定20分钟。

3、若暂时不做荧光，吸干固定液，不洗，放-30℃保存。

4、需要做时，将十二孔板取出，稍微解冻之后，加适量的PBS，用钩针抠出要

PBS洗三次，5min/次。

5、吸干PBS后，每孔加1ml的5‰Triton破膜液，室温下破膜15~20分钟。

6、吸干破膜液，室温下PBS洗3次，5min/次。

7、加BSA封闭液，30~50μl/爬片，室温下封闭30min。

8、吸干BSA封闭液，不洗，加一抗（一抗用PBS稀释比例为：1：50~1:100，

浓度视具体情况而定，30~50μl/爬片）4℃过夜。注意十二孔板保持平整，以免一抗流到爬片外。

9、第二天从4℃冰箱中取出十二孔板，PBST洗3次，3min/次，然后每孔加1:50

稀释的FITC，室温下避光孵育1h。

10、PBST洗3次后，DAPI染核6分钟，30μl/爬片。染核后PBST洗3次，

5min/次。

11、载玻片上滴一滴GL YCEROL封片液，即可镜下观察。

说明：

①5‰Triton破膜液：例如配20μl的Triton原液用4000μlPBS稀释。

②FTIC现配现用，用PBS稀释，比例为1：50~1:75，具体浓度依据荧光亮度来调整。

耗材：

1、十二孔板2块，一块要求无菌（种细胞），另一块洁净（外用漂洗爬片）。

2、外用PBS

3、固定液

4、细胞爬片

5、避光盒

6、钩针

7、5‰Triton破膜液

8、BSA封闭液

方法一：之袁州冬雪创作

1.首先需要把细胞养在玻璃片上（悬浮细胞需要用多聚赖氨

酸包被过的玻璃片）

2.然后在4％PFA外面室温下固定30分钟，PBS洗两次，

0.1% TX-100室温下作用1－2分钟使细胞膜通透.

3.接下来停止荧光标识表记标帜，需要在一个大的容器（面

积大，扁平状的，比方大的培养皿）外面，放一张用水打湿的滤纸，以坚持湿度.

4.剪一片合适大小的parafilm，在上面滴上稀释在1％

BSA/TBS中的一抗（稀释倍数依详细抗体而定），每一个玻璃片30ul足够，把玻璃片盖在上面（细胞面朝下），室温下孵育30分钟，然后在PBS里洗三次.

5.接下来二抗孵育步调同上.

6.最后，在载玻片加上mounting medium（大约每一个玻璃

片加10ul），把玻璃片放上去（细胞面朝下），37度30分钟，然后便可以在荧光显微镜下观察了.

7.抗体很重要，不克不及有非特异性连系.你可以先做WB检

测一下你的抗体，看看有没有杂带.

8.双标的话，可以把两个一抗一起加或者分别标识表记标帜

两次（可以都试一下看看那种方法合适）.如果一个抗体需要二抗，一个是直接荧光标识表记标帜的，可以把荧光标识表记标帜的阿谁和别的一个的二抗一起加.

方法二：

1.选取一抗时要来历于两种分歧的动物，我用的是来历于

rabbit和rat的抗体，二抗则是分歧荧光信号标识表记标帜的，我用的是donkey anti-rabbit-FITC（绿）和donkey anti-rat-Tex-Red（红）.

2.我的做法是两种一抗同时孵育，然后两种二抗同时孵育.

细胞免疫荧光步骤

方法一：

1.首先需要把细胞养在玻璃片上（悬浮细胞需要用多聚赖氨酸包被过的玻璃片）

2.然后在4％PFA里面室温下固定30分钟，PBS洗两次，0.1% TX-100室温下作用1－2分

钟使细胞膜通透。

3.接下来进行荧光标记，需要在一个大的容器（面积大，扁平状的，比如大的培养皿）里面，

放一张用水打湿的滤纸，以保持湿度。

4.剪一片合适大小的parafilm，在上面滴上稀释在1％BSA/TBS 中的一抗（稀释倍数依具体

抗体而定），每个玻璃片30ul足够，把玻璃片盖在上面（细胞面朝下），室温下孵育30分钟，然后在PBS里洗三次。

5.接下来二抗孵育步骤同上。

6.最后，在载玻片加上mounting medium（大约每个玻璃片加10ul），把玻璃片放上去（细

胞面朝下），37度30分钟，然后就可以在荧光显微镜下观察了。

7.抗体很重要，不能有非特异性结合。你可以先做WB检测一下你的抗体，看看有没有杂带。

8.双标的话，可以把两个一抗一起加或者分别标记两次（可以都试一下看看那种方法合适）。

如果一个抗体需要二抗，一个是直接荧光标记的，可以把荧光标记的那个和另外一个的二抗一起加。

方法二：

1.选取一抗时要来源于两种不同的动物，我用的是来源于rabbit 和rat的抗体，二抗则是不

同荧光信号标记的，我用的是donkey anti-rabbit-FITC（绿）和donkey anti-rat-Tex-Red（红）。

2.我的做法是两种一抗同时孵育，然后两种二抗同时孵育。抗体浓度、孵育时间要仔细摸索，

我感觉一抗4度孵育过夜比较好，背景比较清晰。

细胞免疫荧光实验步骤

第一步：样本准备

1.根据实验需要，选择并培养适当的细胞系或组织样本。

2.将细胞或组织培养在适当的载玻片、孔板或离心管中。

3.使细胞或组织粘附在载玻片等表面上。

第二步：固定和渗透化处理

1.使用适当的缓冲液（如甲醛）或有机溶剂（如甲醇）将细胞/组织

进行固定处理。

2.在室温或低温下，将缓冲液中的固定液置于载玻片或孔板中，进行

固定处理。

3.固定后，用洗涤缓冲液（如PBS）洗涤细胞/组织，去除多余的固

定液。

4.在细胞内透明化的同时，保持细胞结构完整。

第三步：抗体染色

1.准备合适的一抗和二抗。一抗是特异性与待检测蛋白结合的抗体，

二抗是带有荧光染料的抗体。

2.将一抗稀释到适当的浓度，并加入到载玻片或孔板中，与细胞孵育。

3.将载玻片或孔板中的一抗与细胞孵育30-60分钟，使抗体与待检测

的蛋白相结合。

4.在恰当的洗涤缓冲液中洗涤载玻片或孔板，去除多余的一抗。

5.同样的方法，添加二抗到载玻片或孔板中，并孵育30-60分钟，使二抗与一抗结合。

6.再次使用洗涤缓冲液洗涤载玻片或孔板，去除多余的二抗。

第四步：显微镜观察

1.利用适当的显微镜镜头，观察载玻片或孔板上的细胞，并选取合适的区域进行观察。

2.使用适当的荧光滤波片，观察细胞中的荧光信号。

3.根据实验设计的需要，进行图像记录和分析。

细胞免疫荧光实验是一种常见的实验技术，可以用于研究细胞中的蛋白质表达和定位，提供有关蛋白质在细胞内的空间分布和功能的信息。不同的实验目的和需求可能会有一些细微的差异，因此可以根据具体的实验目的进行相应的调整或优化步骤。

细胞免疫荧光步骤

细胞免疫荧光技术是一种能够检测活细胞内特定蛋白质分布的技术，常用于免疫组化分析中。该技术重点在于使用特定抗体与荧光染料结合，达到明显的荧光信号来检测活细胞内某些蛋白质标识。

以下是细胞免疫荧光技术的主要步骤：

1、培养或固定活细胞

首先需要对活体细胞培养或固定。一般选择在培养皿或载玻片上将密集的细胞生长于培养液基质中，可以在日后的荧光显微镜下更加清晰的观察细胞结构及变化。

2、组织切片或钝化

在一些研究工作中，如动物实验或组织切片中，可能需要先进行组织切片或尸解固定。组织切片需要先进行固定处理，如使用琼脂糖进行完整的埋嵌固化，然后进行蜡加热染色处理，裁切成薄片。或者可以做成冰冻切片，操作上更为简单。另外，钝化细胞可以使用不优

化溶液，其中的表面抗原质已经被消除。这不仅可以减少非特异性信号，而且可以提高特异性状态的细胞荧光信号。

3、细胞膜的处理

在进行免疫染色之前，还需要对细胞膜进行处理。例如，可以使用牛血清蛋白或非离子界面活性剂来堵塞非特异性的结合位点。这可以减少非特异性抗体与未知结合物的竞争，提高特异性免疫染色的精度。

4、初级抗体与荧光染料的结合

细胞内需要检测的蛋白质必须有一个感兴趣的特定蛋白质抗体。该抗体允许特定的蛋白质标记。将特定抗体与荧光染料结合后，允许可见光下的荧光染色信号。此类荧光染料通常具有比较好的耐用性和较高的量子产率，如荧光色素FITC和荧光色素PE等。

5、清洗和固定

将免疫荧光的样品进行严格的洗涤，以去除非特异性的结合物。洗涤过程可以在紫外光下观察到荧光信号的信噪比。最终用4%多面固

方法一：

1.首先需要把细胞养在玻璃片上（悬浮细胞需要用多聚赖氨酸包被过的玻璃片）

2.然后在4％PFA里面室温下固定30分钟，PBS洗两次，0.1% TX-100室温下作用1－2分

钟使细胞膜通透。

3.接下来进行荧光标记，需要在一个大的容器（面积大，扁平状的，比如大的培养皿）里面，

放一张用水打湿的滤纸，以保持湿度。

4.剪一片合适大小的parafilm，在上面滴上稀释在1％BSA/TBS中的一抗（稀释倍数依具体

抗体而定），每个玻璃片30ul足够，把玻璃片盖在上面（细胞面朝下），室温下孵育30分钟，然后在PBS里洗三次。

5.接下来二抗孵育步骤同上。

6.最后，在载玻片加上mounting medium（大约每个玻璃片加10ul），把玻璃片放上去（细

胞面朝下），37度30分钟，然后就可以在荧光显微镜下观察了。

7.抗体很重要，不能有非特异性结合。你可以先做WB检测一下你的抗体，看看有没有杂带。

8.双标的话，可以把两个一抗一起加或者分别标记两次（可以都试一下看看那种方法合适）。

如果一个抗体需要二抗，一个是直接荧光标记的，可以把荧光标记的那个和另外一个的二抗一起加。

方法二：

1.选取一抗时要来源于两种不同的动物，我用的是来源于rabbit和rat的抗体，二抗则是不

同荧光信号标记的，我用的是donkey anti-rabbit-FITC（绿）和donkey anti-rat-Tex-Red（红）。

2.我的做法是两种一抗同时孵育，然后两种二抗同时孵育。抗体浓度、孵育时间要仔细摸索，

我感觉一抗4度孵育过夜比较好，背景比较清晰。

细胞免疫荧光染色法

细胞免疫荧光染色法如下：

１．固定：培养的细胞，弃去培养基，用冷的PBS洗两次，用4%多聚甲醛固定10min，再用PBS洗2次，每次5-10分钟。

２．透膜处理：在含0.1% Triton X-100的PBS中进行10min 的透膜处理，再用PBS洗2次，每次5-10分钟。

３．封闭：用4％羊血清封闭液，室温封闭30分钟。

４．孵育一抗：吸尽液体，勿洗，添加一抗，于37℃条件下孵育1h或放在4℃冰箱过夜，再用PBS洗3次，每次5-10分钟。

５．孵育二抗：滴加荧光素标记的二抗，避光，37℃，60min，再用0.01M PBS冲洗，5min×3次。

６．封片：用防淬灭封片剂封片，4℃，避光保存。

７．观察：荧光显微镜观察拍照。

要领一：之阳早格格创做

1.最先需要把细胞养正在玻璃片上（悬浮细胞需要用多散好

氨酸包被过的玻璃片）

2.而后正在4％PFA内里室温下牢固30分钟，PBS洗二次，

0.1% TX-100室温下效率1－2分钟使细胞膜通透.

3.接下去举止荧光标记表记标帜，需要正在一个大的容器

（里积大，扁仄状的，比圆大的培植皿）内里，搁一弛用火挨干的滤纸，以脆持干度.

4.剪一片符合大小的parafilm，正在上头滴上稀释正在1％

BSA/TBS中的一抗（稀释倍数依简曲抗体而定），每个玻璃片30ul脚够，把玻璃片盖正在上头（细胞里往下），室温下孵育30分钟，而后正在PBS里洗三次.

5.接下去二抗孵育步调共上.

6.末尾，正在载玻片加上mounting medium（约莫每个玻璃

片加10ul），把玻璃片搁上去（细胞里往下），37度30分钟，而后便不妨正在荧光隐微镜下瞅察了.

7.抗体很要害，不克不迭有非特同性分离.您不妨先搞WB检

测一下您的抗体，瞅瞅有不纯戴.

8.单目标话，不妨把二个一抗所有加大概者分别标记表记标

帜二次（不妨皆试一下瞅瞅那种要领符合）.如果一个抗体需要二抗，一个是间接荧光标记表记标帜的，不妨把荧光标记表记标帜的那个战其余一个的二抗所有加.

要领二：

1.采用一抗时要根源于二种分歧的动物，尔用的是根源于

rabbit战rat的抗体，二抗则是分歧荧光旗号标记表记标帜的，尔用的是donkey anti-rabbit-FITC（绿）战donkey anti-rat-Tex-Red（黑）.

2.尔的搞法是二种一抗共时孵育，而后二种二抗共时孵育.抗体浓度、孵育时间要留神摸索，尔感觉一抗4度孵育过夜比较佳，背景比较浑晰.

免疫荧光染色实验步骤

1.标本固定：将所需分析的细胞、组织或细胞培养物固定在载玻片上，常用的固定方法有：乙醛、甲醛、乙酸醋酸洗等。固定时间视具体对象而定，一般为10-30分钟。

2.细胞透膜处理：对于细胞，需进行细胞透膜处理，常用方法有：冷

冻切片、石蜡包埋切片、异丙醇造液切片等。其中，冷冻切片方法操作简单，适用于原代组织、生物样品等。

3.抗原解膜：将标本解膜以增强抗原表面表达，使其易于与抗体结合。常用方法有：酸性解膜（如：使用0.01M蛋白酶K）、热解膜（如：使用

高温蒸气）等。解膜时间和条件因抗原种类、标本类型而异。

4.阻断非特异性蛋白质结合：使用蛋白质阻断剂（如：牛血清白蛋白、小鼠胶原蛋白等）对标本进行阻断，以防止非特异性蛋白质与抗体结合。

阻断剂的浓度和时间视实验要求而定，一般为30分钟。

5.抗体结合：将与目标抗原相关的特异性一抗加入到试管中，与待检

样本中的抗原结合。一抗的浓度和孵育时间需进行优化，一般为1-2小时。

6.清洗：使用缓冲液对载玻片或试管中的非结合抗体进行清洗，以去

除非特异性、非结合的一抗。常用的缓冲液有：PBS、TBS等。

7.二抗结合：加入特异性的荧光标记的二抗（如：荧光染料标记的抗

小鼠IgG）与一抗结合。二抗的浓度和孵育时间需进行优化，通常与一抗

相同。

8.清洗：重复第6步骤，去除非结合的二抗。

9.盖玻片：将载玻片或切片用透明胶带盖住，以防止样本干燥。

10.显微镜观察：用荧光显微镜观察载玻片，记录目标抗原的荧光信号分布。

除了以上的步骤，还有一些增强免疫信号的步骤可选用，如增强素方法，例如亲和素-酶联生物素-生物素-(酶)染色。

免疫荧光步骤

免疫荧光就是利用特异性抗原与抗体相互结合的特性，通过标记抗原

或抗体上荧光物质的方法，来检测和定位抗原或抗体在生物样本中的存在

和分布情况。免疫荧光技术已被广泛应用于生物医学研究、临床诊断和药

物开发等领域。

下面是免疫荧光的步骤：

步骤一：制备标本

免疫荧光的首要步骤是制备待检测的标本。这可能涉及从活体中采集

组织样本（如活检），或者培养细胞，并在适当的时间点收集细胞。

步骤二：固定标本

固定是将标本固定在载玻片或离心管中的过程。通常使用化学固定剂（如甲醛或乙醇）或特定的固定和渗透缓冲液来保持标本的形态完整性，

并防止标本中的抗原或抗体被破坏或丢失。

步骤三：透化标本

透化是为了使荧光染料能够渗透到被固定的细胞或组织中。这可以通

过使用洗涤剂（如Tween-20）或透明质酸酶等物质来达到。透化可以提

高荧光染料与标本中抗原或抗体的结合能力，从而提高免疫反应的灵敏度。

步骤四：抗体染色

免疫荧光需要使用特异性抗体来标记待测的抗原。在此步骤中，将特

定的抗体与标本中的抗原结合。有两种常用的方法可以实现这一步骤：

1.原位染色：将标本与抗体混合，并在恰当的条件下孵育。抗体将与标本中的抗原结合，形成抗原-抗体复合物。这种方法可以用于检测细胞表面的分子或组织切片中的特定分子。

2.间接染色：在原位染色的基础上，引入第二抗体（标记抗体）。标记抗体是与染料结合的抗体，通常是荧光染料。该标记抗体与形成的抗原-抗体复合物结合，并形成二抗-抗原-抗体复合物。

步骤五：荧光显微镜观察

完成抗体染色后，可以使用荧光显微镜来观察标本中荧光信号的存在和位置。荧光显微镜配备有特殊的滤光片（荧光滤光片），可以选择性地捕捉特定荧光染料发出的荧光信号。

方法一：

1.首先需要把细胞养在玻璃片上悬浮细胞需要用多聚赖氨酸包被过的玻璃

片

2.然后在4％PFA里面室温下固定30分钟;PBS洗两次;0.1% TX-100室温下

作用1－2分钟使细胞膜通透..

3.接下来进行荧光标记;需要在一个大的容器面积大;扁平状的;比如大的

培养皿里面;放一张用水打湿的滤纸;以保持湿度..

4.剪一片合适大小的parafilm;在上面滴上稀释在1％BSA/TBS中的一抗稀

释倍数依具体抗体而定;每个玻璃片30ul足够;把玻璃片盖在上面细胞面朝下;室温下孵育30分钟;然后在PBS里洗三次..

5.接下来二抗孵育步骤同上..

6.最后;在载玻片加上mounting medium大约每个玻璃片加10ul;把玻璃片

放上去细胞面朝下;37度30分钟;然后就可以在荧光显微镜下观察了..

7.抗体很重要;不能有非特异性结合..你可以先做WB检测一下你的抗体;看

看有没有杂带..

8.双标的话;可以把两个一抗一起加或者分别标记两次可以都试一下看看

那种方法合适..如果一个抗体需要二抗;一个是直接荧光标记的;可以把荧光标记的那个和另外一个的二抗一起加..

方法二：

1.选取一抗时要来源于两种不同的动物;我用的是来源于rabbit和rat的

抗体;二抗则是不同荧光信号标记的;我用的是donkey anti-rabbit-FITC绿和donkey anti-rat-Tex-Red红..

2.我的做法是两种一抗同时孵育;然后两种二抗同时孵育..抗体浓度、孵育

时间要仔细摸索;我感觉一抗4度孵育过夜比较好;背景比较清晰..

免疫荧光（Immunofluorescence, IF）实验方法

免疫荧光技术是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。它是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光基团，再用这种荧光抗体（或抗原）作为探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。利用荧光显微镜可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质和定位，以及利用定量技术（比如流式细胞仪）测定含量。

基本实验步骤：

（1）细胞准备。对单层生长细胞，在传代培养时，将细胞接种到预先放置有处理过的盖玻片的培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片，PBS洗两次；对悬浮生长细胞，取对数生长细胞，用PBS离心洗涤（1000rpm,5min）2次，用细胞离心甩片机制备细胞片或直接制备细胞涂片。

（2）固定。根据需要选择适当的固定剂固定细胞。固定完毕后的细胞可置于含叠氮纳的PBS中4℃保存3个月。PBS洗涤3×5 min.

（3）通透。使用交联剂（如多聚甲醛）固定后的细胞，一般需要在加入抗体孵育前，对细胞进行通透处理，以保证抗体能够到达抗原部位。选择通透剂应充分考虑抗原蛋白的性质。通透的时间一般在5-15min.通透后用PBS洗涤3×5 min.

（4）封闭。使用封闭液对细胞进行封闭，时间一般为30min.

（5）一抗结合。室温孵育1h或者4℃过夜。PBST漂洗3次，每次冲洗5min.

（6）二抗结合。间接免疫荧光需要使用二抗。室温避光孵育1h.PBST漂洗3次，每次冲洗5min后，再用蒸馏水漂洗一次。

（7）封片及检测。滴加封片剂一滴，封片，荧光显微镜检查。